专利名称：一种检测细胞周期g1期的报告基因及方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体地讲，涉及一个报告基因。
背景技术：
报告基因是一种编码某种易于检测的蛋白质或酶的基因，把报告基因的编码序列与其他目的基因融合，在调控序列控制下进行表达，通过报告基因的表达产物可标定目的基因的表达状况。报告基因技术因具有高灵敏度、检测方便等特点，被广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光素酶以其能够将细胞内基因的活性可视化和对细胞的无毒性而越来越成为主流，并且荧光素酶报告基因技术已被广泛应用于体外监测细胞生长和增殖。
细胞的正常生长、分裂，必须依次经过准备阶段的间期和有丝分裂期，细胞周期的正常运行，受到特异的细 胞周期素和细胞周期依赖性蛋白激酶的精确调控，同时，还伴随着多种特异性分子的合成和降解。基于此，将荧光素酶与某一细胞周期特异性分子融合，便可通过观察荧光素酶报告基因反映特异性分子的表达情况，进而间接地了解细胞周期的变化及增殖情况。
Cyclin E和细胞周期依赖的基因调控之间密切相关，在正常细胞增殖调控中起重要作用。Cyclin E与⑶K2结合是S期启动的必要条件。活化后的cyclin E-⑶K2复合体通过磷酸化其底物蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)、pRb家族成员P107、⑶C6、定位于AT位点的核蛋白P220 (NPAT)等，使DNA合成得以进行并在Gl末期使细胞越过限制点(R点)进入S期。Cyclin E-⑶K2的激酶活性受到严格调控的，在复制过程中，当DNA 损伤或出现错误时，可激活一些针对cyclin E-CDK2活性的抑制因子，如P21( cipl)、P27 ( kipl)和P57( kip2)等。这些激酶活性的抑制因子结合cyclin E-⑶K2使其失去激酶活性，不能磷酸化其底物，DNA的合成从而不能被启动，则细胞停滞在Gl期。同时cyclin E 的表达水平受Fbw7的泛素化调节，在S期迅速被Fbw7介导的泛素化降解。
细胞周期蛋白E (cyclin E)在Gl中期开始表达，在G1/S期含量达高峰后逐渐降解消失，其结合并激活周期蛋白依赖性激酶(⑶K) 2，cyclin E/(⑶K) 2激酶复合物通过磷酸化其下游底物如pRb、⑶C6、NPAT和P107等使细胞启动DNA合成，不可逆转地进入S期。 因此，cyclin E的表达变化可准确地反映出细胞周期由Gl期向S期转变的过程，将荧光素酶与cyclin E融合，便可构建出反映细胞周期Gl期的报告基因。
根据以前的研究，细胞周期的分析主要基于两种生物学技术，一种是5溴脱氧尿 P密唳核苷(5-Bromodeoxyuriding, BrdU)掺入法,其主原理是5_BrdU可在S期代替胸腺U密啶(T)渗入正在复制的DNA分子。另一种是应用流式细胞术进行细胞周期分析，其原理是利用各期的DNA含量的不同。但两种方法都只能在细胞水平观测细胞周期的变化，而无法实现体内细胞周期监测。近年来，通过体内细胞标记进而实现体内细胞周期监测的方法不断涌现，如溴脱氧尿苷和放射性核素等标记细胞和分子，但这些技术却存在细胞毒性作用， 而且随着细胞不断分裂，标记信号逐渐消失。细胞周期报告基因则因其对细胞无毒性，可进行体内细胞周期监测而很好地克服了以往细胞周期分析技术的不足。发明内容
本发明的目的是设计一种新的报告基因，用于检测细胞周期的变化。
本发明的另一个目的是提供上述报告基因在检测细胞周期的变化中的应用。
本发明的另一个目的是提供上述报告基因在分子生物学、抗肿瘤药物疗效、转基因动物等方面的研究应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案实现的本发明提供一种检测细胞周期Gl期的报告基因，包含启动子、细胞周期蛋白E基因和标记基因，本发明所述标记基因是一类能够对目的基因(本发明的cyclin E基因)起到特异性标记作用的基因，可以通过体内监测标记基因的表达产物来判断目的基因的表达情况， 从而判断细胞周期变化。在检测标记基因表达产物时，不需要杀死动物，从细胞水平上判断基因是否表达，只需要向动物体内注射标记基因表达广物的底物，当标记基因表达后，表达产物遇到底物即可发生肉眼可见的反应。例如，当荧光素酶基因表达后，向动物体内注射荧光素后，荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，会发出生物荧光。因此，本发明中所述标记基因并不局限于荧光素酶基因，基于同样原理的绿色荧光蛋白基因和β-葡萄糖苷酸酶基因等都可以作为标记基因。
在优选实施方式中，所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或 β-葡萄糖苷酸酶基因。
在优选实施方式中，所述一种检测细胞周期Gl期的报告基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO: I 所示。
本发明提供一种重组载体，具体为一种重组质粒，其如图I所示。代表报告基因的是pro-cyclinE-luc的序列，序列从34至4289共4256bp,具有报告细胞是否处于Gl期的能力。34到1425是启动子(promotor cyclin E,共1392bp), 1450至2634是细胞周期蛋白 E基因(共1185个bp)，2665至4289是荧光素酶基因(共1625bp)。该重组载体的构建方法为采用PCR的方法从基因组中扩增出cyclin E基因并对它进行分析，然后克隆到10_4 cyclinE promotor质粒上,并转化到大肠杆菌中，提取质粒，并对它进行酶切和测序分析， 再将鉴定正确的质粒转染到细胞中进行各项功能分析。
本发明提供一种检测细胞周期是否处于Gl期的方法，其包括以下步骤Ca)用上述构建成功的重组载体转染待检测细胞；(b)检测细胞周期蛋白E是否表达当检测到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E表达，则可判断细胞处于细胞周期Gl期；当检测不到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E没有表达，则可判断细胞不处于细胞周期Gl期；在优选实施方式中，该方法中所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或 β-葡萄糖苷酸酶基因。
本发明的有益效果本发明以报告基因的表达来观测细胞周期的变化的策略有如下几个优点I、不需要杀死动物，可从体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平的观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。
2、可早期监测疾病的增殖情况，能达到对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用。克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。
图I 为 pro-cyclinE-luc 质粒构建2 SpcDNA HA cyclin E质粒PCR产物电泳结果图3为10-4 cyclin E promotor质粒酶切结果图4为pro-cyclinE-luc质粒酶切结果图5为稳定转染Hela pro-cyclinE-luc细胞株A、突光素酶活性结果Ekwesternblot结果图6为细胞周期同步化后结果A、荧光素酶活性检测结果B、westernblot结图7 Fbw7 siRNA干扰后结果荧光素酶活性结果图8为蛋白酶体抑制剂MG132 (control、20uM、40uM)作用后实验结果A、荧光素酶活性结果B、westernblot结果
具体实施例方式下面结合附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，可参照本领域常规方法条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件，或按照制造产品厂商所建议的条件进行。另外，本实施例中所使用的质粒，PCR聚合酶、限制性内切酶、感受态细胞、 各种试剂盒等都是可以在相关生物公司买到。
(一)质粒的构建I.Insert DNA 的制备I.I根据引物设计及质粒设计要求加入Hind III酶切位点。
引物I (Sense):5，-CAGGATCCCCAAGCTTCCATGAAGGAGGACGGCGGCGC-3，引物 2 (Anti-sense):5，-CCGGAATGCCAAGCTTGCGCCATTTCCGGCCCGCTGC-3，1.2 PCR扩增目的基因片段I.2. I 使用 PrimeSTARO HS DNA Polymerase (Code No. DRO10S)扩增。在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌PCR-EP管中pcDNA-HA-cyclinE 质粒(50 倍稀释液) I ul 5 XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)IOuldNTP mixture (各 2. 5mM)4 ul引物 I (Pm/ul)O. 5 ul引物 2(Pm/ul)O. 5 ulPrimeSTAR HS DNA Polymerase(2. 5U/ul)0. 5 ul加ddH20至1.2.2调整好反应程序。置于PCR仪上，PCR反应参数为50 ul98 0C 10 秒，55 °C 10 秒，720C 2 min,循环 30 次。最后 72°C，保温 5 min。
1.2.3取PCR产物用于电泳检测。(结果见图2)。
2. Vector DNA 的制备2.I酶切反应2.I. I反应体系10-4 cyclinE promotorIOul10XM Buffer5ulHind III (lOu/ul)I. 5ul加 ddH20 至50 ul2. I. 2 反应条件37°C 4hours2.2取酶切产物用于电泳检测。(结果见图3)3.连接3. I 将 10-4 cyclinE promotor 质粒(预先用 Hind III内切酶处理)与 cyclinE DNA 片段混合制备成体积为10 ul的DNA溶液。Vecter DNA和Insert DNA的比例为0· 03 pmol 0. 3 pmol ο
3. 2向上述DNA溶液中加入等体积2 ul的连接酶，充分混匀。
3. 3 50°C反应 15 分钟。Vecter DNA (约 5 Ong/ul)lulInsett DNA(SOngM)Iul5 X In-Fusion HD EnzjrIne Premix2ul加(WH20至ΙΟμΙ
(二)重组质粒的转化和鉴定 I.转化1.I步骤(I)取IOOul感受态细胞(大肠杆菌E. Col DH5a大连宝生物公司)悬液融解。(2)加入上述DNA连接产物10 ul，轻轻摇匀，冰上放置30min。(3)42°C水浴中热击90 秒。(4)冰上冷击却2min。(5)取上述菌涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置I小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16h。(6)挑选10单个的白色菌落分别放在5ml含Amp的LB培养基中过夜培养。
2.质粒提取2.I材料质粒小提试剂盒(天根公司，目录号DP103-03)，上述过夜培养的菌液2.2步骤(I)柱平衡步骤向吸附柱CP3中加入500 ul的平衡液BL，12，000 rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(2)取1-5 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12，000 rpm离心I分钟，吸除上清。(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250 ul溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。(4)向离心管中加入250 ul溶液P2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。(5)向离心管中加入350 ul溶液P3，立即温和地上下翻转8次，充分混匀。12,000 rpm Cl3,400Xg )6离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中。12,000 rpm离心45秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。(7)向吸附柱CP3中加入500 ul去蛋白液H)，12,000 rpm离心45秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回。(8)向吸附柱CP3中加入600 ul漂洗液PW，12，OOOrpm离心45秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。(9)向吸附柱CP3中加入 600 ul漂洗液PW，12，000 rpm离心45秒，倒掉收集管中的废液。(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12，000 rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80 ul洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12，000 rpm离心I分钟将质粒溶液收集到离心管中。
3.酶切3.I材料上述提取质粒，内切酶HindIII (宝生物公司)，内切酶Pst I (宝生物公司)3.2步骤第 I 组 20 ul 体系中 3 ul DNA, 2 ul 10 X Buffer，15 ul 无菌水；第 2 组 20 ul 体系中 3 ul DNA, 2 ul 10 X Buffer，I ul 内切酶 Hind III，14 ul 无菌水； 第 3 组 20 ul 体系中 3 ul DNA, 2 ul 10 X Buffer，I ul 内切酶 Pst I，14 ul 无菌水； 第 4 组 20 ul 体系中 3 ul DNA, 2 ul IOXBuffer, I ul 内切酶 Hind III，I ul 内切酶 Pst I , 13 ul 无菌水。
轻轻混匀后在37C环境下酶切2h。
3. 3取酶切产物用于电泳检测。(结果见图4)3.4将上述酶切正确的质粒菌种送公司测序。
(三)建立稳定转染pro-cyclinE-luc的细胞株及鉴定I.转染1.I 材料HeLa 细胞，pro-cyclinE-luc 质粒，Lipofectamine 2000, G418。
I. 2步聚(I)取六孔板的培养皿，分别加入一定量的3X 105HeLa细胞37°C培养， 至 70% 左右汇合。(2)根据 Lipofectamine2000 的说明书加 8. Oulpro-cyclinE-luc 质粒 DNA及20 ul的Lipofectamine2000进行转染。(3)转染48小时后将细胞转到IOOmm的培养皿中进行培养。(4)加G418 (lOOOug/ml)进行筛选，每二天换一次液，筛选时间为2周后扩大培养。稳定转染的细胞命名为HeLa pro-cyclinE-luc细胞。
2.鉴定2.I步聚取六孔板的培养分别加入适量上述的pro-cyclinE-luc细胞、HeLa细胞,培养到指数生长期，用RLB裂解液裂解(Promega公司)细胞提取蛋白。利用BCA (试剂盒购买自碧云天公司)法检测蛋白浓度，蛋白分两部分，一份用来检测荧光素酶活性(结果见图 5A), 一份用来做westernblot检测蛋白(结果见图5B)。
(四)检测报告基因的功能I.细胞周期同步化I.I 材料HeLa pro-cyclinE-luc 细胞，nocodazole 330uM1.2步骤(1)取两个六孔板(分别命名为1-8号)每个孔里加适量的HeLa pro-cyclinE-luc细胞，将细胞培养至指数生长期的早期(密度大概50%左右)。(2)往 (2-8号，I号用来加DMSO做对照)加入含330umol / L nocodazole的培养基用于肿瘤细胞的同步化培养，作用18h。(3)弃掉含nocodazole培养基，用PBS液洗2次后换上普通培养基,1、2号进行第一次取样。细胞一分为二, 一部分细胞用于流式,一部分用于蛋白样品的提取。(4)以后每3小时取一次样。
I. 3流式分析步骤(I)将上述用于做流式的细胞用PBS洗二遍。(2)用70%的冰浴酒精过夜固定(3)离心离去乙醇，PBS清洗一次。(4)每管细胞样品中加入O. 5毫升碘化丙啶染色液(碧云天公司)，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37°C避光温浴30分。
I. 4荧光素酶活性的检测步聚=(I)BCA法测蛋白浓度。(2)利用发光仪(lumat LB 9507，BERTH0CD公司)检测荧光素酶活性。(结果见图6A)1.5 westernblot实验(结果见图6B)2.Fbw7-siRNA干扰实验2.I 材料HeLa pro-cyclinE-luc 细胞，Lipofectamine2000, Fbw7_siRNA 及 NC-siRNA (序列如下)。
Scramble siRNA:sense 5’ _UUCU(XGMGGUGUQVGGUUU_3，Anti-Sense 5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3’Fbw7 siRNA:sense 5，_M(XUUCUGUGGAGAGAGAMUGUU_3，Anti-Sense 5’ -CAUUUCUCUCUCCAGAGAAGGUUUU-3’2.2步骤(I)用DEPC水处理相关实验用品。(2)取60mm的培养皿2个，每孔分别加入适量的 HeLa pro-cyclinE-luc 细胞。(3)根据 Lipofectamine2000 (Invitrogen 公司) 的说明书加200 pmol siRNA及10 μ I的Lipofectamine2000进行转染。(4)48小时用RLB 裂解液裂解细胞。(5) BCA测蛋白浓度，蛋白样品分两部分，一部分用做荧光素酶活性检测 (结果见图7),—部分用做westernblot实验。
3.蛋白酶体抑制实验3.I 材料MG132 (碧云天公司),HeLa pro-cyclinE-luc 细胞。
3. 2步骤(I)取60mm培养皿3个,分别加适量的HeLa pro-cyclinE-luc细胞。(2)等细胞大约80%汇合时分别加入等体积的DMS0、MG132 (20umol/L), MG132 (40umol/ L)。(3) 5小时后用RLB裂解液提取蛋白，检测蛋白浓度，蛋白样品一分为二一份用于荧光素酶活性的检测(结果见图8A),—份用于westernblot分析(结果见图8B)。
权利要求
1.一种检测细胞周期Gl期的报告基因，其特征在于包含启动子、细胞周期蛋白E基因和标记基因。
2.如权利要求I所述的一种检测细胞周期Gl期的报告基因，其特征在于所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或β_葡萄糖苷酸酶基因。
3.如权利要求I所述的一种检测细胞周期Gl期的报告基因，其核苷酸序列如SEQID NO: I所示。
4.一种重组载体，其包含权利要求f 3任一所示的细胞周期Gl期报告基因和抗生素抗性基因。
5.一种检测细胞周期是否处于Gl期的方法，其包括Ca)用权利要求4所述的重组载体转染待检测细胞；(b)检测细胞周期蛋白E是否表达当通过体内监测到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E表达，则可判断细胞处于细胞周期Gl期；当监测不到标记基因表达产物时，即表明细胞周期蛋白E没有表达，则可判断细胞不处于细胞周期Gl期。
6.如权利要求5所述一种检测细胞周期是否处于Gl期的方法，其特征在于步骤(b)中所述标记基因包括荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或葡萄糖苷酸酶基因。
全文摘要
本发明公开了一种细胞周期G1期报告基因。本发明提供了一种重组载体，包括细胞周期G1期报告基因和抗生素抗性基因，将该载体转染待检测细胞后，通过检测报告基因的表达可确定细胞是否处于细胞周期G1期。本发明可用于体内监测细胞周期的变化，克服了流式等技术只能在细胞水平观察细胞周期的缺点，为动物实验提供了一个强有力的工具。并且，利用本发明可对药物疗效进行早期评价，缩减药物的研发时间和减少研发费用，克服了传统影像学只能从解剖水平对疾病描述的局限，及核素标记存在的细胞毒性的局限。
文档编号C12N15/63GK102911935SQ20121044602
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者张国君, 魏晓龙, 郭翠萍 申请人:张国君