专利名称：一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物及微生物的检测及应用技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用。
背景技术：
黄曲霉毒素作为一种天然毒素，在花生田间生长时就可产生。即便通过良好的管理规范也无法将黄曲霉毒素毒素从食物链中去除。生物控制法是刚刚新兴的一种方法，主要是利用微生物间的拮抗，寻找对黄曲霉有抑制作用的微生物；或者通过转基因技术对产 毒黄曲霉进行基因修饰，使不产毒的黄曲霉成为可能污染食品的优势菌种，来达到对黄曲霉毒素的控制作用。它经济、有效、并且不会对环境造成二次污染，有望从源头对花生黄曲霉毒素污染加以控制。到目前为止，国内还没有开发出成型、经济的生物控制剂产品。生物控制剂作为黄曲霉毒素控制的一种很好的手段急需加以研究和开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，并对筛选出的拮抗菌的作用效果、安全性进行评估，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。通过细菌分离，发酵培养；制备曲霉的培养及孢子悬液；筛选抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的复筛等一系列工作，形成安全、有效、经济的黄曲霉毒素生物控制剂产品。将产品应用于农作物(花生等)收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，提高出口农作物(花生等)的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物(花生等)及其制品的出口贸易。为解决上述技术问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌具有拮抗作用，其保藏编号为=CCTCC M 2012217。保藏日期为2012年6月8日。保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏中心地址中国.武汉.武汉大学。分类命名为枯草芽孢杆菌21-1-2 (Bacillus subtilis21-l_2)。为解决上述技术问题,本发明还提供了一种从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤a.细菌分离；b.曲霉的培养及抱子液的制备；c.抗曲霉菌株的筛选；d.抗曲霉菌株的复筛。所述步骤a可以进一步包括称取土壤样品5 IOg,加入50 IOOml无菌生理盐水，涡旋混匀I 3min，制成体积比为I : 10的悬液，分别用微量移液器吸取100 200iil，涂布LB平板，37°C培养24 36h，挑取单菌落纯化。所述步骤b可以进一步包括将产毒黄曲霉菌和无毒黄曲霉菌接种到PDA斜面，28°C培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4 8ml已灭菌的0. 9%生理盐水，震荡后用血球计数板计数，并调至100 110/ml，4°C 保存。所述步骤c可以进一步包括移液枪取100 ill步骤b制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干；将步骤a分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个菌株做两个平行样，28 °C培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。所述步骤d可以进一步包括用接种环取步骤c初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37°C，190r/min发酵24 26h，8000r/min离心10 20min，用一次性滤器过滤滤除菌体；移液枪取IOOy I制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入I00ia、200ia滤液，IOOul生理盐水作为对照，置于28°C恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。为解决上述技术问题，本发明又提供了一种枯草芽孢杆菌，包含下述基因序列 CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAMAAo为解决上述技术问题，本发明再提供了一种枯草芽孢杆菌，采用如下方法进行鉴定时，包含下述基因序列鉴定方法枯草芽孢杆菌37°C肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGABacterialDNA kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA ;16S rDNA基因序列PCR反应上游引物AGAGTTTGATCATGGCTCAG,下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件94 °C 5min ；94°C 45s, 58 °C 30s, 72°C 45s，共 30 个循环；72°C IOmin ；测得的基因序列为CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGT
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CACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。为解决上述技术问题，本发明另提供了一种所述枯草芽孢杆菌在农产品对黄曲霉菌拮抗中的应用。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述枯草芽孢杆菌在制备黄曲霉菌拮抗制剂中的应用。本发明有益的技术效果在于通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。通过细菌分离，发酵培养；制备曲霉的培养及孢子悬液；筛选抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的复筛等一系列工作，形成安全、有效、经济的黄曲霉毒素生物控制剂产品。本发明应用于花生等农作物收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，能够提高出口花生等农作物的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物及其制品的出口贸易。
图I为本发明实施例所述枯草芽孢杆菌21-1-2对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片;图2为本发明实施例对比使用枯草芽孢杆菌17-3对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片；图3为本发明实施例对比使用枯草芽孢杆菌38-3对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片。
图4为本发明实施例所述枯草芽孢杆菌16S rDNA序列构建的系统进化树。
具体实施例方式黄曲霉拮抗菌的筛选I实验材料I. I实验菌株样品来源潍坊诸城，青岛莱西的大片花生种植区采取土壤样品，进行选择性分离，以期得到目标菌。I. 2实验仪器
DHG系列电热恒温鼓风干燥箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司)精密电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)电子万用炉(北京市永光明医疗仪器厂)不锈刚手提式灭菌器 (上海申安医疗器械厂)单人双面超净工作台 (苏州安泰技术有限公司)HZQ-C空气浴振荡器 (哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)SPX型智能生化培养箱 (宁波东南仪器有限公司)台式离心机及离心管 (上海安亭科学仪器厂)旋转蒸发仪牛津杯(内径6_、夕卜径8_、高IOmm)试管培养皿三角瓶烧杯细菌过滤器移液枪及枪头镊子酒精灯涂布器打孔器滤纸接种环I. 3培养基PDA固体培养基(真菌培养基)土豆去皮切块，称取200g加入500ml水，煮沸30min。双层纱布过滤至烧瓶中，力口A 20g鹿糖，20g琼脂粉,加水至1L, 115°C高压灭菌20min。PDA液体培养基上述操作不加琼脂。营养肉汤购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM106。称取19g粉末加入IL水，加热煮沸至完全溶解，分装。121°C高压灭菌15min。营养琼脂购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM107。称取33g粉末加入IL水，加热煮沸至完全溶解，分装。121°C高压灭菌15min。冷却至46°C左右倒平板或斜面。
I. 4供试菌株黄曲霉(Aspergillusflavus) 289O,编号 CGMCC3. 2890 ；黄曲霉(Aspergillusflavus) 395O,编号 CGMCC3. 3950 ；寄生曲霉(Aspergillusparasiticus) 3,124,编号 CGMCC3. 124 ;均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。2实验方法2. I细菌分离称取土壤样品5g,加入50ml无菌生理盐水,润旋混勻Imin,制成比例为I : 10(V/V)的悬液，分别用微量移液器吸取100 iil，涂布LB平板，37°C培养24h，挑取单菌落纯化。 2. 2抗曲霉菌株的筛选曲霉的培养及抱子液的制备将实验室保存的广毒和无毒曲霉接种到PDA斜面，28°C培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4ml已灭菌的0. 9%生理盐水，充分震荡后用血球计数板计数，并调至107/ml，4°C保存。抗曲霉菌株的初筛移液枪取100 U I制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干。将分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个平板数量适宜，每个菌株做两个平行。28°C培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。抗曲霉菌株的复筛用接种环取初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37°C, 190r/min发酵24h, 8000r/min离心lOmin,用一次性滤器过滤滤除菌体。移液枪取IOOiU制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100 Ii 1>200 u I滤液，100 u I生理盐水作为对照,置于28°C恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。2. 3对曲霉孢子萌发的抑制将2种产毒曲霉-黄曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子浓度调整为IXlO6CFU/mL,每种曲霉孢子分别与终浓度为I X 107CFU/mL的枯草芽孢杆菌混合培养于PDA液体培养基中(以不加枯草芽孢杆菌的PDA液体培养基为对照)，放入28°C摇床培养,分别于培养6h和18h后显微镜观察曲霉孢子萌发情况，每个处理随机观察50个黄曲霉孢子，计算孢子萌发率.实验重复4次.2. 4抑制黄曲霉菌丝延长用无菌打孔器打直径6_的长有曲霉的琼脂块倒置于PDA培养基平板中央，在距其2cm处分别放置4个直径6mm的无菌滤纸片。将鉴定出的几株细菌37°C肉汤中培养过夜(调整浓度为I X 107CFU/mL)，在每张滤纸片上分别滴加10 ii L的细菌培养液，灭菌生理盐水作为对照，每株细菌重复3次在28°C恒温培养箱中培养6d.2. 5对黄曲霉毒素生物合成的抑制实验将2种产毒曲霉-黄曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子浓度调整为IXlO6CFU/mL,分别与终浓度为I X 107CFU/mL的枯草芽孢杆菌混合培养于PDA液体培养基中(以不加枯草芽孢杆菌的PDA液体培养基为对照)，28°C下摇床培养4d, Beacon黄曲霉毒素固相萃取柱纯化后，LC-MS/MS检测黄曲霉毒素含量.实验重复3次.2. 6对黄曲霉毒素的分解作用
选取复筛枯草芽孢杆菌菌株接种于肉汤培养基中发酵24h，取5mL菌体发酵液加入黄曲霉毒素4种的标准品至终浓度为20ppb，以无菌的发酵液加入黄曲霉毒素4种作为空白对照，将其置于37°C培养箱培养，2d，4d，6d分别取样，检测黄曲霉毒素的含量，3次重复实验。2. 7菌株鉴定基因组DNA的提取枯草芽孢杆菌37°C肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGABacterial DNA kit (D3350-01)试剂盒提取。 16S rDNA基因序列PCR反应上游引物AGAGTTTGATCATGGCTCAG,下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件94°C 5min ；94°C 45s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 30 个循环；72°C IOmin。测得的基因序列为CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAAC CGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA0序列的数据处理测序结果在美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)使用 Blast 比对。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌21-1-2 (Bacillus subtilis21-l_2)，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌21-1-2对黄曲霉菌具有拮抗作用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2012217。
2.一种从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 a.细囷分尚； b.曲霉的培养及孢子液的制备； c.抗曲霉菌株的筛选； d.抗曲霉菌株的复筛。
3.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤a进一步包 括称取土壤样品5 IOg,加入50 IOOml无菌生理盐水，润旋混勻I 3min,制成体积比为I : 10的悬液，分别用微量移液器吸取100 200 yl，涂布LB平板，37°C培养24 36h，挑取单菌落纯化。
4.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤b进一步包括将产毒黄曲霉菌和无毒黄曲霉菌接种到PDA斜面，28°C培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4 8ml已灭菌的0. 9%生理盐水，震荡后用血球计数板计数，并调至100 110/ml，4°C 保存。
5.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤c进一步包括移液枪取100 步骤b制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干；将步骤a分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个菌株做两个平行样，28°C培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。
6.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤d进一步包括用接种环取步骤c初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37°C, 190r/min发酵24 26h, 8000r/min离心10 20min,用一次性滤器过滤滤除菌体；移液枪取100 u I制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100 u 1.200U I滤液，100 u I生理盐水作为对照，置于28°C恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。
7.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，包含下述基因序列CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
8.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，采用如下方法进行鉴定时，包含下述基因序列 鉴定方法枯草芽孢杆菌37°C肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGA BacterialDNAkit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA; 16SrDNA基因序列PCR反应上游引物AGAGITTGATCATGGCTCAG，下游引物TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件94°C 5min ；94°C 45s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 30 个循环；72°C IOmin ； 测得的基因序列为CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
9.一种如权利要求1,7,8中任一项所述枯草芽孢杆菌在农产品对黄曲霉菌拮抗中的应用。
10.一种如权利要求1，7,8中任一项所述枯草芽孢杆菌在制备黄曲霉菌拮抗制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用。本发明枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌具有拮抗作用。本发明从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤a.细菌分离；b.曲霉的培养及孢子液的制备；c.抗曲霉菌株的筛选；d.抗曲霉菌株的复筛。通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。本发明应用于花生等农作物收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，能够提高出口花生等农作物的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物及其制品的出口贸易。
文档编号C12Q1/68GK102965306SQ20121044488
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者宫小明, 张艺兵, 孙军, 李建军, 马荣桧, 金超, 田国宁, 丁葵英 申请人:中华人民共和国潍坊出入境检验检疫局