专利名称：稳定表达荧光素酶的a549裸鼠模型及其建立与应用的制作方法
稳定表达荧光素酶的A549裸鼠模型及其建立与应用技术领域
本发明属于裸鼠模型及其建立与应用领域，特别涉及一种稳定表达荧光素酶的 A549裸鼠模型及其建立与应用。
背景技术：
肺癌是威胁我国人民健康的头号杀手。据卫生部发布的《2010年中国卫生统计年鉴》，我国2009年恶性肿瘤在所有疾病死亡原因中居首位，统计资料显示死亡率排名前十位的恶性肿瘤中，肺癌居首位，为我国的社会发展带来严重的经济负担。近年来，肺癌的治疗和基础研究取得了较大发展，但目前肺癌药物的基础和临床前研究尚欠缺一种能更方便的评估药物疗效的可靠的体内、体外研究平台，这严重制约了肺癌的基础和临床前研究。肺癌动物模型是肺癌研究的重要手段，移植性肺癌模型是目前临床前药物实验最常用的模型。 移植型肺癌模型是将人肺癌细胞移植到动物体内传代生长，移植的肿瘤细胞形态学特征、 染色体数量、同工酶水平等将保持不变，对临床抗癌药物敏感性也大致相同，移植型肺癌模型建立的常用方法是皮将肺癌细胞或组织块接种于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下(腋部、背部、后肢等)建立肺癌模型。此模型建模简单易行，成瘤率高，易监视肿瘤生长情况， 所以常用来作抗癌药物筛选的动物模型，同时该模型还具有动物来源方便、移植肿瘤细胞生长迅速、倍增时间短、耗费低等优点。但目前应用的移植型肺癌模型对药物疗效的评估多需采取解剖的方法进行评估，操作复杂，受人为操作的影响因素大，不便于临床前研究。如果能够建立一种整体可视化肺癌模型，能够直接进行体外成像·监测评估肿瘤的生长转移情况，可以对活体动物进行观察，将大大便利肺癌的临床前研究，同时也能减少人为因素的干扰，提高评估的准确性。
荧光素酶报告基因(Luc)的应用便利了肺癌整体可视化动物模型的构建。荧光素酶报告基因根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(Bacterial luciferase, BL)、萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase’FL)以及海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是由2个多肽亚基组成的异二聚体，相对分子质量约为79X 103。在还原性黄素(FMNH)、八碳以上长链脂肪醛(RCHO)和氧分子(O2)存在时，发射出蓝绿光(45(T490nm)。FL由单一的多肽链组成，相对分子质量为(60 64) XlO3, 在Mg2+、ATP、O2存在时催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧发光(55(T580nm)。萤火虫的荧光素_荧光素酶系统是最早建立的发光模型之一，该发光系统采用荧光素底物发光的形式，不需要激发光，具有较高的灵敏度，此外，萤火虫荧光素酶发出的光组织吸收少，有利于深部组织成像，并且光的强度与标记细胞数量呈线性相关。通过基因工程方法构建荧光素酶的真核表达载体并转染到癌细胞中，使其表达萤火虫荧光素酶，进而利用表达荧光素酶的癌细胞接种至动物即可构建整体可视化肿瘤模型，可通过体外成像的方法，对动物体进行活体观察而不损伤动物。
慢病毒感染较其他转染方式具有较强的优势，具有感染谱广、效率高、可感染非分裂细胞、并可使目的基因稳定整合至宿主基因组因而能够长期表达、免疫反应小等特点，是一种高效的基因转移工具。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定表达荧光素酶的A549裸鼠模型及其建立与应用，与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。
本发明的一种稳定表达荧光素酶的A549裸鼠模型，所述肿瘤模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌A549细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的A549细胞接种于小鼠构建而成。
本发明的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,包括
(I)以前期构建的携带有萤火虫荧光素酶基因的质粒为模板扩增出荧光素酶的cDNA，通过基因克隆的方法插入慢病毒真核表达载体PRRL-CMV质粒中，构建重组质粒 Luc-PRRL-CMV 表达质粒
设计萤火虫荧光素酶基因特异性引物
(该引物为上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG;下游引物CCTGTC GACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC)；
荧光素酶基因的克隆和慢病毒载体的构建使用该特异性引物PCR扩增萤火虫荧光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆载体中并转化大肠杆菌感受态细胞，质粒抽提后运用基因重组方法将荧光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表达载体PRRL-CMV空质粒中并转化大肠杆菌感受态细胞；
质粒抽提后进行双酶切和测序证实构建的表达载体的正确性；
(2)慢病毒感染方法将荧光素酶外源基因导入肺癌细胞株的步骤
大肠杆菌扩增荧光素酶慢病毒载体和慢病毒包装质粒，并纯化测定浓度；将
荧光素酶慢病毒载体的包装荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，用转染试剂共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清，确定慢病毒颗粒的滴度；
病毒感染以人肺腺癌A549为母细胞，用上述病毒上清进行感染；
扩增建系进行细胞亚克隆筛选，检测单克隆细胞内的荧光表达情况，筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；
(3)肿瘤皮下注射方法
将得到的重组人肺腺癌细胞经消化后重悬于氯化钠溶液中(200 μ 1)，在裸鼠皮下接种(2Χ IO6)该重组人肺腺癌细胞，监测细胞皮下增殖情况，即得到稳定表达荧光素酶的 Α549细胞株。
所述步骤(I)中的基因重组方法为酶切和连接；其中，酶切具体为采用Xba I和 Sal I双酶切。
所述步骤(2)中的荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒的质量比为1:3、 1:6 或 1:9。
所述慢病毒包装质粒包括第三代慢病毒复制所需要的三个基因gag、pol和rev。
所述步骤(2)中的转染试剂为MV40转染试剂。
所述步骤(2)中通过ELISA法确定慢病毒颗粒的滴度；通过细胞有限稀释法进行细胞亚克隆筛选；通过荧光测定仪或活细胞成像仪检测单克隆细胞内的荧光表达情况。
所述步骤(3)中的氯化钠溶液质量百分比浓度为O. 9%。
所述步骤(3)中通过游标卡尺测量和活体成像仪监测细胞皮下增殖情况。
本发明的裸鼠模型应用于观察肿瘤的生长情况和抗肿瘤药物的治疗效果。
所选用的动物除了裸鼠，也可以为SCID鼠。
有益.效果
本发明与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。
图IA为萤火虫荧光素酶Luciferase慢病毒载体示意图IB为质粒酶切鉴定图2为Luciferase慢病毒载体的包装；其中，A为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:3转染293T细胞，B为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:6转染293T细胞，C为目的基因质粒与慢病毒包装质粒按1:9转染293T细胞；
图3为包装后的慢病毒上清感染A549细胞72h ；
图4为稳定表达Luciferase的A549细胞单克隆筛选；其中，A为Luciferase活性定量分析(RLU)，B为活细胞成像；
图5为稳定表达Luciferase的A549细胞系生物学特性分析(划痕试验)；
图6为稳定表达Luciferase的A549细胞体内成瘤实验；其中,A为活体动物成像， B为活体动物成像定量分析，C为肿瘤生长曲线；
图7为稳定表达Luciferase的A549细胞体内成瘤实验；其中，A为治疗后第12 天活体成像，B为活体成像定量分析，C为治疗后不同天数肿瘤生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例I
步骤I.荧光素酶基因的克隆和慢病毒载体的构建
在设计萤火虫突光素酶(Firefly-Luciferase)基因特异性引物后，以携带 Luciferase基因质粒为模板(碧云天公司)，PCR扩增出Luciferase cDNA。将扩增的 Luciferase基因成功插入PCR-Blunt载体，转化感受态大肠杆菌细胞后质粒小抽，Xba I 和Sal I双酶切后割胶纯化回收Luciferase基因片段，将该片段与慢病毒真核表达载体 PRRL-CMV空质粒(Backbone)连接，转化感受态大肠杆菌细胞后质粒小抽，双酶切鉴定和测序结果均证明Luciferase-PRRL-CMV表达载体构建成功，经测序证实序列完全正确(约GAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA)(见图 I)，然后大规模抽提质粒，测定浓度后置_80°C备用。
步骤2.荧光素酶慢病毒载体的包装与病毒滴度测定
大肠杆菌扩增荧光素酶慢病毒载体和慢病毒包装质粒，并纯化测定浓度。
荧光素酶慢病毒载体用MV40转染试剂转染HEK293T细胞制备获得。
将Luciferase-PRRL-CMV质粒与慢病毒包装质粒分别按1: 3、1: 6、1:9转染293T 细胞，结果显示Luciferase-PRRL-CMV质粒与慢病毒包装质粒按1:6转染293T细胞效果最佳(见图2)。在转染48和72小时后收集293T细胞培养上清，离心去除细胞碎片后置_80°C 备用。用GFP-PRRL-CMV质粒载体作为阳性对照。HIV p24 ELISA法确定慢病毒颗粒的滴度。
步骤3.荧光素酶慢病毒上清感染肺腺癌细胞系
将人A549肺腺癌细胞在含10wt%小牛血清和lwt%双抗的高糖DMEM中传代培养。 取指数生长期肿瘤细胞，O. 25被％胰蛋白酶(含EDTAM^t精确计数后按2 X IO5个细胞/孔种植于六孔板，待细胞融合度达7(Γ80%时，稀释polybrene至培养基，使其终浓度为8 μ g/ ml，然后用荧光素酶慢病毒上清以最佳滴度感染A549肺腺癌细胞，同时用GFP慢病毒上清做阳性对照，分别在感染后48h、72h和96h用倒置荧光显微镜检测细胞内GFP表达情况，正常传代培养后用荧光测定仪和活细胞成像仪检测细胞内荧光素酶表达情况。以GFP为阳性对照，慢病毒上清感染A549细胞后48h即可观察到大部分细胞呈GFP阳性表达，72h增强增多，96h达最佳状态(见图3)，用该条件进行Luciferase-PRRL-CMV质粒转染得到的细胞可用于高表达突光素酶的稳转细胞株的筛选。
步骤4.稳定表达荧光素酶的肺腺癌细胞系的筛选和建立
用有限稀释法先在IOcm培养皿种植不同浓度的荧光素酶慢病毒感染后A549肺腺癌细胞，培养至单细胞克隆形成后，镜下挑取48个单克隆细胞至96孔板继续克隆培养 (每个单克隆细胞设复孔)，用荧光测定仪和活细胞成像仪分别检测48个单克隆细胞内荧光素酶的表达，选取荧光素酶表达强、细胞生长情况良好的细胞克隆(如图4中3号单细胞克隆)，并采用划痕试验证实细胞(luc-A549)较转染前生物学特性(增殖和迁移能力等)没有发生明显改变(见图5)，对稳定表达荧光素酶的A549细胞进行扩大培养，用于肿瘤模型的制作。
步骤5.稳定表达荧光素酶的肺腺癌细胞肿瘤模型的建立
将稳定表达荧光素酶的A549肺腺癌细胞(Luc-A549)培养于含10wt%小牛血清和 lwt%双抗的高糖DMEM中，37°C、5%volC02培养条件下传代扩增。取指数生长期肿瘤细胞，O.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，医用O. 9被％氯化钠溶液重悬，离心洗涤，精确计数后调整细胞悬液浓度备用。选取6 8周龄雌性Balb/c裸J小鼠皮下接种LUC-A549细胞(I X IO6个 /200μ1)。于SPF条件下正常饲养并定期观察体内成瘤情况。在接种后的第5、10、15、20、 25天用游标卡尺测量肿瘤的长轴(a)和短轴(b )，按公式V=O. 5 X ab2，计算肿瘤体积(mm3); 在接种后的第7、14、21天用小动物活体成像仪(德国BERTHOLD，NightOffL II LB983)检测体内肿瘤的发光强度(photon/sec/cm2/steridian),用O. 4%戍巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠，再按15mg/kg体重腹腔注射D-突光素钾盐(D-Luciferin Potassium Salt)工作液，10-15分钟后，将裸鼠仰卧于小动物活体成像仪载物台上进行图像采集和分析，可以观察到构建的表达Luciferase的A549细胞的C57BL/6J小鼠体内肿瘤的发光强度随生长天数逐渐增强，且肿瘤生长曲线显示肿瘤发光强度与肿瘤体积曲线正相关(见图6)。
步骤6.待构建的Luc-A549 C57BL/6J小鼠肿瘤模型肿瘤体积达IOOmm3左右将动物随机分组用于药物治疗。
分组治疗如下(1)生理盐水对照组；(2) Gemcitabine组(腹腔注射,60mg/kg裸鼠，每三天注射一次)。各组持续治疗3周，分别在治疗的第3、6、9、12、15天测量肿瘤体积， 并在第12天用活体成像仪检测肿瘤的发光强度，以此确定肿瘤的生长和药物治疗效果。活体成像定量分析结果显示，对照组和治疗组间肿瘤的发光强度不同，且与治疗后不同天数肿瘤生长曲线正相关,说明A549细胞荧光素酶肿瘤模型能够用来反映抗肿瘤药物的治疗效果(见图7)。
权利要求
1.一种稳定表达荧光素酶的A549裸鼠模型，其特征在于所述裸鼠模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌A549细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的A549细胞接种于小鼠构建而成。
2.—种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,包括(1)设计萤火虫荧光素酶基因特异性引物；使用该特异性引物PCR扩增萤火虫荧光素酶基因并克隆至PCR-Blunt克隆载体中并转化大肠杆菌感受态细胞，质粒抽提后运用基因重组方法将荧光素酶目的基因片段插入慢病毒真核表达载体PRRL-CMV空质粒中并转化大肠杆菌感受态细胞，质粒抽提后进行双酶切和测序证实构建的表达载体的正确性；(2)大肠杆菌扩增荧光素酶慢病毒载体和慢病毒包装质粒，并纯化测定浓度；将荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒混合后，用转染试剂共转染293T细胞，以产生含有萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒的上清，确定慢病毒颗粒的滴度；以人肺腺癌A549为母细胞,用上述病毒上清进行感染；进行细胞亚克隆筛选，检测单克隆细胞内的荧光表达情况，筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；(3)将得到的重组人肺腺癌细胞经消化后重悬于氯化钠溶液中，在裸鼠皮下接种该重组人肺腺癌细胞，监测细胞皮下增殖情况，即得到稳定表达荧光素酶的A549细胞株。
3.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549细胞株的建立方法,其特征在于所述步骤(I)中的特异性引物为上游引物CCTTCTAGAATGGAAGATGCCAAAAACATTAAG ；下游引物CCTGTCGACTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTTC ；基因重组方法为酶切和连接；其中，酶切具体为采用Xba I和Sal I双酶切。
4.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步骤(2)中的荧光素酶慢病毒表达载体与慢病毒包装质粒的质量比为1:3、1:6 或 1:9。
5.根据权利要求2或4所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法， 其特征在于所述慢病毒包装质粒包括第三代慢病毒复制所需要的三个基因gag、pol和revo
6.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步骤(2)中的转染试剂为MV40转染试剂。
7.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步骤(2)中通过ELISA法确定慢病毒颗粒的滴度；通过细胞有限稀释法进行细胞亚克隆筛选；通过荧光测定仪或活细胞成像仪检测单克隆细胞内的荧光表达情况。
8.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步骤(3)中的氯化钠溶液质量百分比浓度为O. 9%。
9.根据权利要求2所述的一种稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的建立方法,其特征在于所述步骤(3)中通过游标卡尺测量和活体成像仪监测细胞皮下增殖情况。
10.一种如权利要求I所述的稳定表达突光素酶的A549裸鼠模型的应用,其特征在于 所述肿瘤模型应用于观察肿瘤的生长情况和抗肿瘤药物的治疗效果。
全文摘要
本发明涉及一种稳定表达荧光素酶的A549裸鼠模型及其建立与应用，所述裸鼠模型通过采用基因重组技术和慢病毒感染将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌A549细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的A549细胞接种于小鼠构建而成。本发明与传统的肿瘤模型药物效果检测方法相比，观察更加直观方便，并且可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/867GK102936600SQ20121044433
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者房健民, 周爽, 杨洋, 李栋 申请人:同济大学苏州研究院