专利名称：血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法、应用，是 利用基因重组技术，对血吸虫抗独特型抗体NP30进行改造，将鼠源性抗体的可变区与人IgG, 的CH,、Cic重组，以降低抗独特型抗体的鼠源性成分，用于血吸虫病的免疫保护及急性血吸 虫病的治疗等，本发明涉及基因工程技术和制备免疫治疗药物领域。
背景技术：
血吸虫病是继疟疾之后的全球第二大寄生虫病，据统计，全球有76个国家6亿左右的人 口受血吸虫感染威胁，约有2亿人感染血吸虫，全球每年估计至少有20万人死于血吸虫病， 寄生于人体的血吸虫主要有日本血吸虫，埃及血吸虫和曼氏血吸虫三种。流行于我国的曰本 血吸虫寄生于人体引起的疾病，称为日本血吸虫病。
自1984年iffl0提出"以疾病控制代替以往的传播阻断"新的防治策略以来，建议血吸虫 病防治策略应着眼于人及人的行为，采用以大规模和反复化疗为主的防治措施。安全有效、 价格低廉的吡喹酮的问世使得大规模的化疗成为可能。1992-2001年，世行贷款中国血吸虫 病控制项目中，执行以化疗为主的干预措施。随后的血吸虫病防治规划中，化学药物治疗已 成为传染源控制的一个常规措施。大规模的化疗及灭螺、环境改造等综合措施的实施使得我 国血吸虫病防治取得了显著的成果。但近几年来，由于生物、自然和社会、经济等因素变化 较大，我国血吸虫病疫情回升显著，表现为血吸虫病患病人数增多，急性感染人数呈上升趋 势，局部地区钉螺扩散明显，感染性钉螺分布范围逐渐扩大，部分已经达到传播控制标准和 传播阻断标准的地区疫情严重回升。
吡喹酮，是目前唯一一种可用于治疗埃及血吸虫(最常见的种类)、日本血吸虫、湄公血 吸虫和间插血吸虫以及所谓的次要血吸虫感染的药物。对于曼氏血吸虫感染的治疗，奥沙尼 喹虽然商业上可提供，但是昂贵的价格限制了它的使用，而且不易获得。因此，吡喹酮实际上 是2亿血吸虫感染者唯一可用的药物。理论和实践都强烈提示，任何抗感染化合物实际上不 可避免的都会有药物抵抗现象。如果抗性降低了吡喹酮的有效性,开发一个适当的代替药物将 要花上几年的时间。考虑到每年需要使用几百万剂吡喹酮，这就提高了抗药性发生的危险。 因此，迫切需要寻找开发新的抗血吸虫药物。随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因
组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、 细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。治疗性抗体成热点抗体药物是以细胞工 程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，其在感染、心血管疾病、自身免 疫性疾病、肿瘤治疗中有巨大的潜力与应用前景。当前，治疗性抗体药物研发己成为生物技 术药物领域的热点，而抗体药物作用靶点的选择性、抗体药物的人源化、小型化和高效化也 是今后的研究重点。
Olds根据抗独特型抗体的免疫调节作用，将抗独特型抗体用于曼氏血吸虫急性感染的治 疗，研究结果表明抗独特型抗体可降低急性虫卵肉芽肿反应和急性血吸虫感染的死亡率，提 示抗独特型抗体有可能用于急性血吸虫感染的治疗。NP30为我室管晓虹教授等建立的一株曰 本血吸虫抗独特型抗体，为肠相关抗原(GAA)的内影像抗独特型抗体，其抗体同型为IgM。 对NP30的一系列研究表明NP30对虫卵肉芽肿的形成具有致敏作用，对感染宿主(昆明种小鼠、 C57BL/6小鼠和山羊)具有较好的免疫保护作用(减虫率分别为50. 46%、 41. 67%、 42. 78%); 用NP30主动免疫小鼠具有抗雌虫生殖产卵和抗卵胚发育的双重功效，另外还对血吸虫病肉芽 肿和肝纤维化有明显的负调节作用。结果表明NP30抗独特型抗体是一个非常有应用前景的免 疫保护及治疗用抗体分子。但由于NP30抗独特型抗体为鼠源性单克隆抗体，其自身携带的免 疫原性使得作用于人体时可能会引起人抗鼠免疫反应(HAMA)和过敏反应，且在人体血清中 半衰期很短，易于被清除，这就限制了NP30的体内研究。
发明内容
本发明目的是针对述不足之处提供一种血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制 备方法、应用利用基因重组技术对一株鼠源性的血吸虫抗独特型抗体NP30进行改造，即将鼠 源性单克隆抗体NP30的重链可变区、轻链可变区分别和人IgG抗体的CIi和Cic片段重组，再通 过重叠延伸PCR扩增到一个全长为l. 5kb左右的NP30嵌合Fab抗体片段的核苷酸片段。嵌合Fab 抗体片段的核苷酸片段和原核表达质粒pComb3XSS分别用Sfil限制性内切酶酶切后进行连接， 构建嵌合Fab片段的原核表达载体，转入大肠杆菌T0P10F'后诱导表达嵌合的Fab抗体片段，其 中嵌合Fd段分子量约为30KD，嵌合L链分子量约为26KD，两者通过链间二硫键连接组成嵌合的 Fab抗体片段。该蛋白保持了鼠源性NP30的抗原特异性，可用于血吸虫病免疫保护及急性血吸 虫病的治疗。
血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法是采取以下方案实现 日本血吸虫抗独特型抗体NP30的嵌合Fab抗体片段，即鼠源性抗独特型抗体NP30的重链 和轻链可变区与人IgG,的重链部分恒定区(CH》及轻链恒定区(Cic )进行重组形成的融合 蛋白；鼠源性抗体NP30的轻链可变区与人IgG,的轻链恒定区C K重组的嵌合L链及鼠源性抗
体NP30的重链可变区VH与人IgCTl的CH,重组的嵌合Fd段，两者中间通过前导序列pelB连 接，嵌合Fd段、L链分泌到细菌周质腔时前导序列pelB被剪切，两者通过链间二硫键连接 构成嵌合Fab抗体片段；嵌合L链的氨基酸序列为-
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGinLysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrCysLeuGluLeu
LysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerCysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArg
Gly Glu Cys ;
嵌合Fd段的氨基酸序列为:
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnteuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro
SerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLys
ValAspLysLysAla GluProLysSerCysAspLysThrSerGlyGinAlaGlyGinHisHis
His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 。
应用抗独特型抗体NP30嵌合Fab片段的制备方法采取如下方法和歩骤实现: 1)抗体可变区基因片段的扩增及验证
鼠源性抗独特型抗体NP30杂交瘤细胞培养至对数生长期，Trizol-氯仿-异丙醇法抽提 细胞总RNA;以总RNA中的mRNA为模板，以0ligodLs为引物，反转录扩增获得单链cDNA。
设计鼠源性抗独特型抗体NP30的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的扩增引物，分 别扩增VH 、 VL片段，轻链可变区(VL )的上游引物为VLF : 5 '-GGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC-3', 下 游 引 物 为 VLR : 5'-6^6^Mfi471 6T6^6tOC^ 77T6TTTCAGTTCCAGCTTGGTC03'，在VLF的5'端引入了 Sfil 的酶切识别位点即下划线部分序列，VLR的5'端引入了与人IgG,的C k上游引物5'端互补的 24个碱基即斜体部分序列，以利于NP30的VL与人IgG,的CK片段的重叠PCR扩增；重链可 变区(VH)的上游引物为VHF: 5'-"776^(X^a:A^076^aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3',下 游引物为VHR: 5'-(X47W^Or7T^T6^^7CTGAGGAGACAGTGACTGTGG-3'，在VHF的5'端引入 了和人Igd的Ck下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，V服的5'端引入了和人 Igd的C仏上游引物互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于NP30的VH与人IgG,的CH, 片段的重叠PCR扩增。
分别以反转录扩增的cDNA为模板，用引物VHF、 VHR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的 VH基因片段，用引物VLF、 VLR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的VL基因片段。扩增条件均 为95。C 4分钟；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30个循环；72。C延伸10分钟。琼脂 糖凝胶电泳，胶回收纯化扩增基因片段，VH、 VL PCR胶回收纯化产物分别与pMD-18T载体进 行TA连接。连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue,涂布含氨苄青霉素(100|_ig/ml)、四环素 (30pg/ml)的LB平板，置37'C12-16h。次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37'C摇 菌5小时后分别用VH、 VL基因片段的上下游特异引物对菌液进行PCR鉴定，含有插入VH基 因片段质粒的菌株扩增出一条393bp左右的条带，含有插入VL基因片段质粒的菌株扩增出一 条359bp左右的条带。菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序。其中 VL的核苷酸序列为
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA
VH的核苷酸序列为
CAG GTA CAG CTG GTG GAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AGG ATC TCCTGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA ACT GCT GGA ATG CAG TGG GTG CAA AAG ATG CCA GGA AAG GGT TTG AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA 2)嵌合Fab片段的扩增-
(1) 人IgCn抗体的CH,和ck段的扩增
以质粒pComb3XTT为模板，分别扩增人Igd抗体的Ck和CH,核苷酸片段；Ck段的上游 引物为C k F: 5'-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3'，下游引物为C k R: 5'-GGCCATGGCTGGTTGGGC AGC-3'; L'&的上游引物为 CHF: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下游引物为 CH,R:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。扩增条件均为95°C 4分钟;95°C 30秒,56°C 30秒，72 °C 30秒，30个循环；72°C延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约420bp、 387bp的 条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用；
(2) 嵌合L链、Fd段基因片段的扩增 以鼠源性抗独特型抗体NP30的VL及人IgG,抗体的Cic的PCR扩增产物为模板，用上游
引物LF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下游引物LR: 5'-
GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'进行重叠延伸PCR扩增嵌合L链，扩增条件为95°C， 4分钟；
95°C， 30秒、56°C, 30秒、72°C, 30秒，30个循环；72。C, 10延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳， 扩增出约773bp的条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用。
以鼠源性抗独特型抗体NP30的VH及人IgG,抗体的CH,的PCR扩增产物为模板，用上游
引物FdF: 5'-GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下游引物FdR: 5'-AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'
进行重叠延伸PCR扩增嵌合Fd片段，扩增条件为95。C， 4分钟95。C,30秒、56'C，30秒、 72°C， 30秒，30个循环；72", 10延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，扩增出约738bp的条带， 胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用。
(3) 嵌合Fab基因片段的扩增
以扩增获得的嵌合Fd段和L链核苷酸序列的胶回收纯化产物为模板，用上游引物FabF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和下游引物 FabR:5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'进行重叠延伸PCR扩增，扩增时，先不加引 物，95°C 4分钟；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 90秒，8个循环；而后加入FabF、 FabR 引物后94。C 30秒、56°C 30秒、72°C 90秒，22个循环；72°C延伸10分钟，琼脂糖凝胶
电泳扩增出约1.5kb的条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用； 3)嵌合Fab原核表达载体的构建和鉴定
提取质粒pComb3XSS(本室保存)，质粒及Fab片段的PCR胶回收产物用Sfil限制性内切 酶在50'C酶切12-16h，电泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中。取pComb3XSS、 Fab扩增产物的酶切产物按1: 4摩尔比混匀，在同一离心管内用T4连接酶16'C连接12-16h。
将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10F'，涂布含氨苄青霉素(100吗/ml) LB平板，置 37°C12-16h。次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37'C摇菌5小时后，分别用Fab的 特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab片段质粒的菌株扩增出一条约1. 5kb左 右的条带。菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序，DNA序列分析证 实在重组质粒中含有构建的嵌合Fab片段，序列完全正确，其中横线部分为前导序列pelB， 方框内TAA、 TAG分别为嵌合L链、Fd段翻译终止密码子
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GM GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGT TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG
GGA GAG TGT g TTC TAG ATA ATT AAT TAG GAG GAA TTT AAA ATG AM TAC CTA TTG CCT ACG
GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA G(X ATG GCC CAG GTA CAG CTG GTG GAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AGG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA ACT GCT GGA ATG CAG TGG GTG CAA AAG ATG CCA GGA AAG GGT TTG AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG
GTGACG GTG TCG TGG AAC TCAGGCGCC CTG ACC AGCGGCGTGCACACCTTC CCG GCT GTC CTA
CAGTCC TCA GGA CTC TAC TCCCTCAGC AGC GTG GTGACCGTGCCCTCCAGC AGC TTG GGC ACC
CAGACC TAC ATC TGC AAC GTGAATCAC AAG CCC AGCAACACCAAGGTGGAC AAG AAA GCA GAG
CCCAAA TCT TGT GAC AAA ACTAGTGGC CAG GCC GGCCAGCACCATCACCAT CAC CAT GGC GCA
TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG
构建的重组质粒表达嵌合的L链及Fd段重组的嵌合Fab片段，两者之间前导肽序列pelB 翻译的22个氨基酸连接，翻译的蛋白片段分泌至细菌周质腔时前导肽pelB被剪切，嵌合L
链和Fd段通过链间二硫键连接。嵌合L链的氨基酸序列为-
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGinLysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeu
tysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgG]uAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArg
GlyGluCys
嵌合Fd段的氨基酸序列为
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaVa]LeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gin Ala Gly Gin His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
将含有正确重组质粒的菌液按1: 100转入2ml SB溶液中，氨苄青霉素工作浓度为 100叫/ml，葡萄糖终浓度为4%， 37。C摇菌过夜；过夜的细菌lOOOOg离心15分钟，弃去上清 液，而后用2ml SB重悬，将重悬后的菌液按1: 100转入2mlSB中(氨苄青霉素终浓度为lOOpg /ml), 37。C培养OD600-1. 0左右，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为lmmol/L, 蔗糖终浓度至4%， 23。C振荡培养20h。离心收集菌体，分别处理培养上清、菌体超声上清及 超声沉淀，进行SDS-PAGE及western-blot检测，结果嵌合Fab片段在培养上清、菌体超声 上清及超声沉淀中均有表达，其中可溶性蛋白主要是在菌体超声上清中，Fd段分子量约为 30KD，嵌合L链分子量约为26KD,而对照菌T0P10F'中无目的蛋白条带。
4) 表达蛋白的纯化
细菌大量诱导表达后菌液10000g离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体 积的20mM磷酸盐平衡缓冲液(含0. 5M/L NaCl， 20mM咪唑)，将细菌重悬；而后对菌液进行 超声，超10秒，停10秒，共超90次，而后4。C 12000rpra离心30分钟，弃沉淀，超声上清 用0.22pm滤膜过滤，然后用5ml Histr即HP柱子进行纯化。先用用5倍柱体积的水以 2.5ml/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以2ml/min 的速度上样；用平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积的含50mM、 100 mM、 200 mM、 500raM咪唑的缓冲液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱液。取300pl的洗脱液用冰冻乙醇 进行10倍浓縮，而后进行12%SDS-PAGE电泳，观察蛋白纯化情况。结果含200mm咪唑的洗脱 液中Fab蛋白最纯。将200mm咪唑的洗脱液用10KD的millpore超滤柱子进行除盐浓縮，PBS 洗3次。
5) 嵌合Fab抗体片段的活性鉴定
将纯化的嵌合Fab抗体片段用50mM/L的碳酸盐缓冲液(PH9.6)包板，每孔100ul，终 浓度为5吗/ml 4X:过夜，PBS (含O. 5% Tween20) 5%脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭。双"抗原" 夹心法检测血吸虫病人血清及正常人血清。结果显示，嵌合Fab抗体片段能与血吸虫病人血 清反应，不与正常人血清反应，说明该嵌合Fa b抗体片段保留了鼠源性抗独特型抗体NP30 的模拟抗原性质和特异性。
6) 嵌合Fab抗体片段对急性血吸虫病动物模型的治疗作用
36只BALB/C小鼠随机分为三组，每组12只，雌雄对半。各组小鼠经腹部皮肤感染日本
血吸虫尾蚴40条/只，于感染后33-35天连续给药3天①嵌合Fab抗体片段治疗组每只
小鼠肌肉注射嵌合Fab抗体片段100(Lig/只/次，连续3天给药三次。②阳性对照组以鼠源 性NP30代替嵌合Fab抗体片段，其他处理同嵌合Fab抗体片段治疗组。③阴性对照治疗组 以PBS代替嵌合Fab抗体片段，其他处理同嵌合Fab抗体片段治疗组。观察小鼠死亡情况， 直至感染后第49天。结果小鼠感染后7周，鼠源性抗独特型抗体NP30注射组死亡1只，嵌 合Fab抗体片段治疗组无死亡，而对照组死亡6只，死亡率为50%， Fisher确切概率法显示 嵌合Fab抗体片段治疗组的小鼠死亡率与鼠源性抗独特型抗体NP30治疗组间无显著性差异， 而显著低于PBS对照组，表明嵌合Fab抗体片段保留了鼠源性抗独特型抗体NP30的抗原活性， 有治疗急性血吸虫病的潜力。
利用上述获得的血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段，可以在原核细胞、酵母细
胞、真核细胞中进行重组表达、制备。
血吸虫抗独特型抗体NP30的嵌合Fab抗体片段在制备检测血吸虫抗体、抗原制剂，血吸 虫病免疫保护及免疫治疗药物中的应用。
鉴于NP30为鼠源性的IgM型单克隆抗体，通过基因重组技术，将NP30鼠源性抗体的重链、 轻链可变区和人IgGl抗体的CH,和CK片段进行重组，扩增了嵌合的Fab分子，并构建了嵌合Fab 抗体片段的原核表达质粒并进行可溶性表达，建立了表达蛋白的纯化方法，获得了高纯度的 可溶性蛋白，并开展动物试验用于急性血吸虫病的治疗。
本发明与现有技术相比具有的优点
我国血吸虫病防治工作中，主要是应用吡喹酮进行化疗，青蒿类药物由于价格较贵等原 因限制了其在现场的应用。长期反复广泛的使用吡喹酮，在一定程度上增加了其产生耐药性 的危险，而开发一个适当的代替药物将要花上几年的时间，因此迫切需要研发新的药物作为 吡喹酮的补充或替代品。随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、 生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，
使得生物技术药物研发高潮迭起。治疗性抗体是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗 体工程技术制备的药物，以其特异性强、安全有效而成为当前生物技术药物研发的热点。本 发明制备的血吸虫抗独特型抗体NP30，通过试验表明具有治疗急性血吸虫病的潜力。为将来 进行体内研究，使用基因重组技术对该抗独特型抗体进行改造制备嵌合Fab抗体片段，制备 的抗体片段有以下优点
(1) 大大降低了抗独特型抗体NP30的鼠源性成分，有利于进一步开展体内试验。
(2) 保留了鼠源性抗体的模拟抗原特性，可用表达的蛋白和酶标的鼠源性抗体NP30组成双
"抗原"夹心法诊断血吸虫病。
(3) 原核表达载体易于构建，可大量表达，生产快速且便于纯化。
(4) 有利于改造成嵌合的全分子抗体或其他形式的抗体片段，进一步降低抗独特型抗体中 的鼠源成分以开展治疗血吸虫病的相关研究。
以下将结合附图对本发明作进一步说明
图1:嵌合Fab抗体片段原核表达载体构建示意图。
图2:鼠源性单克隆抗体NP30杂交瘤细胞总RNA电泳结果，显示RNA抽提较好，没有 发生降解。
图3:鼠源性单克隆抗体NP30重链可变区(VH)及轻链可变区(VL) PCR扩增产物电泳。 Ml:核酸标准分子量(Takara lOObp Ladder); 1: VL基因片段；2: VH基因片段；M2: 核酸标准分子量(Takara DL2000)。
图4:以pComb3XTT为模板扩增的人Ig&的轻链恒定区(CK)及重链恒定区1 (CH,)片 段电泳结果。Ml:核酸标准分子量(Takara DL2000); h 420bp的Ck基因片段；2: 387bp 的CH,基因片段；M2:核酸标准分子量(Takara lOObp Ladder)。
图5:嵌合Fd段及L链扩增产物的电泳结果。Ml:核酸标准分子量(Takara lOObp Ladder); 1: 773bp的L基因片段；2: 738bp的Fd基因片段；M2:核酸标准分子量(Takara DL2000)。
图6:嵌合Fab扩增产物的电泳结果。Ml:核酸标准分子量(Takara lOObp Ladder); 1: Fab基因片段；M2:核酸标准分子量(Takara DL2000)。
图7:嵌合Fab纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果，M为蛋白质标准(Fermentas， SSM0441), l为纯化的嵌合Fab抗体片段。
具体实施例方式
血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法、应用
抗独特型抗体嵌合Fab抗体片段基因序列的合成、原核表达载体的构建及鉴定
材料与方法
1、 细胞株、菌株与质粒NP30杂交瘤细胞、宿主菌XLl-blue、 T0P10F'、质粒pComb3XSS、 pComb3XTT、载体pMD18-T (Takara)
2、 分子生物学试剂M-MLV逆转录酶(p，ega)、 rTaq (Takara)、 ExTaq酶(Takara)、 T4
连接酶、质粒纯化试剂盒(Takara)、琼脂糖凝胶回收试剂盒(Qiagen)、 Sfil内切酶(Biolab)。 其他试剂为进口或国产分析纯试剂。
3、 引物合成南京金思特公司帮助合成
4、 基因重组技术脂A的抽提、cDNA的合成、PCR、 DNA、质粒的酶切、连接、电泳；质粒的 提取、转化按一般分子克隆常规方法进行。
5、 DNA序列分析PCR验证正确的菌液送金思特公司测序，测序结果用DNAstar及DNAclub 软件进行分析。
结果
1、抗体可变区的扩增及验证
(1) cDNA的合成:
NP30杂交瘤细胞培养至对数生长期，Trizol法抽提细胞总RNA，置于一80。C保存备用， 凝胶电泳鉴定RNA抽提质量。以oligodT,s为引物，抽提的RNA为模板，进行逆转录合成cDNA。 反应条件为总RNA 2ul、 oligodT15 2ul、 DEPC处理过的水22 u 1，混匀后7(TC水浴5分 钟，立即置冰浴中5分钟，而后管中加入5XM-MLV bufferlOix 1、 dNTP10yl 、 RNAi2yl 、 M-MLV2ul，混匀后42。C温育1小时，94°C5分钟，而后取出置-2CTC。
(2) 轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)的扩增及鉴定 设计鼠源性抗独特型抗体NP30的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的扩增引物，分
别扩增VH、 VL片段，轻链可变区(VL)的上游引物为VLF: 5'-GGGCCCAGGCGG
Q^GAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC-3'，下游引物为VLR: 5'-fi^WC力W7^;rft:
^7(X4C46T7T6TTTCAGTTCCAGCTTGGTCC-3'，在VLF的5'端引入了 Sfil的酶切识别位点即下划
线部分序列，VLR的5'端引入了与人Ig^的C k上游引物5'端互补的24个碱基即斜体部分序
列，以利于NP30的VL与人IgG,的ck片段的重叠PCR扩增；重链可变区(VH)的上游引物
为VHF: 5'-"77( a:C^<X^aMr6^aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3'， 下游引物为V服5'-0^7^^ar7T^T6^^rrGAGGAGACAGTGACTGTGG-3'，在VHF的5'端引入了和人IgG,的C k
下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，V服的5'端引入了和人IgG:的CH,上游引物
互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于NP30的VH与人IgG,的CHi片段的重叠PCR扩增
分别以反转录扩增的cDNA为模板，用引物VLF、 VLR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的
VL基因片段，用引物VHF、 VHR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的VH基因片段。扩增体系为
50nl: 10 X buffer 5^1 ， 2. 5mM/L dNTP 4 u 1 、 2. 5raM/L MgCl2 3 P 1 、 cDNA 2pl， VLF/VLR (VHF/VHR)
各lpl， rTaq酶0.5nl，去离子水33.5nl。扩增条件均为95°C 4分钟；95°C 30秒、56°C 30
秒、72°C 30秒，30个循环；72'C延伸IO分钟。琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化扩增基因片段， VL、VH的胶回收纯化产物分别与pMD-18T载体进行TA连接。连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue， 涂布含氨苄青霉素(100ng/nil)、四环素(30吗/ml)的LB平板，置37°C12-16h。次日通过 抗性筛选、蓝白斑筛选以及菌液PCR，筛选含有插入VL基因片段质粒的菌株(PCR扩增出一 条359bp左右的条带)、含有插入VH基因片段质粒的菌株(PCR扩增出一条393bp左右的条 带)送生物公司进行测序。其中VL的核苷酸序列为
GAG AAT CTG CTC ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACC ATG
ACC TGC AGT GCC AGCTCAAGTGTTAGTTACGTTTACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGATCC TCC
CCC AGA CTC CTG ATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGT GGC
AGT GGG TCT GGG ACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCC ACT
TAT TAC TGC CAG CAGTGGACTAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAA CTG
AAA
VH的核苷酸序列为-.
CAG GTA CAG CTG GTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAGGATC TCC
TGC AAG GCT TCT GGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATGCAGTGGGTGCAAAAGATGCCA GGA
AAG GGT TTG AAG TGGATTGGCTGGATAAACACCCACTCTGGAGTGCCAAAATATGCAGAA GAC
TTC AAG GGA CGG TTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCATATTTACAGATA AGC
AAC CTC AAA AAT GAGGACACGGCTACGTATTTCTGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATG GAC
TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA
将含有正确VL、 VH序列的重组体菌液按1: 100转入3mlLB液体培养基中，37'C培养12-16h; 用Takara公司的Minibest plasmid purification Kit抽提质粒，超纯水溶解，-20。C保存。
(3)抗独特型抗体嵌合Fab抗体片段的核苷酸序列扩增 ①人IgG,抗体的C k和CH,基因片段的扩增
以质粒pComb3XTT为模板，分别扩增人IgGt抗体的CH,和Ck核苷酸片段；Ck段的上游 引物为C k F: 5'-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3',下游引物为C k R: 5'-GGCCATGGCTGGTT GGGCAGC-3'; 的上游引物为CH,F: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下游引物为 CH!R:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。扩增体系为50^1: 10Xbuffer 5pl， 2. 5mM/L dNTP 4ul、 2. 5mM/L MgCl2 3p1、 pComb3XTT 2}il, C k F/Ck R(CH,F/師)各lpl， ExTaq酶0. 5^1，去离
子水33. 5口1。扩增条件均为95。C 4分钟；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30个循环；
72'C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出一条约420bp、 387bp的条带，胶回收纯化
扩增的CK、 CH,基因片段，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用。
② 嵌合L链和Fd段基因片段的扩增
以鼠源性抗独特型抗体NP30的VL及人IgG,抗体的C k的胶回收纯化扩增产物为模板，
用上游引物LF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下游引物LR:
5' - GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'进行重叠PCR扩增嵌合L链；以鼠源性抗独特型抗体NP30
的VH及人IgG,抗体的CHt的胶回收纯化扩增产物为模板，用上游引物FdF:
5'-GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下游引物FdR: 5'-AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'进行重叠
PCR扩增嵌合Fd片段。扩增体系均为50|iil: 10X buffer 5^1， 2. 5raM/L dNTP4u 1、2. 5mM/L MgCl2 3ii 1、 pMD18-T-VL l)iil, CK纯化产物1^1 ， LF、 LR引物各1^1， ExTaq酶0. 5pl,去离子水
33.5口1。扩增条件为95°C 4分钟；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30个循环；72 。C延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约773bp (嵌合L链)、738bp(嵌合Fd段)的 条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-2(TC冻存备用；
③ 嵌合Fab的扩增
以扩增胶回收纯化的嵌合L链和Fd段的基因片段为模板，用上游引物FabF: 5'-GAGGAG GAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和 下 游 引 物 FabR:
5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'进行重叠延伸PCR扩增，扩增体系为50pl: 10Xbuffer 5卩1， 2. 5mM/LdNTP 4ul、 2. 5mM/L MgCl2 3ul、 L链基因片段lpl， Fd段基因
产物lpl , FabF、 FabR引物各l卩l， LATaq酶0. 5pl,去离子水33. 5pl。扩增时，先不加引
物，95'C, 4分钟；95。C,30秒、45。C,30秒、72°C， 90秒，8个循环，而后加入FabF、 FabR 引物后95。C,30秒、56。C，30秒、72°C, 90秒，共22个循环；72°C，延伸10分钟。琼脂糖 凝胶电泳，扩增出一条约1.5kb的条带，胶回收扩增条带，溶于去离子水内，-20'C冻存备用。
(4)嵌合Fab原核表达载体的构建及鉴定
提取质粒pComb3XSS (本室保存)，质粒及Fab片段的PCR胶回收产物用Sfil限制性内切 酶在50。C酶切12-16h，电泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中。取pComb3XSS、 Fab扩增产物的酶切产物按1: 4摩尔比混匀，在同一离心管内用T4连接酶16'C连接12-16h。
将连接产物转化感受态大肠杆菌T0P10F'，涂布含氨苄青霉素(100|_ig/ml) LB平板，置 37°C]2-16h。次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37'C摇菌5小时后，分别用Fab的 特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab抗体片段核苷酸序列的质粒的菌株扩增 出一条约1. 5kp左右的条带。菌液PCR验证扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序， DM序列分析证实在重组质粒中含有构建的嵌合Fab抗体片段的核苷酸序列，其中横线部分 为前导序列pelB，方框内TAA、 TAG分别为嵌合L链、Fd段翻译终止密码子
GAGAATCTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATG
ACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACGTTTACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGATCCTCC
CCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACT
TATTACTGCCAGCAGTGGACTAG丁TACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAACTG
AAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG
AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG
GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA
GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGACTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG
GGAGAGTGT岡TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACG
GCAGCCGCTGGA TTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAG
TCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAGGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTAT
ACCTTCACAACTGCTGGAATGCAGTGGGTGCAAAAGATGCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATT
GGCTGGATAAACACCCACTCTGGAGTGCCAAAATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCC
TTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCATATTTACAGATAAGCAACCTCAAAAATGAGGAC
ACGGCTACGTATTTCTGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC
ACAGTCACTGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC
AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA
CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC
CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAG
CCCAAATCTTGTGACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCA
TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG
抗独特型抗体嵌合Fab抗体片段的表达、鉴定及纯化
材料与方法
1、 菌株与质粒宿主菌T0P10F'、质粒pComb3XSS-Fab
2、 试剂和耗材咪唑(Sigma) , HisTrap纯化柱(法玛尼亚)，PMSF、异丙基-B-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素、蔗糖、葡萄糖以及其他试剂为进口或国产分析纯试剂，ELISA96 孔酶标板(costar)、 HRP-NP30(本实验室自制)。
3、 蛋白的表达和纯化质粒的提取、转化、诱导表达及SDS-PAGE、 western-blot按一般分 子克隆常规方法进行。
4、 活性鉴定采用双"抗原"夹心法检测血吸虫病人血清。 结果
1、小量表达及鉴定
将含有正确重组质粒的菌液按1: 100转入2ml SB溶液中，并设空质粒菌对照，氨苄青 霉素工作浓度为100|ag/ml，葡萄糖终浓度为4%， 37度摇菌过夜；过夜的细菌10000g离心15 分钟，弃去上清液，而后用2ml SB重悬，将重悬后的菌液按l: 100转入2mlSB中(氨苄青 霉素终浓度为IOO叫/ml )， 37度培养OD600=1. 0左右，加入异丙基-B -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 至终浓度为lmmol/L，蔗糖终浓度至4%， 23度振荡培养20h。
离心收集菌体，培养上清各取30nl于2个新的Eppendorf管中，其余上清弃去。细菌沉 淀溶于100nl PBS (PH 7.4)中，重悬菌体，而后进行冰浴超声，1200rpm 4'C离心15分钟， 各取30^1于新的Eppendorf管中，其余上清弃去，沉淀加60nl PBS (PH 7.4)重悬后分装 成2管。而后每管加lOpl 4X loading buffer,混匀后IO(TC煮沸5分钟。上样，进行SDS-PAGE 电泳， 一块胶染色， 一块胶做western-blot检测。SDS-PAGE电泳中，培养液上清、超声上 清、沉淀中均有相应条带表达，但与空白菌无显著差异。做western-blot时，先300mA电转 印70分沐然后用含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液(含Tween-20 0. 1%)室温下封闭lh，弃去封 闭液，加入1: 2000稀释的HRP-羊抗人IgG(Fab特异性的)，室温下孵育lh。而后PBS(Tween-20 0. 1%)洗3次，每次5分钟。而后加DAB显色液显色，结果在培养上清、菌体超声上清及超 声沉淀中均有2个条带，嵌合Fd段分子量约为30KD，嵌合L链分子量约为26KD。培养液上 清及菌体超声上清为可溶性表达蛋白，超声沉淀中为包涵体。空白质粒对照菌中无条带表达。
构建的重组质粒在大肠杆菌T0P10F'中翻译，L链和Fd段之间的前导序列翻译的信号肽 pelB在转入细菌周质腔时被剪切，表达的嵌合L链和Fd段通过链间二硫键连接组成抗独特
型抗体NP30的嵌合Fab抗体片段。嵌合L链的氨基酸序列为:
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGintysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluCeu
LysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrtysSerPheAsnArg
GlyGluCys
嵌合Fd.段的氨基酸序列为
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro
SerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLys
ValAspLysLysAla GluProLysSerCysAspLysThrSerGlyGinAlaGlyGinHisHis
H丄sHisHisHisGly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
2、大量表达及纯化
细菌大量诱导表达后菌液lOOOOg离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体 积的20mM磷酸盐平衡缓冲液(含0.5M/L NaCl,20mM咪唑)，将细菌重悬；而后对菌液进行 超声，超10秒，停10秒，共超90次，而后4。C 12000rpm离心30分钟，弃沉淀，超声上清 用0.22,滤膜过滤，然后用5ml Histrap HP柱子进行纯化。先用用5倍柱体积的水以 2.5ml/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以2ml/min
的速度上样；用平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积终浓度为50mM/L、 100Mm/L、 200 mM/L、 500函/L咪唑的缓沖液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱液。取300nl的洗脱 液用冰冻乙醇进行10倍浓缩，而后进行12%SDS-PAGE电泳，观察蛋白纯化情况。结果含200mm 咪唑的洗脱液中嵌合Fab抗体片段最纯。将含200mM/L咪唑的洗脱液用10KD的超滤管进行除 盐浓縮，PBS洗3次。
3、嵌合Fab抗体片段的活性鉴定
将纯化的嵌合Fab抗体片段按5ing/ml用50mM的碳酸盐缓冲液(PH9. 6)包板，鼠源性抗 独特型抗体NP30做对照，每孔10(^1， 4'C包板过夜；而后每孔加入20(^1含5%脱脂牛奶PBST 缓冲液，37。C封闭2h;甩去孔中液体，PBST(Tween-20: 0.05%)洗4次。3份血吸虫病人血清 分别用PBST按1: 100稀释，每孔加入100pl稀释血清(设复孔)，并设正常人血清、PBST 空白对照。37。C孵育30分钟，甩去血清，PBST洗4遍，加入本室自制的10(^1 HRP标记的 NP30,而后37。C孵育30分钟。甩去酶标抗体，PBST洗4遍，每孔加TMB50pl、 HA50pl，室 温下反应15分钟，每孔加21\0^045(^1终止反应。酶标仪测定A450。嵌合Fab抗体片段能与 血吸虫病人血清反应，不与正常人血清反应，说明该嵌合Fab抗体片段保留了鼠源性单克隆 抗体的模拟抗原性质和特异性(检测的OD值见下表)。
1 2 3 4 5 6
0.243 0.086 0.097 0.664 0.460 0.564
0.256 0. 120 0. 139 0.734 0.368 0.548
0.152 0.067 0.133 0.920 0.635 0.839 NP30 0.170 0.055 0.114 0.871 0.700 0.691
*其中1-3为正常人血清，4-6为血吸虫病人血清。 嵌合Fab抗体片段对急性血吸虫感染动物模型的治疗作用
材料与方法
1、蛋白NP30杂交瘤细胞培养上清，饱和硫酸铵沉淀后，透析除盐；NP30嵌合抗体Fab段 可溶性表达用Histr邻HP进行纯化，分光光度计法测定蛋白浓度后-7CTC保存备用。
嵌合Fab 抗体片 段
2、试验动物及分组取36只BALB/C小鼠，6-7周龄，随机分为三组，雌雄各半。每只小 鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40条，于感染后33-35天连续给药3天 ①嵌合Fab抗体片段治疗组每只小鼠肌肉注射嵌合Fab抗体片段100吗/只/次，连续3天 给药三次。②鼠源性抗独特型抗体NP30对照组以鼠源性NP30代替嵌合Fab抗体片段，其 他处理同嵌合Fab抗体片段治疗组。③PBS对照组以PBS代替嵌合Fab抗体片段，其他处 理同嵌合Fab抗体片段治疗组。
3、治疗效果观察抗体注射后观察小鼠死亡情况，直至感染后第49天。 结果
PBS对照组在感染后第43天即抗体注射后10天开始死亡，43、 44天死亡比较集中，死 亡率为41.7%,而鼠源性抗独特型抗体NP30、嵌合抗体Fab抗体片段治疗组均未出现死亡。 抗体注射后2周，鼠源性抗独特型抗体NP30组小鼠死亡1只，嵌合Fab抗体片段治疗组未出 现死亡。Fisher确切概率法显示鼠源性抗独特型抗体NP30治疗组、嵌合Fab抗体片段治疗 组的死亡率显著低于PBS对照组(/<0.05)。结果提示，嵌合Fab抗体片段有延长急性血吸虫 病小鼠寿命的潜力。
血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段核苷酸及蛋白序列表 〈110〉南京医科大学
〈120〉血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法、应用
<160> 3
〈210> 1 <211〉 1482 <212〉廳 <213〉人工序列
<220>
<221〉 V一region 〈222〉 〈1》.-〈318>
〈223>鼠源性抗独特型抗体轻链可变区基因片段序列。 <220〉
<221〉 C一region <222> 〈319》..<639>
<223>人抗体IgGl轻链恒定区CK基因片段序列。 <220>
<221> mis-feature
<222〉 〈639》'.<642>
〈223〉轻链基因片段翻译的终止密码子。
<220〉
<221〉 mis-feature <222> 〈642》'.<672>
<223〉嵌合Fab片段轻链和Fd基因片段重叠延伸扩增的核苷酸序列，含核糖体结合位点。 <220〉
<221〉 mis-feature <222〉 <672》"<738>
〈'223〉为使NP30嵌合Fab中Fd段可溶性表达增加的pelB信号肽序列，将在蛋白分泌至周质 腔时被剪切。
〈220〉
〈221> V—region
<222〉 <739》.'<1089>
〈223〉鼠源性抗独特型抗体NP30重链可变区VH基因片段序列 <220〉
〈221〉 C一region <222〉 <1090》"〈1410〉
<223>人抗体IgGl轻链恒定区CH1基因片段序列。 <220>
<221> mis-feature 〈222〉 <1411》.'<1423>
<223>连接嵌合Fab抗体片段基因和载体pComb3XSS的Sfil酶切位点。 <220>
<221> mis-feature
<222> 〈1423》..<1479>
〈223>载体pComb3XSS上序列，含His标签。
<220>
<221> mis-feature
<222> 〈1480〉…〈1482〉
<223>载体pComb3XSS上的琥珀酸终止子。
〈德1
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG MG GTC ACC 60
Glu Asn Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr 15 10 15 20
ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG MG CCA GGA 120
Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly
25 30 35 40
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC MC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC 180
Ser Se上'Pro Arg [>eu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
45 50 55 60
TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA 240
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG 300
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
85 90 95 100
ACCAAGCTGGMCTGAAACGA ACTGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT360
ThrLysLeuGluLeu 105LysArg ThrValAla 110AlaProSerValPhe 115liePheProProSer 120
GATGAGCAGTTGAMTCTGGA ACTGCCTCTGTTGTCTCCCTGCTGAATAACTTCTATCCC420
AspGluGinLeuLys 125SerGly ThrAlaSer 130ValValCysLeuLeu 135AsnAsnPheTyrPro 140
AGAGAGGCCAMGTACAGTGG MGGTG GATMCGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG480
ArgGluAlaLysVal M5GinTrp LysValAsp 150AsnAlaLeuGinSer 155GlyAsnSerGinGlu 160
AGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGC虹TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG540
SerValThrGluG]n 165AspSer LysAspSer ]70ThrTyrSerLeuSer 175SerThrLeuThrLeu 180
AGCAMGCAGACTACGAGAAA CACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTC600
SerLysAlaAspTyr 185GluLys HisLysVal 190TyrAlaCysGluVal 195ThrHisGinGlyLeu 200
AGTTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCMCAGGGGAGAGTGTTAATTCTAGATAATTAATTAG660
SerSerProValThr 205LysSer PheAsnArg 210GlyGluCys
GAGGMTTTAAAATGAMTAC CTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCT720
MetLysTyr LeuLeuProThrAlaAlaAlaGlyLeuLeuLeuLeuAla
GCCCMCCAGCCATGGCCCAG GTACAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGMGAAGCCT780
AlaGinProAlaMetAlaGin Val 1GinLeuVal 5GluSerGlyProGlu 10LeuLysLysPro
GGAGAGACAGTCAGGA丁CTCC TGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATG840
GlyGluThrValArglieSer CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMet
15202530
CAGTGGGTGCMAAGATGCCA GGAAAGGGTTTGMGTGGATTGGCTGGATAAACACCCAC900
GinTrpValGinLysMetPro GlyLysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHis
35404550
TCTGGAGTGCCAAMTATGCA GAAGACTTCMGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACC960
SerGlyValProLysTyrAla GluAspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThr
55606570
TCTGCCAGCACTGCATATTTA CAGATAAGCMCCTCAAAAATGAGGACACGGCTACGTAT1020
SerAlaSerThrAlaTyrLeu GinlieSerAsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyr
75808590
TTCTGTGCGAGATCAAGGGAC TATGCTATGGACTACTGGGGTCMGGAACCACAGTCACT調
PheCysAlaSerArgAsp TyrAlaMetAspTyrTrpGlyGinGlyThrThrValThr
95100105110
GTCTCCTCAGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC1140
VaA Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 115 120 125 130
ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG 1200 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 135 140 145 150
ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA 1260 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 155 160 165 170
CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC 1320 Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Scr Ser Ser Leu Gly 175 180 185 190
ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA 1380 Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 195 200 205 210
GCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT AGT GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC 1440 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gin Ala Gly Gin His His His His His 215 220 225 230
CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG 1482 His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 235 240 245
<210〉 2 <211> 213 <212> PRT <213〉人工序列
<220>
<223〉抗独特型抗体NP30的嵌合轻链，即抗独特型抗体NP30的轻链可变区与人IgGl的恒定 区(Cic)重组后形成的融合蛋白，全长213个氨基酸。
<400〉 2
Glu Asn Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro
15 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu
35 40 45
Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Arg Met Glu Thr Ser Tyr Lys Arg Thr Asp Glu Gin Asn Asn Phe Tyr
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie
65 70 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin
80 85 Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
Cys Gin Lys Leu
Glu
95 100 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro
Asn Ala Leu Gin
Asp Ser Lys Ser Lys Ala Thr His Gin
110
Leu Lys Ser 125 Pro 140 Ser 155 Ser 170 Tyr 185 Leu 200
Asp Asp Gly
Arg Gly Thr Glu
115
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 130
Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 145
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu
Tyr Ser Lys His
160
Leu Ser Ser Thr Leu Thr
Lys
Ser Ser Pro Val
175 Val 190 Thr 205
Tyr Lys
Ala Cys Glu
Ser Phe Asn
Ser
75
Trp
90
Leu
105
Ser
120
Leu
135
Asp
150
Gin
165
Leu
180
Val
195
Arg
210
Gly Glu Cys 213
<210> 3 <211> 247 <212> PRT 〈213>人工序列
<220〉
<223〉抗独特型抗体NP30的嵌合Fd段， 链恒定区的CH1重组后形成的融合蛋白，全长247个氨基酸。
即抗独特型抗体NP30的重链可变区与人IgGl的重
<40。> 3
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
15 10 15
Glu Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Thr Ala Gly Met Gin Trp Val Gin Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Trp lie Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys 丁yr
50 Lys 65 Tyr 80 Phe 95 Gly 110 Val 125 Ala 140 Thr 155 Phe 170 Val 185 Cys 200 Ala 215 His 230 Tyr 245
Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser
65 70 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Asn Leu
80 85 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser
170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro
Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser 215
Gin Ala Gly Gin His His His His His Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
55 Phe 70 Asn 85 Arg 100 Val 115 Pro 130 Cys Leu Val 145
Asn Ser Gly 160 Gin 175 Ser 190 Lys 205 Cys 220 His 235
Asp Gly
60
Leu Glu Thr Ser 75
Lys Asn Glu Asp 90
Tyr Ala Met Asp 105
Ser Ala Ser Thr 120
Ser Lys Ser Thr 135
Lys Asp Tyr Phe 150
Ala Leu Thr Ser 165
Ser Gly Leu Tyr 180
Ser Leu Gly Thr 195
Ser Asn Thr Lys 210
Lys Thr Ser Gly 225
Ala Tyr Pro Tyr 240
权利要求
1、日本血吸虫抗独特型抗体NP30的嵌合Fab抗体片段，即鼠源性抗独特型抗体NP30的重链和轻链可变区与人IgG1的重链部分恒定区(CH1)及轻链恒定区(Cκ)进行重组形成的融合蛋白；鼠源性抗体NP30的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区Cκ重组的嵌合L链及鼠源性抗体NP30的重链可变区VH与人IgG1的CH1重组的嵌合Fd段，两者中间通过前导序列pelB连接，嵌合Fd段、L链分泌到细菌周质腔时前导序列pelB被剪切，两者通过链间二硫键连接构成嵌合Fab抗体片段；嵌合L链的氨基酸序列为Glu Asn Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr MetThr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Ser SerPro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser GlySer Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala ThrTyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys SerGly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln TrpLys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser LysAsp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His LysVal Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn ArgGly Glu Cys；嵌合Fd段的氨基酸序列为Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile SerCys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu AspPhe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile SerAsn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhePro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val HisThr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val ProSer Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His HisHis His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser。
2、权利要求l所述的日本血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段的制备方法，该 抗体片段是利用基因工程技术制备，具体方法如下1) 抗体可变区的基因扩增及验证鼠源性抗独特型抗体NP30杂交瘤细胞培养至对数生长期，Trizol-氯仿-异丙醇法抽提 细胞总RNA;以总RNA中的mRNA为模板，以oligodT's为引物，反转录扩增获得单链cDNA， 设计鼠源性抗独特型抗体NP30的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)的扩增引物，分别扩 增VH、 VL片段，轻链可变区(VL)的上游引物为VLF: 5'-GGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTGCTCA CCCAGTCTCC-3'，下游引物为VLR: 5'-C"/WW6^WrW 7a^ffa7力C^77T6TTTCAGTTCCAGCTTG GTCC-3'，在VLF的5'端引入了 Sfil的酶切识别位点即下划线部分序列，VLR的5'端引入 了与人lgG,的C k上游引物5'端互补的24个碱基即斜体部分序列，以利于NP30的VL与人 IgG,的CK片段的重叠PCR扩增；重链可变区(VH)的上游引物为VHF: 5'-6tT(XCa^OftX47^( aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3', 下游引物为VHR : 5'-fl^7W^ar7T6ttTft^6KCTGAGGAGACAGTGACTGTGG-3',在VHF的5'端引入了和人IgG,的C k下游引物互补的21个碱基序列即斜体部分序列，VHR的5'端引入了和人IgG,的CR上游 引物互补的21个碱基序列，即斜体部分，以利于NP30的VH与人IgG,的CH,片段的重叠PCR 扩增；分别以反转录扩增的cDNA为模板，用引物VHF、 VHR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的 VH片段，用引物VLF、 VLR扩增鼠源性抗独特型抗体NP30的VL片段；扩增条件均为95'C 4 分钟；95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 30秒，30个循环；72'C延伸10分钟，琼脂糖凝胶电 泳，胶回收纯化扩增基因片段，胶回收产物分别与pMD-18T进行TA连接，然后转化大肠杆菌 XL1-Blue,筛选PCR扩增出大小正确条带的菌液送生物公司进行测序，序列完全正确，抽提 含有正确插入序列的重组质粒；2) 嵌合Fab片段的基因扩增(1)人IgG,抗体的CH,和Ctc段的扩增以质粒pComb3XTT为模板，分别扩增人IgG,抗体的CH,和Ck核苷酸片段；Ck段的上游 弓I物为C k F: 5' -CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3'，下游引物为C k R: 5' -GGCCATGGCTGGTTGG GCAGC-3' ; CH,的上游引物为Cf^F: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下游引物为 CHR:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3';扩增条件均为95。C 4分钟;95°C 30秒，56'C 30秒,72 °C 30秒，30个循环；72°C延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约420bp、 387bp的 条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-20'C冻存备用；(2) 嵌合Fd段和L链的基因扩增以鼠源性抗独特型抗体NP30的VL及人IgG,抗体的Ck的胶回收纯化扩增产物为模板， 用上游引物LF: 5' -GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下游引物LR: 5'- GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'进行重叠PCR扩增嵌合L链；以鼠源性抗独特型抗体NP30 的VH及人IgG,抗体的CH,的胶回收纯化扩增产物为模板，用上游引物FdF: 5' -GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下游引物FdR: 5' -AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'进行重叠 PCR扩增嵌合Fd片段，扩增条件为95。C 4分钟；95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 30秒，30 个循环；72'C延伸10分钟，琼脂糖凝胶电泳，分别扩增出约773bp、 738bp的条带，胶回收 扩增条带，溶于去离子水内，-2(rc冻存备用；(3) 嵌合Fab片段的基因扩增以扩增获得的嵌合Fd段和L链核苷酸序列的胶回收纯化产物为模板，用上游引物FabF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和下游引物 FabR:5: GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'进行重叠延伸PCR扩增，扩增时，先不加引 物，95°C 4分钟；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 90秒，8个循环；而后加入FabF、 FabR 引物后94 °C 30秒、56°C 30秒、72 °C 90秒，22个循环；72°C延伸10分钟，琼脂糖凝胶 电泳扩增出约1.5kb的条带，胶回收纯化扩增条带，溶于去离子水内，-2CTC冻存备用； 3)嵌合Fab片段原核表达载体的构建和鉴定pComb3XSS质粒、Fab胶回收纯化片段分别用Sfil限制性内切酶在5(TC酶切12-16h，电 泳后胶回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水中，pComb3XSS质粒、Fab酶切产物在同一离心 管内用T4连接酶16度连接12-16h;将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10F'，涂布含氨苄青霉素终浓度为lOOtig/rnl的LB 平板，置37'C12-16h，次日随机挑取转化菌及空质粒转化对照菌，37t:摇菌5小时后，分别 用Fab的特异引物对对菌液进行PCR扩增鉴定，含有插入Fab片段质粒的菌株扩增出一条约 1.5kb的条带；提取含嵌合Fab片段核苷酸序列的质粒进行DNA序列分析，证实在重组质粒 中含有构建的嵌合Fab片段，序列完全正确，其中横线部分为前导序列pelB，方框内TAA、 TAG分别为嵌合L链、Fd段翻译终止密码子GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGCTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGAT GCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACC AAGCTGGAACTGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGT TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTTCTAGATAATTAATTAGGAG GAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCC CAACCAGCCATG GCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGA GAGACAGTCAGGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATGCAG TGGGTGCAAAAGATGCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATTGGCTGGATAAACACCCACTCT GGAGTGCCAAAATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCT GCCAGCACTGCATATTTACAGATAAGCAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACGTATTTC TGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACAGTCACTGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAG TCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCA GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCAT GGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCT岡构建的重组质粒表达嵌合的L链及Fd段重组的嵌合Fab抗体片段，两者之间有前导肽pelB的 22个氨基酸连接，这22个氨基酸在嵌合Fab片段分泌至细菌周质腔时被剪切，嵌合L链和 Fd段通过链间二硫键连接；4)表达嵌合Fab细菌的筛选鉴定及表达蛋白的纯化将含有正确重组质粒的菌液按1: 100转入2ml SB溶液中，氨苄青霉素工作浓度为 100l^g/ml，葡萄糖终浓度为4%， 37。C摇菌过夜；过夜的细菌10000g离心15分钟，弃去上清 液，而后用2ml SB重悬，将重悬后的菌液按1: 100转入2ml含氨苄青霉素终浓度为100M>g Ail 的SB培养基中，37t培养0D600=1. 0左右，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，蔗糖终浓度至4%,23'C振荡培养20h,离心收集菌体，分别处理培养上清、菌体超声上清及超声沉淀，进行 SDS-PAGE及western-blot检测，嵌合Fab片段在培养上清、菌体超声上清及超声沉淀中均 有表达，其中可溶性蛋白主要是在菌体超声上清中，Fd段分子量约为30KD， L链分子量约为 26KD,而对照菌T0P10F'中无目的蛋白条带；大量诱导培养的菌液，10000g离心15分钟，弃培养上清，沉淀中加入原菌液1/10体积 的20mM磷酸盐平衡缓冲液，其中NaCl终浓度为0. 5M/L,咪唑终浓度为20Mm/L，将细菌重悬 后进行超声，超10秒，停10秒，共超90次，而后4。C 12000rpni离心30分钟，超声上清用 0.22um滤膜过滤，然后用5ml Histrap HP柱子在Akta系统上进行纯化，用5倍柱体积的水 以2. 5ml/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，然后以2ml/min 的速度上样，平衡缓冲液平衡镍柱至基线，分别用5倍柱体积的含50mM、 100 mM、 200 mM、 300mM、 500mM， 1M咪唑的缓冲液洗柱子，并收集相应浓度咪唑的洗脱蛋白，用12%SDS-PAGE 检观(j，结果200mm咪唑的洗脱液中Fab蛋白最纯，将200mm咪唑的洗脱液用10KD的超滤管除 盐浓缩，即获得纯化的嵌合Fab;5)嵌合Fab的活性鉴定将纯化的嵌合Fab重组蛋白用50mM/LPH为9. 6的碳酸盐缓冲液稀释，并以鼠源性抗独特 型抗体NP30做对照，按5Pg/ml包板，每孔IOOW， 4'C包板过夜，PBST洗5次后，每孔加 300ri含5%脱脂牛奶的PBST缓冲液封闭过夜，PBST缓冲液洗涤5次后，每孔加入血吸虫病 人血清，正常人血清为阴性对照，双"抗原"夹心法检测显示，嵌合Fab抗体片段能与血吸 虫病人血清反应，不与正常人血清反应，说明该嵌合Fab抗体片段保留了鼠源性抗独特型抗 体NP30的模拟抗原性质和特异性。
3、 权利要求1所述的血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段,其特征在于利用上 述获得的嵌合Fab基因片段，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞中进行重组表达、制备。
4、 权利要求1所述的血吸虫抗独特型抗体NP30的嵌合Fab抗体片段在制备检测血吸虫 抗体、抗原制剂，血吸虫病免疫保护及免疫治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及的是一种血吸虫抗独特型抗体NP30嵌合Fab抗体片段及制备方法、应用，属于基因工程技术和制备免疫治疗药物领域。本发明是利用基因工程技术制备鼠源性血吸虫抗独特型抗体NP30的嵌合Fab片段，即将鼠源性抗独特型抗体的重链和轻链可变区与人IgG1的重链部分恒定区(CH1)及轻链恒定区(Cκ)进行重组，并插入到原核表达载体pComb3XSS中，进行表达。该嵌合Fab抗体片段保留了鼠源性抗独特型抗体的模拟抗原性及特异性，可用于血吸虫病免疫保护及急性血吸虫病的治疗。
文档编号C07K16/46GK101357944SQ20081015707
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月23日 优先权日2008年9月23日
发明者冯振卿, 朱晓娟, 红 李, 管晓虹, 静 许, 顾春燕 申请人:南京医科大学