专利名称：一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用。
背景技术：
弧菌属(Vibrio)广泛分布于自然界，尤以水中为多，有100多种。主要致病菌可引起霍乱或食物中毒。
弧菌的外膜蛋白在其致病过程起着非常重要的作用，是一种良好的免疫原；孔蛋白作为主要的外膜蛋白之一，是弧菌交叉保护性疫苗的热门研究对象也是弧菌高效免疫原的热门研究对象。一些孔蛋白如0mpK、0mpU和OmpV，其基因序列在弧菌中具有很好的保守性，作为抗原时，具有良好的免疫原性和免疫保护性，而OmpK更是被证明具有良好的交叉保护性。
麦芽糖孔蛋白(maltoporin),是一个与麦芽糖、麦芽糊精的运输相关的孔蛋白。根据其噬菌体的受体特性命名为LamB。LamB蛋白质的生理功能和蛋白结构研究比较成熟，但是其免疫学性质研究较少，未见到有LamB蛋白作为抗原的相关报道。评价弧菌LamB基因序列的保守性，免疫原性和交叉免疫保护作用，将有助于探讨开发弧菌麦芽糖孔蛋白LamB 作为交叉保护性抗原的应用价值。发明内容
本发明的目的是提供一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用。
为了实现本发明的目的，本发明将弧菌的麦芽糖孔蛋白编码基因LamB经过基因克隆、原核表达和产物制备，得到重组的麦芽糖孔蛋白LamB，该重组蛋白可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。
本发明的目的是提供一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，该基因具有如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7 或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
本发明根据已有的LamB序列，设计简并引物获得了溶藻弧菌ATCC33787 (Vibrio algin。Iyticus)、副溶血弧菌ATCCl7802(Vibrio parahaem。lyticus)、副溶血弧菌VPL4-90 (Vibrio parahaemolyticusVPL4_90)、拟态弧菌ATCC33653(Vibrio mimicus)、非01 霍乱弧菌(Vibrio cholerae VbO)、河弧菌ATCC33810(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌ATCC33813 (Vibrio furnissii)和哈维氏弧菌 NBRC15634 (Vibrio harveyi)的基因 LamB。
简并引物序列如下
LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
其中，溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的核苷酸序列如SEQID NO. I所示，副溶血弧菌ATCC17802的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，副溶血弧菌VPL4-90的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，拟态弧菌ATCC33653的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，非01霍乱弧菌的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，河弧菌ATCC33810的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，弗尼斯弧菌ATCC33813的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，哈维氏弧菌NBRC15634的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC17802、拟态弧菌ATCC33653、河弧菌 ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813和哈维氏弧菌NBRC15634六株弧菌为标准菌株，保藏于美国模式培养物集存库ATCC和日本技术评价研究所生物资源中心NBRC。副溶血弧菌 VPL4-90和非01霍乱弧菌购买于广东环凯微生物科技有限公司。
本发明的目的是提供一种麦芽糖孔蛋白LamB，该蛋白是由上述麦芽糖孔蛋白编码基因编码的。
本发明的目的是提供一种来源于溶藻弧菌ATCC33787的麦芽糖孔蛋白编码基因 LamB编码的LamB蛋白，该麦芽糖孔蛋白具有如SEQ ID NO. 9所示的氨基酸序列。
本发明的目的是提供一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤
(I)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆；
(2)大肠杆菌表达载体pET32_LamB的构建；
(3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB的构建；
(4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备。
具体的，本发明提供的一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤
(I)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆设计简并引物，以弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR，得到麦芽糖孔蛋白编码基因LamB ;然后将其连至pMD19_T中，构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB ;将该载体转化至DH5 α感受态细胞，构建大肠杆菌重组菌 DH5 a -pMD19-T-LamB，测序；其中简并引物序列如下
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
(2)大肠杆菌表达载体pET32_LamB的构建设计表达引物，以克隆载体 pMD19-T-LamB为模板，进行PCR，将得到的LamB基因与表达载体pET32a(+)用BamH I和 Xho I进行双酶切，连接，构建大肠杆菌表达载体pET32-LamB ;其中表达引物序列如下
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ ；
(3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB的构建将(2)中的大肠杆菌表达载体 pET32-LamB转化BL21感受态细胞，得到大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB ；
(4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备在液体LB (含100 μ g/ml的氨苄青霉素)培养基中按1%比例接入培养过夜的(3)中的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C 培养至0D600=0. 6后加入ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C温度进行诱导表达6h ;收集菌体，纯化包涵体，包涵体纯化液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，得到纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB。
本发明的目的是提供一种由上述方法制备的重组麦芽糖孔蛋白LamB，所述重组麦芽糖孔蛋白LamB可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的简并引物
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’ ；
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ;R=A/G。
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的表达引物
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ 。
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌克隆载体 pMD19-T_LamB0
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌重组菌 DH5 ct -pMD19_T_LamB。
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌表达载体 pET32_LamB0
本发明的目的是提供制备重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌重组菌 BL21-pET32-LamB。
具体地，本发明的目的是提供一种含有前述麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的大肠杆菌克隆载体。
优选地,上述克隆载体为一种大肠杆菌克隆载体pMD19-T_LamB,该载体含有麦芽糖孔蛋白编码基因LamB。S卩，将溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCC17802、副溶血弧菌 VPL4-90、拟态弧菌ATCC33653、非01霍乱弧菌、河弧菌ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813 和哈维氏弧菌NBRC15634的基因LamB用于制备大肠杆菌克隆载体pMD19-T_LamB。
本发明的目的是提供一种含有上述克隆载体的宿主细胞。
优选地，上述含有克隆载体的宿主细胞为大肠杆菌重组菌DH5 a -PMD19-T_LamB， 该重组菌含有大肠杆菌克隆载体pMD 19-T-LamB。即，将含有溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCCl 7802、副溶血弧菌VPL4-90、拟态弧菌ATCC33653、非OI霍乱弧菌、河弧菌 ATCC33810、弗尼斯弧菌ATCC33813和哈维氏弧菌NBRC15634的编码基因LamB的克隆载体 pMD 19-T-LamB用于制备大肠杆菌重组菌DH5 a -pMD19-T_LamB。
本发明的目的是提供一种含有前述麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的大肠杆菌表达载体。即，以前述大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB为模板，设计引物，进行PCR，构建大肠杆菌表达载体pET32_LamB。
本发明的目的是提供一种含有上述表达载体的宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB，能够表达生产重组麦芽糖孔蛋白。
优选地，本发明的目的是提供一种含有溶藻弧菌ATCC33787的麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的大肠杆菌表达载体。该大肠杆菌表达载体pET32_LamB含有溶藻弧菌ATCC33787 的麦芽糖蛋白编码基因LamB。S卩，以含有溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB为模板，构建大肠杆菌表达载体pET32_LamB。
优选地，本发明的目的是提供一种含有溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的大肠杆菌表达载体的宿主细胞，即大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB，将含有溶藻弧菌ATCC33787 的编码基因LamB的表达载体pET32_LamB用于制备大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB，该重组菌能够表达生产重组麦芽糖孔蛋白LamB。
本发明的目的是提供所述重组麦芽糖孔蛋白LamB在制备弧菌交叉保护性疫苗中的应用。
本发明的目的是提供一种弧菌交叉保护性疫苗，该疫苗含有所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB。接种所述弧菌交叉保护性疫苗后，机体即可获得对多种弧菌的保护性。
本发明的目的是提供所述重组麦芽糖孔蛋白LamB在制备治疗弧菌病药物中的应用。
本发明的目的是提供治疗弧菌病的药物，该药物含有所述的重组麦芽糖孔蛋白 LamB0
本发明的目的是提供所述重组麦芽糖孔蛋白LamB在制备抗体中应用。
本发明的目的是提供所述重组麦芽糖孔蛋白LamB为免疫原制备的抗体。
抗体可由重组麦芽糖孔蛋白LamB免疫兔子得到的抗血清纯化得到。
本发明的目的是提供一种由所述重组麦芽糖孔蛋白LamB制备的兔抗血清。该兔抗血清对多种弧菌具有交叉反应性。
本发明的目的是提供一种所述兔抗血清的制备方法调整重组麦芽糖孔蛋白 LamB至蛋白终浓度为2mg/mL，将处理好的重组蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂混合，漩涡震动充分乳化成〃油包水〃乳状剂。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。以乳化处理后的重组蛋白LamB免疫新西兰大白兔。首次免疫时，重组蛋白LamB与等体积的弗氏完全佐剂乳化，背部皮下多点注射， 隔两周加强免疫一次，加强免疫时，重组蛋白LamB与弗氏不完全佐剂乳化。第二次加强免疫后第八天由耳缘动脉取血lmL，测定血清效价。达到满意效价后，颈动脉放血。离心分离血清，小管分装，冷冻保存。
本发明的目的是提供上述抗体在制备用于检测弧菌病的诊断试剂中的应用。
本发明的目的是提供含有上述抗体的用于检测弧菌病的诊断试剂。
本发明的目的是提供上述抗体在制备用于检测弧菌病的诊断试剂盒中的应用。
本发明的目的是提供含有上述抗体的用于检测弧菌病的诊断试剂盒。该诊断试剂盒含有前述诊断试剂。
上述诊断试剂及诊断试剂盒为利用其含有的抗体，经ELISA法可检测弧菌。
本发明的另一目的是提供所述疫苗、治疗弧菌病的药物、抗体、诊断试剂及诊断试剂盒在评价弧菌LamB基因序列保守性、重组麦芽糖孔蛋白LamB免疫原性和交叉免疫保护作用中的应用。
本发明的优点如下
I)本发明利用基因工程技术获得了一种重组麦芽糖孔蛋白LamB，该重组蛋白可以制备弧菌交叉保护性疫苗、治疗弧菌病的药物、抗体、诊断试剂及诊断试剂盒。
2)重组蛋白LamB制备的兔抗血清对多种弧菌具有交叉反应性和被动免疫保护作用，重组蛋白LamB本身作为抗原，在以斑马鱼为免疫模型中，对多种弧菌具有交叉保护性， 因此本发明的重组蛋白LamB可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到实际养殖中。
3)本发明的大肠杆菌重组菌株BL21-pET32_LamB能够大量的表达具有天然免疫活性的重组LamB蛋白，易于纯化，可应用于生产弧菌交叉保护性疫苗，且成本低。
4)本发明提供的弧菌交叉保护性疫苗、治疗弧菌病的药物、抗体、诊断试剂及诊断试剂盒是首次利用重组麦芽糖孔蛋白LamB制备的，将有助于探讨开发弧菌麦芽糖孔蛋白 LamB制备弧菌交叉保护性疫苗、治疗弧菌病的药物、抗体、诊断试剂及诊断试剂盒的应用价值，对于评价弧菌LamB基因序列的保守性、免疫原性和交叉免疫保护作用有重要意义。
图I为弧菌LamB基因核苷酸序列系统发育树；
其中，V.fluvialis ATCC33810 (JF747209)河弧菌 ATCC33810，V. furnissii ATCC33813QF747208)为弗尼斯弧菌 ATCC33813，V. furnissii NCTCl 1218 (CP002378. I) 为弗尼斯弧菌 NCTCl 1218，V. cholerae MJ-1236 (229605062)为霍乱弧菌 MJ-1236, V. cholerae (CP001486. I)为霍乱弧菌，V. cholerae VbO (JF747210)为非 01 霍乱弧菌，V. mimicus ATCC33653 (JF747206)为拟态弧菌 ATCC33653, V. alginolyticus ATCC33787 (JF747203)为溶藻弧菌ATCC33787, V. parahaemolyticus ATCC17802 (JF747207) 为副溶血弧菌 ATCC17802, V. harveyi NBRC15634 (JF747211)为哈维氏弧菌 NBRC15634, V. harveyi ATCC BAA-1116 (CP000790. I)为哈维氏弧菌 ATCCBAA-1116，V. alginolyticus (EU625279. I)为溶藻弧菌，Vibriosp. Ex25 (CP001806. I)为 Ex25 弧菌，V. parahaemolyticus VPL4-90 (JF904926. I)为副溶血弧菌 VPL4-90，Cluster A 为基因簇 A， ClusterB为基因簇B，Cluster C为基因簇C，括号内均为各菌株的NCBI序列的登入号；
图2为本发明实施例4中纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB的SDS-PAGE电泳结果；
其中，M为蛋白Marker，I为纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB，其分子量为59. 4kDa ；
图3为本发明实施例5的重组麦芽糖孔蛋白LamB的兔抗血清的Western blotting分析结果；
其中，I为海弧菌(V.pelagius) ;2为需钠弧菌(V. natriegens) ;3为弗尼斯弧菌(V. furnissii) ；4为河弧菌(V. fluvialis) ；5为拟态弧菌(V. mimicus) ；6为创伤弧菌 (V. vulnificus) ；7 为溶藻弧菌(V. alginolyticus) ；8 为霍乱弧菌(V. cholera) ；9 为副溶血弧菌(V. parahaemolyticus) ； 10 为副溶血弧菌 VPL4-90 (V. parahaemolyticus4-90)； 11 为解蛋白弧菌(V. proteoIyticus) ；12 为大肠杆菌 DH5 α (E. coliDH5 α ) ;13 为金黄色葡萄球菌(S. aureus) ；14为枯草芽孢杆菌(B. subtilis) ;15为嗜水性气单胞菌 (A. hydrophilic) ；16 为鳗弧菌(V. anguillarum) ；17 为灿烂弧菌(V. splendidus) ；18 为坎氏弧菌(V. campbellii) ；19为麦契尼可夫弧菌(V. metschnikovii) ；20为哈维氏弧菌 (V. harveyi) ；21 为美人鱼弧菌(V. damsela) ；22 为费氏弧菌(V. fischeri)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中所用的试剂或实验材料均为常规的分子生物学实验用试剂或实验材料，均为市售产品。
实施例I麦芽糖孔蛋白基因LamB的克隆
根据副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) RIMD2210633的麦芽糖孔蛋白前体蛋白(Maltoporin,简称LamB)基因序列(登录号为NP_801154)，综合其他弧菌LamB基因序列，设计简并引物，合成引物。分别以八株弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR。简并引物序列如下
LamB-F:5’-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，
LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’
其中，S=C/G；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ；
反应体系(25yL) :1 μ LDNA模板，I μ L正向引物，I μ L反向引物,9. 5 μ L双蒸水,12.5μ L2XTaq PCR Master mix。
反应条件95°C预变性5min，然后 95°C 30s,58°C 45s，72°C lmin，30 个循环。反应结束后整体延伸lOmin。
将PCR产物通过试剂盒回收得到麦芽糖孔蛋白基因LamB ;然后将其连至pMD19_T 中，构建重组克隆子pMD19-T-LamB ;转化至DH5a感受态细胞，在预置的含有Amp和异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)、X-gal的LB琼脂平板上涂布，通过蓝白斑筛选阳性克隆子， PCR验证后测序。测序结果去除载体序列后的开放阅读框为
溶藻弧菌ATCC33787的基因LamB的核苷酸序列如SEQ IDN0. I所示；副溶血弧菌 ATCC17802的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；副溶血弧菌VPL4-90的基因 LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；拟态弧菌ATCC33653的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；非01霍乱弧菌的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；河弧菌ATCC33810的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；弗尼斯弧菌ATCC33813的基因LamB的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；哈维氏弧菌NBRC15634的基因LamB的核苷酸序列如SEQ IDN0. 8所示。
弧菌LamB基因核苷酸序列系统发育树如图I所示。
实施例2大肠杆菌表达载体pET32_LamB的构建
由实施例I所得到溶藻弧菌的LamB基因克隆序列，设计去掉信号肽的表达引物， 合成该引物，引物序列如下
LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’
LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’
以由实施例I所得到LamB重组克隆质粒pMD19-T_LamB为模板，进行PCR，反应条件如下
反应体系(25yL) :1 μ LDNA模板，I μ L正向引物，I μ L反向引物,9. 5 μ L双蒸水,12.5μ L2XTaq PCR Master mix。
反应条件95°C预变性5min，然后 95°C 30s,58°C 45s，72°C lmin，30 个循环。反应结束后整体延伸lOmin。
将PCR产物回收，使用所得到的LamB基因以及表达载体pET32a(+)分别用BamH I 和Xho I进行双酶切条件如下
反应体系(20μ L):双蒸水 10 μ L，10 X K Buffer2 μ L，基因 LamB (或者 pET32a (+)质粒DNA)6y L，BamHl μ L, Xho I I μ L，在37°C下酶切2小时。电泳后分别回收大小约为 I. 2kb和5. 9kb的目的片段。二者分别为LamB基因以及表达载体pET32a(+)。
然后用T4连接酶将二者连接，反应条件如下
反应体系(IOyL):1.21*片段5 4 1^，5.91*片段3 4 1^，10\了4连接酶81^€61'14 1^ T4连接酶lyL，在16°C下酶连8小时以上。即可以得到大肠杆菌表达载体pET32_LamB。
实施例3大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建
取由实施例2得到的大肠杆菌表达载体pET32-LamB5y L加入到50 μ L BL21感受态细胞中，冰上放置30min ;然后放入42°C热激90秒；快速将EP管转移到冰浴中15min ； 然后每管加入350 μ L LB培养基，将管转移至37°C摇床，缓慢振摇60min使细菌复苏；取 50 μ L复苏后的菌液涂布于含Amp以及X-Gal和IPTG的固体LB平板上；倒置平皿，于37°C 恒温培养24h ;最后挑取白色单菌落用于PCR检测，得到大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB。
实施例4重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备
在液体LB (含100 μ g/ml的氨苄青霉素)培养基中按1%比例接入培养过夜的由实施例3得到的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C培养至0D600=0. 6后加入 ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C温度进行诱导表达6h。收集菌体，纯化包涵体，由于重组蛋白含有6 X HIS标签，包涵体纯化液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，纯化过程参照HIS纯化Kit说明书。纯化后的琼胶酶利用BCA法测定蛋白浓度，通过用12%SDS-PAGE检测重组LamB蛋白的纯度及分子量，结果见图2。纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB保存于_20°C以备用，该重组麦芽糖孔蛋白LamB即为弧菌交叉保护性抗原。
实施例5重组麦芽糖孔蛋白LamB的交叉免疫反应性分析
动物饲养新西兰大白兔购买回来后,在生物系动物房饲养一周，使其适应实验室条件。每日以实验动物兔饲料喂食2次，早晚各一次，每次喂食量以约15min吃完为宜。
免疫原的准备由实施例4得到的纯化的重组LamB蛋白，采用Bradford法测定其蛋白浓度，并调整至蛋白终浓度为2mg/mL，即可作为免疫抗原使用。处理后的抗原蛋白溶液于4°C冰箱保存备用。处理好的重组蛋白溶液与等体积的弗氏佐剂混合，漩涡震动充分乳化成〃油包水〃乳状剂。鉴定方法是将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。
兔抗血清的制备以乳化处理后的重组蛋白LamB免疫新西兰大白兔。免疫前，由兔耳缘动脉取血留作阴性血清。首次免疫时，抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化，背部皮下多点注射，免疫剂量约为250 μ g蛋白/kg兔。隔两周加强免疫一次，加强免疫时，抗原与弗氏不完全佐剂乳化。第二次加强免疫后第八天由耳缘动脉取血lrnL，测定血清效价。运用 Dot-ELISA法测其效价，达到满意效价后，颈动脉放血。离心分离血清，小管分装，冷冻保存。
重组蛋白兔抗血清与弧菌外膜蛋白的交叉反应以重组蛋白LamB的抗血清作为一抗，分别与18株弧菌标准菌株以及3株非弧菌的菌体总蛋白反应，进行Western blotting分析，结果见图3。
实施例6重组麦芽糖孔蛋白LamB交叉免疫保护性分析
以斑马鱼为模型评价重组麦芽糖孔蛋白LamB的交叉免疫保护性。
斑马鱼饲养用充分曝气的自来水饲养，保持水温在26±2°C左右，在增氧条件下生活I周以上以适应环境。每日清晨换水一次，上午和下午各喂饲一次，喂食量以5min吃完为宜。
菌株LD50的计算病原弧菌(副溶血弧菌VPL49-0、副溶血弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、哈维氏弧菌、弗尼斯弧菌)活化后培养，进行计数并以鱼用生理盐水稀释至109CFU/mL， 然后十倍梯度稀释至106CFU/mL。每组10只斑马鱼，实验组每只斑马鱼注射10 μ L菌液，对照组注射10 μ L生理盐水。参照Reed-Mueneh的方法计算弧菌对斑马鱼的半数致死量LD50。 计算公式如下
lgLD50=lg高于50%死亡率的细菌稀释度+距离比例X Ig稀释系数
距离比例=(高于50%的死亡率-50%) / (高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)
重组蛋白兔抗血清被动保护实验健康的斑马鱼被随机分组，每组30条。实验组的斑马鱼腹腔注射重组蛋白LamB的兔抗血清，注射量为10 μ L/每只，对照组注射等体积量的生理盐水。2h后，采用500倍LD50的病原弧菌(溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌 ATCC17802、副溶血弧菌VPL4-90和拟态弧菌ATCC33653)菌液进行攻毒，5天内观察实验组和对照组斑马鱼的存活情况，记录死亡鱼类的数目。计算相对存活率RPS
相对存活率(RPS) = (I-免疫组死亡鱼数/对照组死亡鱼数)X 100%
结果发现，重组蛋白的兔抗血清对多株弧菌具有被动免疫保护作用，实验结果见表I。
表I
攻毒弧菌对照组累计死亡百分比实验组累计死亡百分比相对成活率(RPS)副溶血弧菌 VPL4-9080.0% (24/30)50.0%(]5/30)37.5%副溶血弧菌 ATCC 丨 780293.3%(28/30)43.3%(13./30)53.6%溶藻弧菌 ATCC 3378790.0% (27/30)53.3%(16/30)40.7%拟态弧菌 ATCC 3365380.0%(24/30)56.7%(17/30)29.2%
斑马鱼的主动免疫实验首次免疫，每只斑马鱼腹腔注射5 μ L由实施例5得到的 2mg/ml的重组蛋白LamB抗原。首次免疫后，每隔一周进行一次加强免疫。第二次加强免疫两周后，随机选择3-5条斑马鱼，收集血液，以dot-ELISA法检测鱼体内产生抗体的情况，如达到理想效价即可进行攻毒实验。以生理盐水替代重组蛋白LamB抗原，注射剂量和操作相同来作为对照组。
攻毒活化复毒后的弧菌，培养至对数生长期。离心收集菌体，以灭菌的鱼用生理盐水洗涤3次，去除培养基中有毒的成分。最后用生理盐水重悬，进行细菌计数。采用平板计数法和血球计数法进行计数，并用生理盐水调整细菌浓度，以500倍LD50的菌液(溶藻弧菌ATCC33787、副溶血弧菌ATCCl 7802、副溶血弧菌VPL4-90、拟态弧菌ATCC33653、哈维氏弧菌NBRC15634和弗尼斯弧菌ATCC33813)注射斑马鱼进行攻毒，并观察攻毒后5天内各组鱼体的生长和病变情况，记录死亡鱼类的数目。计算相对存活率RPS，综合鱼类病理损伤分析， 从而评价疫苗的效果，其具有对多种弧菌的交叉中和保护性，实验结果见表2。
表 权利要求
1.一种麦芽糖孔蛋白编码基因LamB，其特征在于，该基因具有如SEQ ID NO. USEQ IDNO. 2,SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
2.一种重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备方法，该方法包括如下步骤 (1)麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆； (2)大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建； (3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建； (4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (O麦芽糖孔蛋白编码基因LamB的克隆设计简并引物，以弧菌的基因组DNA为模板，进行PCR，得到麦芽糖孔蛋白编码基因LamB ;然后将其连至pMD19_T中，构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-LamB ;将该载体转化至DH5 α感受态细胞，构建大肠杆菌重组菌DH5 a -pMD19-T-LamB，测序；其中简并引物序列如下LamB-F:5，-ATGAAAAAAGTAAGTSNYATTGCAG-3，LamB-R:5’-TTACCACCAAGCTTCNRCTTG-3’其中，S=C/G ；N=A/C/G/T ；Y=C/T ；R=A/G ； (2)大肠杆菌表达载体pET32-LamB的构建设计表达引物，以克隆载体pMD19-T_LamB为模板，进行PCR，将得到的LamB基因与表达载体pET32a(+)用BamH I和Xho I进行双酶切，连接，构建大肠杆菌表达载体pET32-LamB ;其中表达引物序列如下LamBeF:5’-CGCGGATCCGCAGTGGATTTTAAC-3’LamBeR:5’-CCGCTCGAGATTCGGCTTTTACCAC-3’ ； (3)大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB的构建将(2)中的大肠杆菌表达载体pET32-LamB转化BL21感受态细胞，得到大肠杆菌重组菌BL21-pET32_LamB ； (4)重组麦芽糖孔蛋白LamB的制备在液体LB(含100 μ g/ml的氨苄青霉素)培养基中按1%比例接入培养过夜的(3)中的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB菌液，在37°C培养至0D600=0. 6后加入ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)，于37°C温度进行诱导表达6h ;收集菌体，纯化包涵体，包涵体纯化液直接过镍NTA琼脂糖凝胶FF柱，亲和层析纯化重组酶，咪唑梯度竞争洗脱，得到纯化的重组麦芽糖孔蛋白LamB。
4.由权利要求2或3所述的方法制备的重组麦芽糖孔蛋白LamB。
5.制备权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌表达载体pET32_LamB。
6.制备权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB的大肠杆菌重组菌BL21-pET32-LamB。
7.一种弧菌交叉保护性疫苗，其特征在于，该疫苗含有权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB。
8.治疗弧菌病的药物，其特征在于，该药物含有权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB0
9.以权利要求4所述的重组麦芽糖孔蛋白LamB为免疫原制备的抗体。
10.含有权利要求9所述抗体的用于检测弧菌病的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种弧菌交叉保护性抗原及其制备方法和应用，该抗原为弧菌重组的麦芽糖孔蛋白LamB，本发明的制备方法能够大量的表达具有天然免疫活性的重组麦芽糖孔蛋白LamB，易于纯化，且成本低。本发明的LamB蛋白作为外膜主要蛋白在各种弧菌中广泛存在，序列具有很好的保守性，其本身作为抗原，在以斑马鱼为免疫模型中，对多种弧菌具有交叉保护性，其兔抗血清对多种弧菌具有交叉反应性和被动免疫保护作用，因此本发明的重组麦芽糖孔蛋白LamB可以作为弧菌的交叉保护性抗原应用到水产养殖中。
文档编号C12R1/19GK102978219SQ20121044790
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者胡忠, 夏常艳, 伦镜盛, 袁传飞 申请人:汕头大学