专利名称：太空环境下的高效重组人干扰素α1b工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及生产重组人干扰素a Ib的工程菌，其制备的产物可广泛应用于临床医疗。
背景技术：
生物工程菌菌种传统的诱变处理方法主要包括以紫外线、X射线、Y射线、激光等作为诱变介质的物理诱变方法和以碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酸等为诱变介质的化学诱变方法，及以噬菌体、转座子为诱变介质的生物诱变方法。通过各种诱变手段改变菌体的遗传性状后，如何从数量庞大的菌体族群中筛选到特异性目标菌种，是育种上最重要也是最耗时费力的工作，筛选在一定程度上是决定菌种选育效率的关键步骤。在菌种选育中常用的随机筛选法是逐个检查、测定经诱变处理后的存活菌株的目标产物产量或其他性状。为加快筛选速度而采用诸如平皿快速检测法、形态变异的利用、计算机技术的应用等多种·方法，但是这些方法工作量大、周期长、随机性大、成本高。随着航天技术的发展，空间诱变为菌种改良提供了新的手段，对于筛选得到更多高效菌种具有独特的优势。空间生物制药是当代空间技术发展的产物。其基本原理是利用空间环境使相对呈漂浮伸展状态的生物染色体受到外界因素的冲击，引起碱基的缺失、置换或插入(如引起生物DNA大分子断裂，使双螺旋中的氢键断裂，或断裂后再交叉联接，或促使碱基降解)，从而改变基因内部原有的碱基及排列顺序，引起表型发生改变，产生新的遗传变异，返回后再经地面筛选，培养出高产、优质的生物新品种、新品系和效价高、品质优的生物制剂种子。重组人干扰素是一种常用的药物，在临床上应用十分广泛。干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。它与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，从而抑制病毒在细胞内的复制；可通过调节免疫功能增强巨噬细胞、淋巴细胞对靶细胞的特异细胞毒作用，有效地遏制病毒侵袭和感染的发生；增强自然杀伤细胞活性，抑制肿瘤细胞生长，清除早期恶变细胞等。因此，重组人干扰素可用于治疗某些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等。也可以用于治疗某些肿瘤，如毛细胞性白血病、恶性黑色素瘤、肾细胞癌、喉乳头状瘤、卵巢癌等。目前市场上的重组人干扰素价格还相对比较贵，必然增加患者就医的负担，如果提高生物工程菌的产能，其价格也会相应便宜，对于增强企业的竞争力和惠及患者，有着重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效重组人干扰素a Ib工程菌，提高了生物工程菌的产能，降低其生产成本。本发明提供的高效重组人干扰素a Ib生物工程菌菌株，其保藏号为CGMCCNO. 6632。所述的一种高效重组人干扰素a Ib工程菌菌株，电泳结果显示经过30°C诱导的该菌株目的蛋白的纯度与对照菌株的比较SDS非还原条件下为1. 28倍，SDS还原条件下为1. 37倍，SDS+Urea非还原条件为1. 35倍，SDS+Urea还原条件为1. 66倍。
具体实施例方式下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。重组人干扰素a Ib菌株经过神州八号搭载，2011年11月I日从地球出发，11月17日返回地面，共计空间飞行398小时，1100万公里。对返回地面的空间诱导后的重组人干扰素a Ib菌株进行筛选，获得6株太空环境下较高表达的重组人干扰素a Ib生物工程菌菌株，经实验验证最终确定有5株正向突变菌种的产生。具体实施实例一重组人干扰素a Ib空间环境菌种的分离空间环境育种流程平板分离一抗性平板初筛一试管复筛一诱导分析一第一轮表达筛选一第二轮表达筛选一获取高产菌株(I).抗性平板初筛结果取250 μ I IFNa lb_2LlA菌液接种于装有750 μ I生理盐水的试管中，混匀；再取100 μ I稀释后的菌液接种于装有900 μ I生理盐水的试管中，依次稀释至第5管，取100 μ I涂布于LB平板，37°C静止培养12-20hr。挑取300个单克隆，分别接种六块LB-Amp和LB平板。同时对应在无抗性培养基上对照接种。37°C静止培养5-7h。结果显示在抗性和非抗性平板均生长的阳性克隆为221株，占73. 7% ;仅在LB平板生长的阴性克隆数(抗性丢失)79 株，占 26. 3%。(2).第一轮电泳结果分析对抗性平板初筛结果阳性克隆中编号在前的144株(克隆号I至194)进行试管复筛和诱导表达后，再进行电泳检测和软件分析。根据IFNa Ib理论分子量19. 4KD，以及以往经验，按照Ml或者M2的分子量进行计算，以软件分析IFNa Ib条带的灰度及纯度，其中以灰度代表目的蛋白的总量，总灰度代表菌体总蛋白的量，纯度代表目的蛋白占菌体总蛋白的比例。选取每次电泳15个克隆中灰度或纯度最高的克隆用于下一轮检测，灰度及纯度最大值与次大值所对应的克隆号如表1，其中37、64、93是重复出现，合并后为26个克隆。电泳图见
图1。表I第一轮电泳灰度及纯度最大值与次大值所对应的克隆号
权利要求
1.一种太空环境下的高效重组人干扰素a Ib工程菌菌株，其保藏号为CGMCCNO. 6632。(填写正确的保藏号)
2.根据权利要求1所述的一种高效重组人干扰素aIb工程菌菌株，其特征在于该菌株在经过30°C诱导后目的蛋白的纯度与对照菌株的比较为SDS非还原条件下为1. 28倍，SDS还原条件下为1. 37倍，SDS+Urea非还原条件为1. 35倍，SDS+Urea还原条件为1. 66倍。
全文摘要
本发明涉及太空环境中的一种高效重组人干扰素α1b工程菌菌株。对重组人干扰素α1b空间搭载菌种进行平板分离、抗性平板初筛和试管复筛，然后进行诱导表达，再通过两轮SDS-PAGE分析获取高产菌株。将获得的太空环境下较高表达的重组人干扰素α1b基因工程菌菌株和原始菌株分别在30℃和37℃温度下诱导表达并进行比较，确定了正向突变菌株(克隆191)的产生。此种高效重组人干扰素α1b工程菌菌株的成功制备有利于干扰素的工业生产，造福人类健康。
文档编号C12N1/21GK102994438SQ20121044464
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者刘长庭, 刘金毅, 王雅娟, 徐晨, 方向群, 王俊锋, 刘桂东, 郭英华, 常德, 陆小冬 申请人:中国人民解放军总医院, 北京三元基因工程有限公司