专利名称：Ⅱ型登革病毒kmb17细胞适应株及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒株的制备方法，尤其是II型登革病毒在KMB17细胞上的适应株的分离、筛选、选育、纯化以及培养方法，属于病毒疫苗技术领域。
背景技术：
登革病毒是以埃及伊蚊和白纹伊蚊等进行传播的虫媒病毒，广泛流行于世界100多个热带和亚热带国家及地区，能引起登革热、登革出血热及更为严重的登革出血休克征。依抗原性不同可将登革病毒分为I、II、III、IV四个血清型，其中II型传播最广泛。近年来， 由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热在全世界的发病率提高了近30倍。在过去两年中全球登革热感染人群的数量持续增长，在东南亚中部和南部地区、美国以及南太平洋地区，每年约8000万人感染登革病毒，估计24000人死亡，超过100个国家的30亿人受到威胁。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已经成为严重的全球公共卫生问题。登革热不仅严重危害人民的健康，而且还为国家和个人带来严重的经济负担。由于还没有可供使用的登革热疫苗用于预防，登革热的防控形式日趋严峻，因此登革热疫苗相关的应用基础研究是一项迫在眉睫的任务。现有的灭活和减毒活疫苗，主要以Vero、PDK、PGMK和FrhL等非人源性细胞为基质进行生产的，其残余DNA存在潜在的致病危险。普遍认为比较安全且免疫效果好的，仍然是用人源性细胞基质(如KMB17细胞)生产的疫苗，但已知的人源性登革病毒宿主细胞非常局限，能用于疫苗生产的还未发现。人胚肺二倍体细胞KMB17用于人用疫苗具有很多优点无致癌性，且安全性高于其它细胞，易于规模化生产，而且对多种病毒具有广泛的敏感性，用其制备病毒性疫苗，还可克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，作为人源性细胞基质生产人用疫苗时，引入的外源因子较少，比动物来源的细胞基质具有更好的安全性，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质，且能稳定实现大规模疫苗生产。人胚肺二倍体细胞KMB17，已经成功应用于甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗的生产，其安全性和细胞稳定性都得到了广泛验证，但目前还没有成功应用于II型登革病毒中国株的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种II型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，为将人胚肺二倍体细胞KMB17应用于II型登革病毒疫苗的生产提供技术支持。本发明提供的II型登革病毒KMB17细胞适应株通过下列步骤获得
I)、按Iml病毒液/瓶的量，将浓度为4. OMOI的II型登革病毒液接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28±2°C、C02体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比,补加下列病毒维持液RPMI_1640培养基+ 2%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6.6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%体积比补加质量浓度为6. 6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第8 9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500 X g尚心分尚5min,收获上清，即得病毒液；
2)、将步骤I所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28±2°C、CO2体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液RPMI-1640培养基+ 2%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第8 9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500Xg离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的II型登革病毒液；
3)、按Iml病毒液/瓶的量，将步骤2所得传代稳定的II型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病 毒维持液MEM培养基+ 5%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为
6.6% (w/v)的碳酸氢钠，于温度为37土O. 50C XO2体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第7天，当人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，收获已出现细胞病变CPE的病毒液，并于-70°C下保存；
4)、将步骤3的病毒液反复冻融2次，于4°C，3500Xg离心分离5min，收获上清，得病毒液，将该病毒液按Iml病毒液/瓶的量接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液MEM培养基+ 5%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠；于温度为37土O. 5°C、CO2体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，获得能够在KMB17细胞上增殖的登革病毒毒种，并于_70°C下保存；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应的II型登革病毒适应株。所述每瓶的细胞数量为I I. 7X 106。所述步骤I)的白纹伊蚊细胞C6/36经过下列传代培养按常规在细胞中加入下列细胞生长液RPMI-1640培养基加10%体积比(v/v)的小牛血清；放置于温度为28土2°C，二氧化碳体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养，培养2-3天换液一次，培养4-5天细胞长成形态良好致密单层。所述步骤3)的人胚肺二倍体细胞KMB17经过下列培养按常规细胞培养方法对KMB17细胞进行培养，所用细胞生长液为MEM培养液加10%体积比(v/v)的小牛血清，细胞传代培养2-3天，使细胞长成形态良好致密单层。通过本发明能将流行的II型登革病毒株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应，从而得到能稳定传代且病毒扩增量高的细胞适应株，经噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经鉴定，该病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。能够以人胚肺二倍体细胞KMB17为基质，进行II型登革病毒扩增，打破了 II型登革病毒宿主细胞的局限性，为具有我国地域特色的预防登革病毒疫苗的研发开拓新的思路，为研发II型登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，同时也具备大规模生产的可行性，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。
图I为正常KMB17细胞(显微镜放大40倍)；
图2为登革病毒感染KMB17细胞后的细胞病变(CPE)(显微镜放大40倍)；
图3为不同条件下II型登革病毒中国株感染KMB17细胞的感染性滴度；
图4为II型登革病毒中国株I 10代的感染性滴度； 图5为正常KMB17细胞的免疫荧光观察(X 100);
图6为II型登革病毒中国株感染KMB17细胞的免疫荧光观察(X100)；
图7为登革病毒特异基因片段；
图8为Tl型登革病毒特异基因
片段；
图9为II型登革病毒细胞适应株在KMB17细胞中的第一次噬斑纯化；
图10为II型登革病毒细胞适应株在KMB17细胞中的第二次噬斑纯化；
图11为II型登革病毒细胞适应株在KMB17细胞中的第三次噬斑纯化；
图12为透射电镜观察纯化的II型登革病毒KMB17细胞适应株；
图13为Real-time检测II型登革病毒细胞适应株在KMB17细胞中的扩增曲线；
图14为Real-time检测II型登革病毒细胞适应株在KMB17细胞中的溶解曲线。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步描述。实施例I
1)、白纹伊蚊细胞C6/36经过下列传代培养按常规在细胞中加入下列细胞生长液RPMI-1640培养基加10%体积比(v/v)小牛血清；放置于温度为28±2°C，二氧化碳体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养，培养2-3天换液一次，培养4-5天细胞长成形态良好致密
单层；
2)、按Iml病毒液/瓶的量，将浓度为4.Omol的II型登革病毒液接种到步骤I)的生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，每瓶的细胞数量为I 1.7X106，于温度为28土2°C、CO2体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液RPMI-1640培养基+ 2%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第8天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500 X g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；
3)、将步骤2)所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，每瓶的细胞数量为I I. 7 X 106，于温度为28±2°C、CO2体积浓度为5%(v/v)的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液RPMI-1640培养基+ 2%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6%(w/V)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加体积浓度为6. 6%(w/V)的碳酸氢钠溶液，培养至第8天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500 X g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代，获得传代稳定的II型登革病毒液；
4)、人胚肺二倍体细胞KMB17经过下列培养按常规细胞培养方法对KMB17细胞进行培养，所用细胞生长液为MEM培养液加10%体积比(V /v)的小牛血清，细胞传代培养2-3天，使细胞长成形态良好致密单层；
5)、按Iml病毒液/瓶的量，将步骤3)所得传代稳定的II型登革病毒液，接种到步骤
4)的铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，每瓶的细胞数量为I I. 7X106，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液MEM培养基+ 5%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6% (w/v)的碳酸氢钠，于温度为37土O. 5°C、C02体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第7天，当人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，收获已出现细胞病变CPE的病毒液，并于_70°C下保存；
6)、将步骤5)的病毒液反复冻融2次，于4°C，3500Xg离心分离5min，收获上清，得病毒液，将该病毒液按Iml病毒液/瓶的量接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，每瓶的细胞数量为I I. 7X 106，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液MEM培养基+ 5%体积比(v/v)的小牛血清+ 2%体积比(v/v)的质量浓度为6. 6%(w/v)的碳酸氢钠；于温度为37±0. 50CXO2体积浓度为5% (v/v)的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，获得能够在KMB17细胞上增殖的登革病毒毒种，并于-70°C下保存；如此连续传代培养三代，获得传代稳定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应的II型登革病毒适应株。登革病毒KMB17细胞适应株毒种检测
I)病毒滴定检测
采用微量滴定法测定每代病毒液感染性滴度，检测结果显示，II型登革病毒中国株在KMB17细胞上连续传代10代，病毒滴度呈持续升高直至稳定的适应过程，传第1、2代最低，细胞无明显病变，传至第3代时，细胞开始有明显病变，病毒的感染滴度达到3. 00lgCCID50/ml，至第9、10代滴度最高，达到5. O lgCCID50/ml。病毒通过10代连续传代，选育出良好的KMB17细胞适应株。2) II型登革病毒KMB17细胞适应株在KMB17细胞中的噬斑纯化
利用KMB17细胞对选育出的II型登革病毒细胞适应株进行噬斑筛选纯化弃去6孔板中已生长成单层的KMB17细胞的培养液，用Hanks液漂洗2次。随后用不含血清的维持液将病毒稀释后以4. OMOI浓度接种细胞，置37±0. 5 °C孵育4h，每隔15min轻轻水平晃动培养板数次，以保证病毒与细胞充分接触。吸附完毕后吸出病毒液，加ImL含O. I %中性红及5%胎牛血清的MEM琼脂糖培养基，倒置于37土O. 5 °C，5 %C02 (w/v)恒温培养箱中培养。2天之后每天观察2次，记录蚀斑出现和生长情况，直至大小适宜时吸取斑点，以维持液稀释后接种96孔板，收集病变孔的培养液，以上述方法进行3轮噬斑纯化。通过实验，3轮噬斑·纯化均在3天后出现微小斑点，至5-6天斑点直径长至约8-lOum，以此方法筛选出纯化的II型登革病毒适应株。3)病毒的纯化和电镜检测
在KMB17细胞中大量培养扩增病毒，将收获的病毒液以4°C，8000rpm*15min离心后取上清液，加入PEG6000至终浓度为8%，4°C摇晃18h后，4°C，12000rpm*30min离心并弃掉上清液，沉淀以原体积1/30的O. 01mol/L PBS液进行溶解，随后以12000rpm*15min离心并取上清液，上清液置于蔗糖垫最上层，通过蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，再经过38000rpm*2h超速离心并弃上清，沉淀以原体积1/100的O. 01mol/L PBS液进行溶解并收集，最终获得浓缩的纯化病毒。经浓缩纯化后收获到体积浓缩100倍的病毒液。登革病毒KMB17细胞适应株毒种鉴定
I、登革病毒的免疫荧光检测 用免疫荧光法检测II型登革病毒纯化株抗原性。以KMB17细胞接种放有玻片的6孔板，长至单层后，其中4孔细胞接种IOOul/孔(2. (MOI)Tl型登革病毒，2孔作阴性对照，用含5%血清MEM培养基于37°C、5% CO2条件下培养。在种毒后第72小时取出孔里的玻片进行荧光染色。一抗为 1型登革病毒抗血清，二抗为FITC标记的羊抗人IgG。II型登革病毒中国株在KMB17细胞上传代10代后，以II型登革病毒抗血清进行免疫荧光染色。结果显示，在接种病毒的细胞内可见明亮的绿色荧光，而对照组细胞内未见绿色荧光，表明选育出的适应株在KMB17细胞中可以增殖并具有良好的抗原性。2、RT-PCR扩增登革病毒特异性基因
将收获的II型登革病毒液接种KMB17细胞后72小时，裂解细胞提取总RNA，根据卫生部发行的《登革热诊断标准》中所述的“RT-PCR技术检测登革病毒RNA及型别鉴定”方法，合成登革病毒通用检测引物D1、D2及登革病毒型特异性引物TS2，通过RT-PCR对II型登革病毒特异性基因进行扩增。反应条件50°C 30分钟合成cDNA ;94°C预变性2分钟；然后以94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分钟条件进行PCR循环，共35个循环；最后72°C延伸7min。引物序列见表I :经琼脂糖凝胶电泳分析，分别获得511bp的登革病毒特异基因片段和119bp的 1型登革病毒特异性片段。表I登革病毒特异性引物
rIife __丨扩_片段大今- ρ ■ I 銮辞异f ；
P； ■:■*ij'_I Sn iUmi 丨通坷；
U,:__t' 1 .: AiA^AQ qicy.*! Sj TC III nCG Γ FC ...y I 1·3! !；；! iiBIXi! I 1 I
Tg; .·_I S I: >；丨 HSI
3、纯化登革病毒的电镜检测
纯化的病毒经磷钨酸负染后，通过日立H-7650透射电镜观察病毒颗粒形态。透射电镜观察可见经纯化后登革病毒颗粒仍保持正常形态，直径约为51nm。4、适应株在KMB17细胞中增殖动力学检测
收获II型登革病毒细胞适应株第3 7天的病毒培养物，提取病毒RNA为模板检测登革病毒在细胞中的增殖动态，Real-time PCR显示病毒接种KMB17细胞后第3天已经开始增殖，在第5至6天增殖最为迅速，在第7天病毒增殖达到最高峰。
结论通过本专利中所提供的系列技术方案，选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的II型登革病毒KMB17细胞的适应株，并对适应株在KMB17细胞上的培养条件进行优化。通过噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经各项检测及鉴定证明病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。上述工作证实了以KMB17细胞为基 质进行登革病毒扩增的可行性，打破了登革病毒宿主细胞局限性，为具有我国地域特色的预防性登革病毒疫苗的研发开拓新的思路，为研发我国拥有自主知识产权的登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，同时也具备大规模生产的可行性，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。
权利要求
1.一种II型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得 1)、按Iml病毒液/瓶的量，将浓度为4.OMOI的II型登革病毒液接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28土2°C、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液RPMI-1640培养基+ 2%体积比的小牛血清+ 2%体积比的质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8 9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500 X g离心分离5min，收获上清，即得病毒液； 2)、将步骤I所得病毒液，按Iml病毒液/瓶的量，接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28±2°C、C02体积浓度为5%的环境中，恒温吸附I小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液RPMI-1640培养基+ 2%体积比的小牛血清+ 2%体积比的质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8 9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4°C，3500 X g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的II型登革病毒液； 3)、按Iml病毒液/瓶的量，将步骤2所得传代稳定的II型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液MEM培养基+ 5%体积比的小牛血清+ 2%体积比的质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠，于温度为37土O. 5°C、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至第7天，当人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，收获已出现细胞病变CPE的病毒液，并于_70°C下保存； 4)、将步骤3的病毒液反复冻融2次，于4°C，3500X g离心分离5min，收获上清，得病毒液，将该病毒液按Iml病毒液/瓶的量接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液MEM培养基+ 5%体积比的小牛血清+ 2%体积比的质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠；于温度为37±0. 5°C、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6. 6%的碳酸氢钠溶液，培养至人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，获得能够在KMB17细胞上增殖的登革病毒毒种，并于_70°C下保存；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的II型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应的II型登革病毒适应株。
2.如权利要求I所述的II型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述每瓶的细胞数量为I I. 7X106。
3.如权利要求I所述的II型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述步骤I)的白纹伊蚊细胞C6/36经过下列传代培养按常规在细胞中加入下列细胞生长液RPMI-1640培养基加10%体积比的小牛血清；放置于温度为28±2°C，C02体积浓度为5%的环境中，恒温培养，培养2-3天换液一次，培养4-5天细胞长成形态良好致密单层。
4.如权利要求I所述的II型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于所述步骤3)的人胚肺二倍体细胞KMB17经过下列培养按常规细胞培养方法对KMB17细胞进行培养，所用细胞生长液为MEM培养液加10%体积比的小牛血清，细胞传代培养2-3天，使细胞长成形态良好致密单层。
全文摘要
本发明公开一种Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，能将流行的Ⅱ型登革病毒株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应，从而得到能稳定传代且病毒扩增量高的细胞适应株，经噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经鉴定，该病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。能够以人胚肺二倍体细胞KMB17为基质，进行Ⅱ型登革病毒扩增，打破了Ⅱ型登革病毒宿主细胞的局限性，为具有我国地域特色的预防登革病毒疫苗的研发开拓新的思路，为研发Ⅱ型登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，同时也具备大规模生产的可行性，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。
文档编号C12R1/93GK102911920SQ20121044649
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者孙强明, 赵玉娇, 潘玥, 陈俊英, 杨丽娟, 岳耀斐, 黄新伟, 施海晶, 丁晓洁 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所