专利名称：一种啤酒酿造用高温中性木聚糖酶xyna及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种啤酒酿造用高温中性木聚糖酶XYNA及其基因和应用。
背景技术：
在植物细胞壁中，半纤维素含量仅次于纤维素，是自然界中最丰富的可再生的生物质资源；是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-乳糖以直链或支链聚合而成的多糖，其结构与组成十分复杂。自然界中，木聚糖是生物材料中半纤维素的主要组成部分，是半纤维素中最丰富的一种。其广·泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸杆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用；而在造纸制浆过程中富含木聚糖的工业废料往往直接排入水体，导致水质富营养化从而严重破坏生态环境，这些现象在我国尤为突出。而另一方面，作为木聚糖水解产物主要成分的低聚木糖是一种附加值高，市场前景看好的功能性食品添加剂，目前已成为国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。因此对木聚糖的有效利用和深层开发已成为目前国内外的研究热点。近半个世纪以来，木聚糖酶由于其广泛的应用于饲料、食品，制浆造纸工业及能源领域，越来越来受到人们的关注。已经报道了多种来源于微生物的、具有不种功能的木聚糖酶。绝大多数真菌来源的木聚糖酶的最适PH值在偏酸或中性范围内。高温中碱性木聚糖酶在近十几年来引起了广泛的关注，其可用于水产动物的饲料中，可以有效破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用；木聚糖酶可以作为食品添加剂，具有其重要的应用价值，中性木聚糖酶能显著地改善面粉的粉质，明显地增加面包的体积和比容，同时可以改善面包心的弹性和硬度，减小面包皮的硬度，能增加面包的抗老化作用；此外，高温中碱性木聚糖酶可以有效的运用到制浆造纸工业，可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能。啤酒酿造过程中需在高温中性条件下利用葡聚糖酶和木聚糖酶处理大麦芽，将其中的葡聚糖和木聚糖进行降解，从而降低大麦芽粘度提高过滤速度。因此，所需的木聚糖酶需要在中性PH和高温条件下具有高活性。本发明中XynA最适pH6.0,在pH5.0-7.0之间还具有90%的酶活力，最适温度80°C，在90°C仍具有28%的酶活力。在酿酒麦芽模拟试验中能降低11.7%的粘度，提高35.6%的流速。相比目前报道的以及商用木聚糖酶都显示出良好的处理效果。另外，其在碱性条件下也具有较高活力，这些优良的酶学性质使其在啤酒酿造、食品、制浆造纸工业等领域具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的啤酒酿造用高温中碱性木聚糖酶。本发明的再一目的是提供编码上述高温中碱性木聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述高温中碱性木聚糖酶的基因工程方法。本发明的另一目的提供上述高温中碱性木聚糖酶的应用。本发明腐质霉(Humicola insolnsYlCGMCC4573)(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为=CGMCC N0.4573。)中分离得到一种新的高温中碱性木聚糖酶XYNA。本发明提供了一种高温中碱性木聚糖酶XYNA，其氨基碱序列如SEQ ID N0.1所示。SEQ ID N0.1:MHLASSLFLLATLPFGFAAGKGKGKGKDNSDVGLDVLAKKAGLKYFGAATDTPGQRERAGLEDKYPEYDRIMWHSPEFGSTTPTNGQKWLFVEPERGVFNFTE⑶VVASKARQHGKLLRCHALVWHSQLAPWVEETEWTPEELRKVIVDHITAVAGHYKGQCYAWDVVNEALNEDGTYRESVFYKVLGEEYIKLAFETAAKVDPKAKLYYNDYNLEWPSAKTEGAKRIVKLLKDAKIPIHGVGLQAHLIAEQHPTLDDHIAAIRGFTQLGVEVALTELDIRLKTPATEENLALQREAYKNVVGACVQVCGCVGVTIffDFYDPFSffVPYFFEGEGAPLLWFE DFSKHPAYYGVVEALTNKTRRSKRSISDRRAKLLA其中，该酶包括376个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“mhlasslfllatlpfgfa”(SEQ ID N0.3)。因此，成熟的高温中碱性木聚糖酶XYNA的理论分子量为40.4kDa，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示:AGKGKGKGKDNSDVGLDVLAKKAGLKYFGAATDTPGQRERAGLEDKYPEYDRIMWHSPEFGSTTPTNGQKWLFVEPERGVFNFTE⑶VVASKARQHGKLLRCHALVWHSQLAPWVEETEWTPEELRKVIVDHITAVAGHYKGQCYAffDVVNEALNEDGTYRESVFYKVLGEEYIKLAFETAAKVDPKAKLYYNDYNLEWPSAKTEGAKRIVKLLKDAKIPIHGVGLQAHLIAEQHPTLDDHIAAIRGFTQLGVEVALTELDIRLKTPATEENLALQREAYKNVVGACVQVCGCVGVTIWDFYDPFSWVPYFFEGEGAPLLWFEDFSKHPAYYGVVEALTNKTRRSKRSISDRRAKLLA本发明的木聚糖酶XYNA同时具有好的热稳定性而在常温下在碱性和中性的范围内均具有高活性等特性。本发明筛选到HumicolainsolensYlCGMCC4573所产生的木聚糖酶，其最适PH值为6.0，在pH5.0 9.0的范围内维持80%以上的酶活性；最适温度为80°C，60°C处理Ih酶活基本保持不变，70°C处理Ih后仍可剩余20%以上的酶活。本发明提供了编码上述高温中碱性木聚糖酶xynA。具体地，该基因的基因组序列如 SEQ ID N0.4 所示:atgcatctcgcttcgtcgctctttctgctcgccactctgcccttcggcttcgctgctggcaagggcaagggcaagggcaaggacaacagcgatgttggcctcgacgtcctggccaaaaaggctggtctgaagtacttcggtgccgccaccgacacgcccggccagcgggagcgcgccggtcttgaggataaatatcccgagtatgacaggatcatgtggcattcgcccgagttcggctcgaccacgcccaccaacggccagaagtggctgtttgttgagcccgagcgcggcgtcttcaacttcacagagggcgacgtcgttgcctccaaggcccgccagcacggcaagctgctgcgctgccacgctctcgtctggcacagccagctggctccctgggtcgaggagaccgagtggactccggaggagctgcgcaaggtcatcgtcgaccacatcaccgccgtcgccggccactacaagggccagtgctacgcctgggacgttgtcaacgaggcgctgaacgaggacggaacctaccgcgagagcgttttctacaaggttctcggcgaggagtacatcaagcttgccttcgagaccgccgccaaggtcgaccctaaggccaagctctactacaacgactacaacctcgagtggccctcggccaagacggagggcgccaagcgcatcgtcaagctcctcaaggacgccaagatccccatccacggcgtcggcctgcaggcccaccteatcgccgagcagcaccccacgctcgacgaccacattgccgccatccgcggcttcacccagctcggcgtcgaggtggctctcaccgagctcgacatccgcctcaagaccccggccaccgaggagaaccttgccctgcagcgcgaggcctacaagaacgtcgtcggcgcctgcgtccaggtctgcggctgcgtcggtgtcaccatctgggacttctatgatcccttcagctgggtcccctacttcttcgagggcgagggtgctcccctcctgtggttcgaggacttcagcaagcaccccgcctactacggcgtcgttgaggccctcaccaacaagactcgccgctcgaagcgcagcatttcggaccgccgggccaagctcctggcttaa本发明基于PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xynA，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNA结构基因xynA全长1131bp。其中，信号肽的碱基序列为:ATGCATCTCGCTTCGTCGCTCTTTCTGCTCGCCACTCTGCCCTTCGGCTTCGCT(SEQ ID N0.6)。成熟的木聚糖酶XYNA的基因序列如SEQ ID N0.5所示。SEQIDN0.5
gctggcaagggcaagggcaagggcaaggacaacagcgatgttggcctcgacgtcctggccaaaaaggctggtctgaagtacttcggtgccgccaccgacacgcccggccagcgggagcgcgccggtcttgaggataaatatcccgagtatgacaggatcatgtggcattcgcccgagttcggctcgaccacgcccaccaacggccagaagtggctgtttgttgagcccgagcgcggcgtcttcaacttcacagagggcgacgtcgttgcctccaaggcccgccagcacggcaagctgctgcgctgccacgctctcgtctggcacagccagctggctccctgggtcgaggagaccgagtggactccggaggagctgcgcaaggtcatcgtcgaccacatcaccgccgtcgccggccactacaagggccagtgctacgcctgggacgttgtcaacgaggcgctgaacgaggacggaacctaccgcgagagcgttttctacaaggttctcggcgaggagtacatcaagcttgccttcgagaccgccgccaaggtcgaccctaaggccaagctctactacaacgactacaacctcgagtggccctcggccaagacggagggcgccaagcgcatcgtcaagctcctcaaggacgccaagatccccatccacggcgtcggcctgcaggcccaccteatcgccgagcagcaccccacgctcgacgaccacattgccgccatccgcggcttcacccagctcggcgtcgaggtggctctcaccgagctcgacatccgcctcaagaccccggccaccgaggagaaccttgccctgcagcgcgaggcctacaagaacgtcgtcggcgcctgcgtccaggtctgcggctgcgtcggtgtcaccatctgggacttctatgatcccttcagctgggtcccctacttcttcgagggcgagggtgctcccctcctgtggttcgaggacttcagcaagcaccccgcctactacggcgtcgttgaggccctcaccaacaagactcgccgctcgaagcgcagcatttcggaccgccgggccaagctcctggcttaa成熟蛋白理论分子量为40.4kDa，将木聚糖酶基因xynA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定XYNA是一种新的木聚糖酶。本发明提供了包含上述高温中碱性木聚糖酶基因xynA的重组载体，选为pPIC-xynA。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xynA。本发明还提供了包含上述高温中碱性木聚糖酶基因xynA的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌，优选为重组菌株GS115/xynA。本发明还提供了一种制备高温中碱性木聚糖酶XYNA的方法，包括以下步骤:I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNA。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xynA。本发明还提供了上述高温中碱性木聚糖酶XYNA的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在酿造、食品、制浆造纸工业中应用新的木聚糖酶XYNA。本发明的木聚糖酶XYNA最适pH为6.0，在pH5.0 9.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本木聚糖酶可应用于水产饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可降解可溶性阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。此外，由于本木聚糖酶在碱性高温条件下有良好的稳定性，使得其可以应用于制浆造纸工业中，可以提高纸浆的白度和白度稳定性，改善纤维的滤水性和造纸性能。
图1重组木聚糖酶的最适pH。图2重组木聚糖酶的pH稳定性。图3重组木聚糖酶的最适温度。图4重组木聚糖酶的热稳定性。腐质霉Yl (Humicola insolens CGMCC4573)(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期:2011年I月25日)，其保藏号为:CGMCC N0.4573)
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体:本发明从腐质霉(Humicola insolens Y1CGMCC4573)(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为=CGMCC N0.4573)中分离得到一种新的高温中碱性木聚糖酶XYNA。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GSl 15购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基:(I)Humicola insolens Y1CGMCC4573 培养基为马铃薯汁培养基:IOOOmL 马铃薯汁，IOg葡萄糖，25g琼脂，pH自然。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH自然)。
(3) BMGY 培养基:1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB,0.00004%Biotin, 1% 甘油(V/V)。(4) BMMY培养基:除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH自然。
说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1腐质霉Humicola insolens Y1CGMCC4573木聚糖酶编码基因xynA的克隆腐质霉Humicola insolens Y1CGMCC4573分离于河北省森林土壤,最适生长温度45°C，pHS6.0。在PDA培养基培养3d后，菌落黑色，边缘有菌褶。分生孢子梗短，单生，呈暗色。分生孢子，单生，球形或亚球形，棕色。提取腐质霉Humicola insolens Y1CGMCC4573 基因组 DNA:将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解120min,每隔20min混匀一次，在4°C下13000rpm离心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于_20°C静置30min后，4°C下13000rpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2Pl:5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3'；P2:5’-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3’ 。以Humicola insolens Y1CGMCC4573 总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应参数为:94°C变性5min ;然后94°C变性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环后72°C保温lOmin。得到一约159bp片段， 将该片段回收后与pEASY_T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物:设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spI的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60 65°C。并将它们分别命名为uspl, usp2, usp3(上游特异性引物),dspl, dsp2, dsp3 (下游特异性引物)见表I。表1.木聚糖酶XYNATAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种高温中碱性木聚糖酶XYNA，其特征在于，其氨基碱序列如SEQ ID N0.1或SEQID N0.2 所示。
2.一种高温中碱性木聚糖酶xynA，其特征在于，编码权利要求1所述的高温中碱性木聚糖酶XYNA。
3.如权利要求2所述的高温中碱性木聚糖酶基因xynA，其特征在于，其碱基序列如SEQID N0.4 或 SEQ ID N0.5 所示。
4.包含权利要求2所述高温中碱性木聚糖酶基因xynA的重组载体。
5.包含权利要求2所述高温中碱性木聚糖酶基因xynA的重组载体pPIC_xynA。
6.包含权利要求2所述高温中碱性木聚糖酶基因xynA的重组菌株。
7.一种制备高温中碱性木聚糖酶基因xynA的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNA。
8.权利要求1所述高温中碱性木聚糖酶XYNA的应用。
9.权利要求1所述 高温中碱性木聚糖酶XYNA在酿酒中的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种啤酒酿造用高温中性木聚糖酶XYNA及其基因和应用，其氨基碱序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的木聚糖酶XYNA最适pH为6.0，在pH5.0～9.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。
文档编号C12N1/15GK103074317SQ20121044453
公开日2013年5月1日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者姚斌, 石鹏君, 王亚茹, 杜彦龙, 黄火清, 罗会颖, 杨培龙, 孟昆 申请人:中国农业科学院饲料研究所