专利名称：具人鼠交叉反应的抗vegfr-2单克隆抗体及其制备、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体及其制备、应 用，该抗体由杂交瘤细胞株8H1分泌产生，具人鼠交叉反应，高特异性识别天然 抗原VEGFR-2的三种形式。
背景技术：
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors, VEGFs)家族
在胚胎发育及出生后的血管发育过程中均起重要的调节作用，主要参与新生血 管和淋巴管的形成。VEGF家族成员与3种酪氨酸激酶受体即血管内皮生长因子受 体(VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3)结合后发挥作用。VEGFR介导了一系列细胞行为包 括细胞迁移、存活、增殖等，在介导脉管新生过程中还有其特殊功能，如调节 血管渗透性导致的组织水肿。VEGFR2主要功能是在各种生理病理情况下介导新 生血管的形成。
近几年免疫治疗及免疫耙向疗法在疾病综合治疗中的作用有了较大进步。 由于抗体的高度特异性，利用抗体将药物导向靶点细胞是一种理想的途径，抗 体导向的药物治疗在动物模型和临床试验中显示出较强的治疗作用。
同时，用于医学科研和临床诊断的生物试剂市场需求大，就目前国内外市 场上及现有的文献报道，尚未见具有具人鼠交叉反应，高特异性抗VEGFR-2的单 克隆抗体，可用多种免疫学方法的研究。
发明内容
本发明目的是提供一种具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体及其制备、20 应用。
本发明所提供的可产生具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，名称为8H1，该细胞株已于2009年4月9日保藏于中国普通微生物菌 种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 3013。
具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1由抗VEGFR-2单克隆抗体的 杂交瘤细胞株8H1分泌产生。
具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体的制备方法 1、制备小鼠免疫原和检测用抗原
从GenBank获取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253) (rmcleotides975-1283) gatgtggttctgagtccgtctcatggaattgaactatctgttggaga aaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgc agcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 设计并合 成上下游弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3。通过正常人脐内皮静脉细胞中 提取总RNA，逆转录cDNA，以cDNA为模板，以上述引物条件下，PCR扩增VEGFR-2 基因。
将VEGFR-2的PCR产物和表达载体pET28a和pGEX-4T-2分别进行连接，转 化入大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑单菌落提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切 鉴定，结果经酶切与预期结果相符，表明目的片段已正确连接入载体中，再用 测序的方法对阳性质粒进一步鉴定，测序结果表明插入片段序列正确，获得了 两种VEGFR-2的重组质粒，分别命名为VEGFR-2-His-pET28a和VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2。
将上述两种质粒分别转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，筛选阳性转化子进 行原核表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，获得了 11kDa和37kDa的重组蛋 白，分别用His和GST亲和层析柱(美国Amersham公司)对目的蛋白进行纯化， 获取两种带有不同标签的VEGFR-2重组蛋白，分别命名为His-VEGFR-2蛋白和 GST-VEGFR—2蛋白。
2、 制备抗VEGFR-2杂交瘤细胞株
用His-VEGFR-2重组蛋白作为免疫原在纯系BALB/c小鼠腹部皮下注射进行 免疫接种，每次100yg/ml，共五次，在最后一次免疫接种前三天进行腹腔内加 强免疫。融合当天取小鼠脾脏，用DMEM培养基(美国GIBCO公司)制备成单细 胞悬液，在50% PEG (PH8.0)存在下，将脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行 融合，用HAT选择性培养基(DMEM培养基98ml， HT贮存液lml， A贮存液lml) 培养7天，换用HT培养基(DMEM培养基99ml， HT lml)培养。
3、 VEGFR-2阳性单克隆抗体的筛选
根据杂交瘤细胞生长情况行酶联免疫法(ELISA)检测筛选，具体方法见下 述。取检测阳性孔的细胞再次克隆化，经过5次克隆化，待所有的孔内单克隆 细胞检测都为VEGFR-2阳性后，取数孔扩大培养并部分冻存。
ELISA方法筛选VEGFR-2阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体，具体方法如
下
(1) 纯化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用包被液(0. 1M碳 酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至20"g/ml，每孔加入100ul， 4。C过夜；
(2) 用PBST洗涤液(PBS含0. 05%吐温)洗涤5次后加入10°/。小牛血清(200 "l/孔)封闭，37。C孵育2h，洗漆5次后备用。(3) 每个孔中加入50"1杂交瘤细胞培养上清，以脾切除小鼠的血清为阳 性对照(1: 1000稀释)，以正常小鼠的血清为阴性对照(1: 1000稀释)37°C 孵育lh。
(4) 将以l: 5000稀释的羊抗鼠Ig-服P第二抗体(SantaCruz公司)100 yl/孔加入到孔内，37。C孵育lh， PBST洗涤5次;
(5) 加入过氧化物酶底物显色液100tU/孔，室温下15分钟后用2M硫酸 中止反应。用multiskan spectrum (Thermo labsystems， USA)酶标仪检测，比 色采用双波长450 nm/630 nm，检测结果大于正常鼠血清OD值2. 5倍的为VEGFR-2 阳性克隆，最终选取2株稳定分泌抗VEGFR-2抗体的杂交瘤细胞，分别命名为 8H1和8H2，它们分泌的单抗分别命名为A8H1和A8H2。
4、 单克隆抗体的亚型鉴定
用美国Sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(ISO-2KT)进行抗体的亚 型，结果示抗VEGFR-2抗体A8H1、 A8H2的亚型都为Ig2a。
5、 BALB/c小鼠体内生产单抗并纯化
六周龄小鼠腹腔接种降植烷0. 5ml/只，10天后腹腔接种用无血清DMEM培 养基稀释的上述8H1、 8H2杂交瘤细胞悬液，同时用SP2/0骨髓瘤细胞做对照， 每只小鼠5X107只。IO天后收集腹水，离心取上清后二氧化硅粉末去杂质，用 Protein G亲和层析柱(美国Amersham公司)纯化抗体，测定浓度后分装，-70
'C冻存。
6、 ELISA方法对A8H1进行功能鉴定及应用
用包被液稀释商品化的重组VEGFR-2蛋白(购自美国R&D公司)至2^g/ml， 每孔加入100(4包被96孔ELISA板，4'C过夜;PBST (PBS含0. 5% Tween20) 5°/0脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37"C孵育2h; PBST洗涤5次后，每个 中加入A8H1 (2Pg/ml起始浓度，11个浓度梯度稀释)4'C过夜；以1: 5000稀 释的羊抗人二抗(Santa Cruz公司)100W/孔加入到孔内，37。C孵育lh;过氧 化物酶底物显色液100W/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测 比色采用双波长450歷/630醒。
结果示A8H1与商品化抗原VEGFR-2有较好的结合活性，A8H1具有较高的 ELISA反应滴度。
7、 免疫印迹(WB)方法对A8H1进行功能鉴定及应用
将1X1()7个高表达VEGFR-2的人脐内皮静脉细胞(HUVEC)和低或无表达 VEGFR-2的小鼠成纤维细胞(NIH3T3)为阴性对照，在RAPI裂解液中裂解，取 得细胞总蛋白，将总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此 膜与20ug/ml A8H1和内参抗体P-actin稀释1: 1000 (Santa Cruz公司)同 时孵育，1: 1000稀释的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司)和ECL发光试剂 盒(美国Pierce公司)曝光于X片(柯达公司)。
结果示HUVEC总蛋白泳道在230kDa和43kDa处各出现一亮条带，分别为 成熟型VEGFR-2和内参P -actin; NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处出现一暗 带，为成熟型VEGFR-2， 43kDa的内参3-actin处有一亮条带；
随曝光时间延长，HUVEC总蛋白泳道在200kDa处又出现一亮条带，为磷酸 化VEGFR-2， NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处一暗带成亮带，为成熟型 VEGFR-2， 200kDa处未见条带出现；
由此可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有较好的结合活性，在 WB应用中能识别两种形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型和磷酸化)。
8、 免疫沉淀方法(IP)对A8H1进行功能鉴定及应用
将1 X 107个HUVEC和NIH3T3细胞(阴性对照)在0. 5 ml RAPI裂解液中裂解，取得细胞总蛋白；取4个EP管编号a、 b、 c、 d,每管内分别加20 u g A8H1、 40y 1的ProteinA/ G (sigma公司)，再加PBS 450 u 1 4 。C混悬3 h， 4 。C 12000rpm30"弃上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分别100 u 1 NIH3T3细胞总 蛋白、30ii 1、 70ul、 100iil HUVEC总蛋白4 。C混悬过夜，4 。C 12000rpm 30 〃PBS洗3次弃上清，各管加入40yl的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热 器100 °C 2'，上样于10% SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上；将此膜与 20yg/ml A8H2抗体孵育，1: 1000稀释的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司) 和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)曝光于X片(柯达公司)。
结果示曝光3〃 ，各泳道在230kDa处均见一亮带，为成熟的VEGFR-2蛋白； 曝光3'，各泳道在230kDa和200kDa处均见两亮带，后者是磷酸化的 VEGFR-2蛋白；在HUVEC总蛋白(b、 c、 d管)3泳道中还有150kDa的未成熟型 的VEGFR-2; NIH3T3总蛋白a泳道中未见此条带；同时在c， d两泳道可见明显 的重链(75kDa)和轻链(30kDa) ， b， a泳道无轻重链可见。
由上可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特异性的结合活性， 在IP应用中可识别三种形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未成熟型)。 9、免疫荧光检测技术(IF)对A8H1进行功能鉴定及应用 将HUVEC和NIH3T3细胞(阴性对照)进行爬片培养，待细胞长约玻片80% 面积左右时候，0. P/。多聚甲醛固定细胞半小时后无菌预冷4。C的PBS冲洗三遍， 加浓度为20 u g/ml的A8H1抗体4。C过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光 二抗(sigama公司)，避光室温孵育1小时，PBS冲洗三遍，加入DAPI (Dojindo 公司，日本)染细胞核，37t:孵育20' ， PBS冲洗三遍，甘油封片后在倒置显 微镜(Olympus公司，日本)下观察并拍摄照片。
结果HUVEC细胞质和膜可见强荧光，而部分NIH3T3细胞核见荧光，可见A8H1在IF中应用，具高特异性结合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
10、 流式细胞术(FACS)对A8H1进行功能鉴定及应用
分别将2 X 10s个HUVEC和NIH3T3细胞用含0. 1%多聚甲醛PBS固定细胞半小 时后，无菌预冷4'C的PBS冲洗三遍，加A8H1梯度浓度为20u g/ml 、 10u g/ml 共孵育4"过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光二抗(sigama公司)，避 光室温孵育1小时后PBS冲洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 u 1重悬，在FACS (Becton Dickinson, San Jose， CA)上进行免疫荧光分析，以加SP2/0骨髓瘤
细胞注射产生腹水一抗为本底。
结果为细胞与阴性腹水本底0.41%; HUVEC与A8H1 (20yg/ml)结合率达 35.55%，与A8H1 (10y g/ml)结合率达31. 33%; NIH3T3与抗体A8H1 (20ug/ml) 结合率10. 18%，与抗体A8H1 (10yg/ml)结合率10. 12%。
由此可见抗VEGFR-2抗体A8H1在FACS中应用，可与表达VEGFR-2的人源、 鼠源的细胞不同程度的特异性结合。
11、 免疫组化技术(IHC)对A8H1进行功能鉴定及应用
肠间质瘤、肝癌石蜡组织连续切片，切片上组织经高温抗原修复后，加A8H1 (20ug/ml) 37。C孵育30',以CD34—抗(DAKO公司)作阳性对照，随后用 ENVISION试剂盒(DAKO公司)试剂37。C孵育30' ， DAB显色，以自身对照为阴 性对照，显微镜下观察终止显色，最后用苏木素复染细胞核。
结果A8H1与CD34均和血管上皮结合而显棕色，同时肝癌细胞的细胞质内 和膜上也显棕色(该肝癌细胞过表达VEGFR-2)，可见A8H1在IHC中应用，可 与过表达VEGFR-2的组织结合。
12、 质谱(MALDI-MS)分析A8H1结合蛋白质的氨基酸序列及应用 利用IP、 SDS-PAGE和质谱分析目的蛋白质的氨基酸序列，从而确定单克隆抗体A8H1抗VEGFR-2的准确性。20ugA8Hl、 40n 1的ProteinA/G (sigma公 司)，PBS 450yl 4 。C混悬3h， 4 。C 12000rpm 30"弃上清PBS洗3次，107 个HUVEC经O. 5ml RIPA裂解的总蛋白100ix 1, 4 。C混悬过夜，4 。C 12000rpm 30〃弃上清PBS洗3次，加入40 u 1的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热器 100 °C 2'，上样于10%SDS-PAGE电泳，在230kDa处可见一亮条带。切取该条 带送质谱分析其蛋白质的氨基酸序列，结果示A8H1特异性识别VEGFR-2抗原。
获得的单克隆抗体A8H1是目的抗VEGFR-2单抗，具高特异性识别重组 VEGFR-2蛋白抗原，人源、鼠源的天然VEGFR-2蛋白抗原，可用于ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF、 IHC， MALDI-MS的免疫学研究，也可潜在用于以潜在用于血管相 关(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)疾病的诊断和治疗。
所述的具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1在检测VEGFR-2抗原 中的应用。
所述的具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1在制备相关的治疗性 药物、相关的诊断试剂及科研试剂中的应用。 本发明与现有技术相比具有的优点
从GenBank获取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253) (nucleotides 975-1283)，运用单克隆抗体制备技术制备的具人鼠交叉反应的 抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1，可以应用于酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫印迹(Western blot, WB)、免疫沉i定 (I,noprecipitation， IP)、流式细胞术(Flow cytometry, FACS)、免疫荧 光(Immunofluorescence, IF)、免疫组化(I腿unohistochemistry， IHC)的 研究，也可以潜 用于血管相关(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)疾病的诊 断和治疗，国内外未见相同报道。该具人鼠交叉反应的抗体A8H1用于体外免疫学研究和诊断，具有无毒、多 种免疫学研究方法用途的优点，原因在于1)A8H1抗体本身是一种免疫球蛋白， 不会通过呼吸道、身体表面接触而伤害健康；2) A8H1可以同时应用于ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF， IHC免疫学研究；3) A8H1具高特异抗VEGFR-2功能，可同 时识别天然抗原VEGFR-2的三种形式(成熟型、磷酸化型，未成熟型)；4)经 质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry, MALDI-MS)和氨基酸序列分析，A8H1特异性识别VEGFR-2抗原；5)可潜在用于 血管相关(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)疾病的诊断和治疗。
同时，该抗体A8H1可潜在应用于体内研究、诊断和治疗血管(包括一些高 表达VEGFR-2的肿瘤)相关疾病，具有广谱、低毒或无毒、低耐药性的优点， 其原因在于l)肿瘤血管内皮细胞突变少，不易产生耐药性；2)虽然不同类型 的肿瘤特异性靶蛋白不同，但是其血管无本质差异，因此具有广谱性；3)直接 作用于血管内皮包括肿瘤内部的新生血管，避免了肿瘤内部高压及药物分布的 问题。
基于上述优点，可以潜在应用A8H1为活性成分制成与血管相关疾病的诊断 及治疗的试剂或药物。该抗体制备方法简单，可由杂交瘤细胞株8H1直接分泌 产生。本发明不仅为进一步研究VEGFR-2的生物学功能及其作用机理奠定了基 础，而且在制备血管(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)相关疾病的诊断性试 剂和治疗性药物中具有潜在的应用前景。
以下将结合附图对本发明作进一步说明
图1为重组His-VEGFR-2蛋白和GST-VEGFR-2蛋白的SDS-PAGE检测结果， His-VEGFR-2蛋白禾口 GST—VEGFR-2蛋白分别为11 kDa和37kDa。图2为抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1与商品化抗原的酶联免疫吸附试验检测 结果，显示A8H1有较高的滴度反应。
图3-1、 3-2为抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1与细胞来源的天然抗原免疫印 迹鉴定结果，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有较好的结合活性，能识 别两种形式的VEGFR-2。
图4-1、 4-2为抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1与细胞来源的天然抗原免疫沉 淀鉴定结果，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特异性的结合活性， 能识别三种形式的VEGFR-2。
图5-1、 5-2为免疫荧光技术鉴定抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1与细胞表达 VEGFR-2的定位结果，HUVEC细胞质和膜可见强荧光，而部分NIH3T3细胞核见 荧光。可见A8H1具高特异性结合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
图6为流式细胞术鉴定抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1细胞表达的VEGFR-2活 性的结果，HUVEC与A8H1结合率达30%以上，NIH3T3与抗体A8H1结合率为10% 左右。
图7-1、7-2、7-3、7-4用免疫组织化学技术分析抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1 的石蜡切片组织定位结果，A8H1和血管上皮结合而显棕色，同时肝癌细胞的细 胞质内和膜上也显棕色。
图8-1、 8-2质谱鉴定、氨基酸序列分析结果，示A8H1特异性识别VEGFR-具体实施例方式
实施例l、抗VEGFR-2单克隆抗体的制备及筛选 应用杂交瘤技术制备抗VEGFR-2单克隆抗体，具体步骤如下 1、制备小鼠免疫原和检测用抗原从GenBank获取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253)
aaagcttgtcttaaattgtacagcaag犯ctgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaat 1111 gagcac c 11 aa.c t a t agat ggt gt aac c c ggagt gac caaggat t gt acac c t gt gc agcatccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 设计并合 成上下游弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatmtcatgaactctaacaaaggtg-3。通过正常人脐内皮静脉细胞中 提取总RNA，逆转录cDNA，以cDNA为模板，以上述引物条件下，PCR扩增VEGFR-2 基因。
将VEGFR-2的PCR产物和表达载体pET28a和pGEX-4T-2分别进行连接，转 化入大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑单菌落提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切 鉴定，结果经酶切与预期结果相符，表明目的片段已正确连接入载体中，再用 测序的方法对阳性质粒进一步鉴定，测序结果表明插入片段序列正确，获得了 两种VEGFR-2的重组质粒，分别命名为VEGFR-2-His-pET28a和 VEGFR-2-GST-pGEX-4T-2 。
将上述两种质粒分别转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，筛选阳性转化子进 行原核表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，获得了 11kDa和37kDa的重组蛋 白，分别用His和GST亲和层析柱(美国Amersham公司)对目的蛋白进行纯化， 获取两种带有不同标签的VEGFR-2重组蛋白，分别命名为His-VEGFR-2蛋白和 GST-VEGFR-2蛋白。
2、制备抗VEGFR-2杂交瘤细胞株
用His-VEGFR-2重组蛋白作为免疫原在纯系BALB/c小鼠腹部皮下注射进行免疫接种，每次100"g/ml，共五次，在最后一次免疫接种前三天进行腹腔内加强免疫。融合当天取小鼠脾脏，用DMEM培养基(美国GIBCO公司)制备成单细胞悬液，在50% PEG (PH8.0)存在下，将脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基(函EM培养基98ml， HT贮存液lml， A贮存液lml)培养7天，换用HT培养基(DMEM培养基99ml， HT lml)培养。3、 VEGFR-2阳性单克隆抗体的筛选
根据杂交瘤细胞生长情况行酶联免疫法(ELISA)检测筛选，具体方法见下述。取检测阳性孔的细胞再次克隆化，经过5次克隆化，待所有的孔内单克隆细胞检测都为VEGFR-2阳性后，取数孔扩大培养并部分冻存。
ELISA方法筛选VEGFR-2阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体，具体方法如
下
(1) 纯化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用包被液(0. 1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至20yg/ni1，每孔加入100yl， 4。C过夜；
(2) 用PBST洗涤液(PBS含0. 05%吐温)洗涤5次后加入10%小牛血清(200ul/孔)封闭，37。C孵育2h，洗涤5次后备用。
(3) 每个孔中加入50"1杂交瘤细胞培养上清，以脾切除小鼠的血清为阳性对照(1: IOOO稀释)，以正常小鼠的血清为阴性对照(1: IOOO稀释)37°C孵育lh。
(4) 将以l: 5000稀释的羊抗鼠Ig-朋P第二抗体(Santa Cruz公司)100ul/孔加入到孔内，37。C孵育lh， PBST洗涤5次;
(5) 加入过氧化物酶底物显色液100ul/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应。用multiskan spectrum (Thermo labsystems， USA)酶标仪检测，比色采用双波长450 nm/630 nm，检测结果大于正常鼠血清OD值2. 5倍的为VEGFR-2阳性克隆，最终选取2株稳定分泌抗VEGFR-2抗体的杂交瘤细胞，分别命名为8H1和8H2，它们分泌的单抗分别命名为A8H1和A8H2。
可产生具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H1，已于2009年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo. 3013。
4、 单克隆抗体的亚型鉴定
用美国Sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(ISO-2KT)进行抗体的亚型，结果示抗VEGFR-2抗体A8H1、 A8H2的亚型都为Ig2a。
5、 BALB/c小鼠体内生产单抗并纯化
6周龄小鼠腹腔接种降植烷0. 5ml/只，10天后腹腔接种用无血清1640培养基稀释的上述8H1、 8H2杂交瘤细胞悬液，同时用SP2/0骨髓瘤细胞做对照，每只小鼠5X107只。10天后收集腹水，离心取上清后二氧化硅粉末去杂质，用ProteinG亲和层析柱(美国Amersham公司)纯化抗体，测定浓度后分装，-70
t:冻存。
实施例2抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1的功能活性鉴定及应用1、 ELISA方法对A8H1进行功能鉴定及应用
用包被液稀释商品化的重组VEGFR-2蛋白(购自美国R&D公司)至2^/ml，每孔加入包被96孔ELISA板，4。C过夜；PBST (PBS含0. 5% Tween20)5%脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37"C孵育2h; PBST洗涤5次后，每个孔中加入A8H1 (2Pg/ml起始浓度，11个浓度梯度稀释)4。C过夜；以1: 5000稀释的羊抗人二抗(Santa Cruz公司)100W/孔加入到孔内，37。C孵育lh;过氧化物酶底物显色液100W/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450腿/630 nm结果见图2示A8H1与商品化抗原VEGFR-2有较好的结合活性，A8H1具有 较高的ELISA反应滴度。
2、 免疫印迹(WB)方法对A8H1进行功能鉴定及应用
将1乂107个高表达VEGFR-2的人脐内皮静脉细胞(HUVEC)和低或无表达 VEGFR-2的小鼠成纤维细胞(NIH3T3)为阴性对照，在RAPI裂解液中裂解，取 得细胞总蛋白，将总蛋白进行10%SDS_PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此 膜与20ug/ml A8H1和内参抗体P-actin稀释1: 1000 (Santa Cruz公司)同 时孵育，1: 1000稀释的羊抗人工gG 二抗(Santa Cruz公司)和ECL发光试剂 盒(美国Pierce公司)曝光于X片(柯达公司)。
结果如图3-1: HUVEC总蛋白泳道在230kDa和43kDa处各出现一亮条带， 分别为成熟型VEGFR-2和内参P -actin; NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处出 现一暗带，为成熟型VEGFR-2， 43kDa的内参e-actin处有一亮条带；
随曝光时间延长如图3-2， HUVEC总蛋白泳道在200kDa处又出现一亮条带， 为磷酸化VEGFR-2， NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处一暗带成亮带，为成熟 型VEGFR-2， 200kDa处未见条带出现；
由此可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有较好的结合活性，在 WB应用中能识别两种形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型和磷酸化)。
3、 免疫沉淀方法(IP)对A8H1进行功能鉴定及应用
将1 X 107个HUVEC和NIH3T3细胞(阴性对照)在0. 5 ml RAP工裂解液中裂解， 取得细胞总蛋白；取4个EP管编号a、 b、 c、 d，每管内分别加20 y g A8H1、 40ul的ProteinA/ G (sigma公司)，再加PBS 450u 1 4 。C混悬3 h， 4 。C 12000rpm30〃弃上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分别100 u 1 NIH3T3细胞总 蛋白、30 ul、 70 ul、 100 iil HUVEC总蛋白4 。C混悬过夜，4 。C 12000rpm 30"PBS洗3次弃上清，各管加入40y 1的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热 器100 °C 2'，上样于10% SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上；将此膜与 20ug/ml A8H2抗体孵育，1: 1000稀释的羊抗人IgG 二抗(Santa Cruz公司) 和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)曝光于X片(柯达公司)。
结果图4-1示曝光3"，各泳道在230kDa处均见一亮带，为成熟的VEGFR-2 蛋白；
图4-2示曝光3'，各泳道在230kDa和200KDA处均见两亮带，后者是磷酸 化的VEGFR-2蛋白；在HUVEC总蛋白(b、 c、 d管)3泳道中还有150kDa的未 成熟型的VEGFR-2; NIH3T3总蛋白a泳道中未见此条带；同时在c， d两泳道可 见明显的重链(75kDa)和轻链(30kDa) ， b， a泳道无轻重链可见。
由上可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特异性的结合活性， 在工P应用中可识别三种形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未成熟型)。
4、免疫荧光检测技术(IF)对A8H1进行功能鉴定及应用
将HUVEC和NIH3T3细胞(阴性对照)进行爬片培养，待细胞长约玻片80% 面积左右时候，0. 1。/。多聚甲醛固定细胞半小时后无菌预冷4。C的PBS冲洗三遍， 加浓度为20u g/ml的A8H1抗体4。C过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光 二抗(sigama公司)，避光室温孵育1小时，PBS冲洗三遍，加入DAPI (Dojindo 公司，日本)染细胞核，37。C孵育20' ， PBS冲洗三遍，甘油封片后在倒置显 微镜(Olympus公司，日本)下观察并拍摄照片。
结果HUVEC细胞质和膜可见强荧光(图5-l: HUVEC细胞，从左到右分别 为A8H1红色荧光、DAPI蓝色荧光染核，白光照)，而部分NIH3T3细胞核见荧 光(图5-2: NIH3T3细胞，从左到右分别为A8H1红色荧光、DAPI蓝色荧光染核， 白光照)。可见A8H1在IF中应用，具高特异性结合人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2。
5、 流式细胞术(FACS)对A8H1进行功能鉴定及应用
分别将2 X 106个HUVEC和NIH3T3细胞用含0. 1%多聚甲醛PBS固定细胞半小 时后，无菌预冷4。C的PBS冲洗三遍，加A8Hl梯度浓度为20ug/ml、 10ug/ml 共孵育4。C过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光二抗(sigama公司)，避 光室温孵育1小时后PBS冲洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 u 1重悬，在FACS (Becton Dickinson, San Jose， CA)上进行免疫荧光分析，以加SP2/0骨髓瘤 细胞注射产生腹水一抗为本底。
结果如图6:
从左到右5个结果图分别为HUVEC与阴性腹水本底0.41%; HUVEC与A8H1 (20ug/ml)结合率达35.55%，与A8H1 (10ug/ml)结合率达31. 33%; NIH3T3 与抗体A8Hl(20u g/ml)结合率10. 18%，与抗体A8H1(10 y g/ml)结合率10. 12%。
由此可见抗VEGFR-2抗体A8H1在FACS中应用，可与表达VEGFR-2的人源、 鼠源的细胞不同程度的特异性结合。
6、 免疫组化技术(IHC)对A8H1进行功能鉴定及应用
肠间质瘤、肝癌石蜡组织连续切片，切片上组织经高温抗原修复后，加A8H1 (20tig/ml) 37。C孵育30'，以CD34—抗(DAKO公司)作阳性对照，随后用 ENVISION试剂盒(DAKO公司)试剂37。C孵育30' ， DAB显色，以自身对照为阴 性对照，显微镜下观察终止显色，最后用苏木素复染细胞核。
结果A8H1 (图7-1)与CD34 (图7-2)均和血管上皮结合而显棕色，为A8H1 与血管反应(图7-3)，同时肝癌细胞的细胞质内和膜上也显棕色(图7-4)， 可见A8H1在IHC中应用，可与过表达VEGFR-2的组织结合。
7、 MALDI-MS质谱(MALDI-MS)分析A8H1结合蛋白质的氨基酸序列及应用 利用IP、 SDS-PAGE和质谱分析目的蛋白质的氨基酸序列，从而确定单克隆 抗体A8H1抗VEGFR-2的准确性。20y g A8H1、 40 n 1的ProteinA/ G (sigma公 司)，PBS 450 ul 4 。C混悬3h， 4 °C 12000rpm 30〃弃上清PBS洗3次，107 个HUVEC经O. 5 ml RIPA裂解的总蛋白lOOyl， 4 。C混悬过夜，4 °C 12000rpm 30〃弃上清PBS洗3次，加入40ul的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热器 100 °C 2'，上样于10%SDS-PAGE电泳，如图8-1示，在230kDa处可见一亮条 带。切取该条带送质谱分析其蛋白质的氨基酸序列，结果如图8-2示A8Hl特异 性识别VEGFR-2抗原。
上述实施例2的系列实验结果证明实施例1获得的单克隆抗体A8H1是目的 抗VEGFR-2单抗，具高特异性识别重组VEGFR-2蛋白抗原，人源、鼠源的天然 VEGFR-2蛋白抗原，可用于ELISA、 WB、 IP、 FACS、 IF, IHC的免疫学研究，也 可潜在用于以潜在用于血管相关(包括一些高表达VEGFR-2的肿瘤)疾病的诊 断和治疗。
权利要求
1、一种具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1，是由保藏号为CGMCCNo.3013的鼠源杂交瘤细胞株8H1所分泌的。
2、 具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体的制备方法，其特征在于 1)制备小鼠免疫原和检测用抗原从GenBank获取VEGFR-2基因的核苷酸片段序列(accession No. NM002253)aaagcttgtcttaaattgtacagcaagaactgaactaaatgtggggattgacttcaactgggaatacc cttcttcgaagcatcagcataagaaacttgtaaaccgagacctaaaaacccagtctgggagtgagatg aagaaatttttgagcaccttaactatagatggtgtaacccggagtgaccaaggattgtacacctgtgc agcat,ccagtgggctgatgaccaagaagaacagcacatttgtcagggtccatgaaaaa， 设计并合 成上下游弓l物F:5-cgggatccgatgtggttctgagtccgtctcatgg-3 ; R : 5-cggaattctcatttttcatgaactctaacaaaggtg-3;通过正常人脐内皮静脉细胞中 提取总RNA，逆转录cDNA，以cDNA为模板，以上述引物条件下，PCR扩增VEGFR-2 基因；将VEGFR-2的PCR产物和表达载体pET28a和pGEX-4T-2分别进行连接，转 化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑单菌落提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切 鉴定，与预期结果相符，表明目的片段已正确连接入载体中，再用测序的方法 对阳性质粒进一步鉴定，测序结果表明插入片段序列正确，获得了两种VEGFR-2 的重组质粒，分别命名为VEGFR-2-His-pET28a和VEGFR-2-GST- pGEX-4T-2;将上述两种质粒分别转化大肠杆菌BL-21感受态细胞，筛选阳性转化子进 行原核表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，获得了 11kDa和37kDa的重组蛋白，与VEGFR-2蛋白的分子量大小相符，分别用His和GST亲和层析柱对目的 蛋白进行纯化，获取两种带有不同标签的VEGFR-2重组蛋白，分别命名为 His-VEGFR-2蛋白和GST-VEGFR-2蛋白；2) 制备抗VEGFR-2杂交瘤细胞株用His-VEGFR-2重组蛋白作为免疫原在纯 系BALB/c小鼠腹部皮下注射进行免疫接种，每次100ug/ml，共五次，在最后 一次免疫接种前三天进行腹腔内加强免疫；融合当天取小鼠脾脏，用DMEM不完 全培养基制备成单细胞悬液，在PH 8. 0的50% PEG存在下，将脾细胞和SP2/0 小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基培养7天，换用HT培养基培养；3) VEGFR-2阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体的筛选 根据杂交瘤细胞生长情况行ELISA检测筛选，取检测阳性孔的细胞再次克隆化，经过5次克隆化，待所有的孔内单克隆细胞检测都为VEGFR-2阳性后， 取数孔扩大培养并部分冻存；ELISA方法筛选VEGFR-2阳性的单克隆抗体，具体方法如下(1) 纯化的GST-VEGFR-2蛋白包被ELISA的96孔板，用0. 1M碳酸盐缓冲 液，pH9.6的包被液稀释至20ug/ml，每孔加入100"1， 4。C过夜；(2) 用PBST洗涤液洗涤5次后加入10。/。小牛血清封闭，每孔200ul/孔， 37t:孵育2h，洗涤5次后备用；(3) 每个孔中加入50ul杂交瘤细胞培养上清，以l: IOOO稀释的脾切除 小鼠的血清为阳性对照，以1: 1000稀释的正常小鼠的血清为阴性对照，37°C 孵育lh;(4) 将以l: 5000稀释的羊抗鼠Ig-服P第二抗体100ul/孔加入到孔内， 37。C孵育lh， PBST洗涤5次;(5) 加入过氧化物酶底物显色液100u 1/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应；用酶标仪检测，比色采用双波长450 nm/630 nm，检测结果大于正常 鼠血清0D值2. 5倍的为VEGFR-2阳性，最终选取2株稳定分泌抗VEGFR-2抗体 的杂交瘤细胞，分别命名为8H1和8H2，它们分泌的单抗分别命名为A8H1和A8H2;4) 单克隆抗体A8H1和A8H2的亚型鉴定用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行抗体的亚型，结果示抗VEGFR-2抗体 A8H1、 A8H2的亚型都为Ig2a;5) BALB/c小鼠体内生产单抗并纯化六周龄小鼠腹腔接种降植垸0. 5ml/只，10天后腹腔接种用无血清DMEM培养 基稀释的上述8H1、 8H2杂交瘤细胞悬液，同时用SP2/0骨髓瘤细胞做对照，每只小鼠 5X107只；IO天后收集腹水，离心取上清后二氧化硅粉末去杂质，用Protein G亲和层析柱纯化抗体；6) 酶联免疫吸附试验方法对A8H1进行功能鉴定及应用 用包被液稀释商品化的重组VEGFR-2蛋白至2Pg/ml，每孔加入包被96孔ELISA板，4t:过夜；PBST洗涤后用5%脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37'C孵 育2h; PBST洗涤5次后，每个孔中加入A8H1，以2Pg/ml起始浓度，11 个浓度梯度稀释，4'C过夜；以1: 5000稀释的羊抗人二抗100W/孔加入到孔内， 37。C孵育lh;过氧化物酶底物显色液10(M/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中 止反应，上机检测比色采用双波长450nm/630nm;结果示A8H1与商品化抗原VEGFR-2有较好的结合活性，A8H1具有较高的 ELISA反应滴度；7) 免疫印迹方法对A8H1进行功能鉴定及应用将107个高表达VEGFR-2的人脐内皮静脉细胞和低或无表达VEGFR-2的NIH3T3小鼠成纤维细胞为阴性对照，在RAPI裂解液中裂解，取得细胞总蛋白， 将总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与20ug/ml A8H1和内参抗体e-actin 1: 1000同时孵育，1: 1000稀释的羊抗人IgG 二抗 和ECL发光试剂盒曝光于X片；结果示人脐内皮静脉细胞总蛋白泳道在230kDa和43kDa处各出现一亮条 带，分别为成熟型VEGFR-2和内参0-actin; NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa 处出现一暗带，为成熟型VEGFR-2， 43kDa的内参0-actin处有一亮条带；随曝光时间延长，人脐内皮静脉细胞总蛋白泳道在200kDa处又出现一亮条 带，为磷酸化VEGFR-2， NIH3T3细胞总蛋白泳道在230kDa处一暗带成亮带，为 成熟型VEGFR-2， 200kDa处未见条带出现；由此可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有较好的结合活性，在 WB中应用中识别两种形式成熟型和磷酸化的VEGFR-2天然抗原；8)免疫沉淀方法对A8H1进行功能鉴定及应用将107个人脐内皮静脉细胞和NIH3T3细胞在0. 5 ml RAPI裂解液中裂解， 取得细胞总蛋白；取4个EP管编号a、 b、 c、 d，每管内分别加20 n g A8H1、 40 ul的ProteinA/ G,再加PBS 450 u 1 4 。C混悬3 h， 4 。C 12000rpm 30" 弃上清PBS洗3次，a、 b、 c、 d各管分别100"l NIH3T3细胞总蛋白、30ul、 70w 1、 100y 1 HUVEC总蛋白4 。C混悬过夜，4 。C 12000rpm 30〃 PBS洗3次弃 上清，各管加入40"1的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热器100 °C 2'， 上样于10% SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上；将此膜与20 u g/ml A8H2抗 体孵育，i: lOOO稀释的羊抗人IgG二抗和ECL发光试剂盒曝光于X片；结果示曝光3"，各泳道在230kDa处均见一亮带，为成熟的VEGFR-2蛋白； 曝光3'，各泳道在230kDa和200kDa处均见两亮带，后者是磷酸化的VEGFR-2蛋白；在b、 c、 d管HUVEC总蛋白中还有150kDa的未成熟型的VEGFR-2; NIH3T3总蛋白a泳道中未见此条带；同时在c， d两泳道可见明显的75kDa的重 链和30kDa的轻链，b， a泳道无轻重链可见；由上可见，A8H1与人源、鼠源的天然抗原VEGFR-2有高特异性的结合活性， 在免疫印迹应用中可识别三种形式的VEGFR-2天然抗原(成熟型、磷酸化，未 成熟型)；9) 免疫荧光检测技术对A8H1进行功能鉴定及应用将人脐内皮静脉细胞和NIH3T3细胞进行爬片培养，待细胞长约玻片80%面 积左右时候，0. W多聚甲醛固定细胞半小时后无菌预冷4。C的PBS冲洗三遍，加 浓度为20 n g/ml的A8H1抗体4。C过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光二 抗，避光室温孵育l小时，PBS冲洗三遍，加入DAPI染细胞核，37。C孵育20'， PBS冲洗三遍，甘油封片后在倒置显微镜下观察并拍摄照片；结果人脐内皮静脉细胞的细胞质和膜可见强荧光，而部分NIH3T3细胞核见 荧光；可见A8H1在免疫荧光技术中应用，具高特异性结合人源、鼠源的天然抗 原VEGFR-2;10) 流式细胞术对A8H1进行功能鉴定及应用采用流式细胞术分析A8H1与天然抗原VEGFR-2的结合活性，分别将2X 106 个人脐内皮静脉细胞和NIH3T3细胞用含0.浅多聚甲醛PBS固定细胞半小时后， 无菌预冷4。C的PBS冲洗三遍，加A8H1梯度浓度为20y g/ml 、 10ug/ml共孵 育4i:过夜，PBS冲洗三遍后加入IgG罗丹明荧光二抗，避光室温孵育l小时后 PBS冲洗三遍，含0. 1%多聚甲醛PBS 400 ul重悬，在FACS上进行免疫荧光分 析，以加SP2/0骨髓瘤细胞注射产生腹水一抗为本底；结果为细胞与阴性腹水本底0. 41%;人脐内皮静脉细胞与浓度为20y g/ml的A8H1结合率达35. 55%,与浓度为10ug/ml的A8H1结合率达31. 33%;NIH3T3 与浓度为20 txg/ml A8H1结合率10.18%,与浓度为10ug/ml A8H1的结合率/10. 12%;由此可见抗VEGFR-2抗体A8H1在流式细胞术中应用，可与人源、鼠源的天 然抗原VEGFR-2特异性结合；(11) 利用免疫组化技术对A8H1进行功能鉴定及应用肠间质瘤、肝癌石蜡组织连续切片，切片上组织经高温抗原修复后，加20 ug/ml的A8H1 37。C孵育30'，以CD34—抗作阳性对照，随后用ENVISION试 剂盒试剂37。C孵育30' ， DAB显色，以自身对照为阴性对照，显微镜下观察终 止显色，最后用苏木素复染细胞核；结果A8H1与CD34均和血管上皮结合而显棕色，同时肝癌细胞的细胞质内 和膜上也显棕色，A8H1在IHC中应用，可与过表达VEGFR-2的组织结合；(12) 质谱分析A8H1结合的目的蛋白质的氨基酸序列及应用 利用免疫沉淀、SDS-PAGE和质谱分析目的蛋白质的氨基酸序列，从而确定单克隆抗体A8H1抗VEGFR-2的准确性；20 u g A8H1、 40 u 1的ProteinA/G， PBS 450 y 1， 4 。C混悬3h， 4 。C 12000rpm 30〃弃上清PBS洗3次，107个冊VEC经0. 5 ml RIPA裂解的总蛋白100ul， 4 。C混悬过夜，4 。C 12000rpm 30〃弃上清PBS 洗3次，加入40ii1的2XSDS-PAGE上样缓冲液，干湿加热器100 °C 2'，上 样于10%SDS-PAGE电泳，在230kDa处可见一亮条带；切取该条带送质谱分析其 蛋白质的氨基酸序列，结果示A8H1特异性识别VEGFR-2抗原。
3、 权利要求1或2所述的具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1在 检测VEGFR-2抗原中的应用。
4、 权利要求1或2所述的具人鼠交叉反应抗VEGFR-2的单克隆抗体A8H1在制备血管相关的治疗性药物、相关的诊断试剂及科研试剂中的应用。
5、分泌权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CGMCC No. 3013的鼠源杂交瘤细胞株8H1 。
全文摘要
本发明涉及的是一种具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体及其制备、应用，该抗体由杂交瘤细胞株8H1分泌产生，具人鼠交叉反应，高特异性识别天然抗原VEGFR-2的三种形式。具人鼠交叉反应的抗VEGFR-2单克隆抗体A8H1由抗VEGFR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H1分泌产生。其制备方法制备小鼠免疫原和检测用抗原；制备抗VEGFR-2杂交瘤细胞株，用His-VEGFR-2重组蛋白作为免疫原在纯系BALB/c小鼠腹部皮下注射进行免疫接种；VEGFR-2阳性单克隆抗体的筛选，ELISA方法筛选VEGFR-2阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体；单克隆抗体的亚型鉴定；BALB/c小鼠体内生产单抗并纯化；采用ELISA等方法对A8H1进行功能鉴定及应用。
文档编号C07K16/28GK101643509SQ200910026399
公开日2010年2月10日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者冯振卿, 刘新建, 奇 唐, 进 朱, 管晓虹, 洋 谭, 黄剑飞 申请人:南京医科大学;中国人民解放军南京军区军事医学研究所