专利名称：一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种检测CLLUl基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
慢性淋巴细胞白血病(Thechronic lymphocytic leukemia upregulated, CLL)是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，以淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征。CLL是成人最常见白血病之一，约占所有白血病的四分之一。CLL在西方国家发病率较高，男性发病率可达3/10万人口以上，女性也接近2/10万人口，但在我国、日本及东南亚国家发病率较低。CLL是一种成年人的疾病，但是，在极少数情况下，它可以发生在青少年中，偶见于儿童。新诊断的CLL患者大多数(>75%)为50岁以上，多数是男性。CLL患者是一 个异质性群体，在发病的形式、疾病进展、治疗反应和生存期方面具有明显的个体差异。近年来Buhl等人通过差异显示的方法发现了位于12q22区域的新基因慢性淋巴细胞白血病上调基因I (CLL upregulated gene 1，CLLU1)在CLL细胞中呈特异性表达。CLLUl基因被认为是最新的CLL的预后指标，该基因对于CLL显示出具有特异性，CLLUl基因转录产物仅见于CLL细胞中，CLL细胞的CLLUl基因表现出高度的表达水平。目前，对于CLLUl基因的具体功能尚不完全清楚，经研究表明，这种基因的高度表达与治疗时间长短以及70岁以下的患者总生存期低密切相关，且CLLUl基因表达水平与已知CLL不良预后因素有密切关系。CLLUl基因表达可以显着提高其他技术，如FISH (荧光原位杂交)、IgVH突变分析、⑶38和ZAP-70，特别是IgVH突变，来评估CLL患者预后的价值。目前可用探针杂交法、质谱法、定性PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)法、基因测序法和流式细胞术等方法对CLLUl基因定量的表达进行检测。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；基因测序法的敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作繁琐，耗时长；流式细胞术涉及多环节，操作复杂，分析报告带有一定的主观性；定性PCR法具有特异性强和灵敏度高等优点。但实时荧光定量PCR技术实现了 PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测慢性淋巴细胞白血病中的CLLUl基因的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测CLLUl基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下本发明所提供的检测AMLl-ETO融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括CLLUI基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中
CLLUl基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；CLLUl基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；CLLUl基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合 液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。进一步地，所述CLLUl基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CLLUl基因的总RNA样品。具体地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl2 4uL,10X逆转录酶缓冲液 L，IOmmoI/L dNTP 2 y L，RNA 酶抑制剂 0. 5 y L，Oligo (dT) 150. 5 y g，AMV逆转录酶 I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 ii L。具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为1X的PCR预混合液(原液为 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
0.2U/ ii L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶以及无RNase去离子水。本发明试剂盒的优点和效果如下(I)敏感性高可重复敏感度为0. 01%,即10000个细胞中有一个含CLLUl基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由弓I物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确、定量检测CLLUl基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于慢性淋巴细胞白血病的治疗及预后评价，为慢性淋巴细胞白血病的制定治疗方案及预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图IA是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图IB是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增I. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；
图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增
I.OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例I.试剂盒的制备I、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列和CLLUl基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157.4;AML1基因ID分别为574028，参考序列号为NC_000012. 11)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①RNA 提取试剂Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596_026/100ml)，每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂快速提取慢性淋巴细胞白血病患者骨髓组织RNA。②cDNA 第一链合成试剂盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/LMgCl2 4u L, IOX 逆转录酶缓冲液 2u L, I Ommo I/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)0. 5 u L, Oligo (dT) 15 0. 5 u g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积 11 U L0③引物、探针和标准品包括CLLUl基因引物、内参基因ABL弓丨物、内部阳性控制序列引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下CLLUl基因上游引物序列为5’ -GGCTTGTTTTGAGGATGTTCAAC-3’(序列表中序列
I);CLLUl基因下游引物序列为5’-TCTGCGGCAGGTCTGTAAATAG-3，(序列表中序列2);CLLUl 基因 Taqman 荧光探针序列为FAM 5 ’-AATGCTCCTITCAITCC-3 ’ TAMRA (序列表中序列3)；
内部阳性控制序列为5’ GGCUUGUUUUGAGGAUGUACAUCAAAUGCUGCUAUCAUUCCUCUUAUUACAGACCUGCCGCAGA-3，(序列表中序列 7)；内部阳性控制序列上游引物序列为5’-GGCTTGTTTTGAGGATGTACATC-3’(序列表中序列8)；内部阳性控制序列下游引物序列为5’ -TCTGCGGCAGGTCTGTAATAAG-3’(序列表中序列9)；内部阳性控制序列Taqman 荧光探针TET 5’ -AATGCTGCTATCAITCC-3’ TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列为5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列为5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 荧光探针序列为FAM 5’-TGGTGTGAAGCCC-3’TAMRA (序列表中序列6)。其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的CLLUl基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列、Taqman荧光探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有CLLUl基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例I中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂=Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有CLLUl基因的慢性淋巴细胞白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。⑤CLLUl基因荧光定量PCR混合液由荧光定量PCR混合液和检测CLLUl基因的引物、探针组成1X的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)、
2.5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶、0. 25pmol/y L的CLLUl基因上游引物(序列表中序列I)、
0.25pmol/ ii L的CLLUl基因下游引物(序列表中序列2)、0. 3pmol/ ii L的CLLUl基因Taqman荧光探针(序列表中序列3)、0. 25pmol/uL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/uL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 U L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA),其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 u L。⑥ABL基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ u L的UNG酶、0. 25pmol/u L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列4)、
0.25pmol/ ii L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ ii L的ABL基因Taqman荧光探针(序列表中序列6)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加A ABL基因标准品模板2 ii L,反应总体积通常为20 ii L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的Taq酶和0. 01-0. 05U/ U L的UNG酶、0. 25pmol/uL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/u L的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/y L的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 U L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)， 其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 u L。3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例I制备的试剂盒检测CLLUl基因mRNA的表达量以检测30例慢性淋巴细胞白血病患者骨髓组织标本结果为例。用实施例I提供的本发明的试剂盒检测CLLUl基因mRNA表达量的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床慢性淋巴细胞白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示),然后再配制CLLUl基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算CLLUl基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为A Ct值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①慢性淋巴细胞白血病患者骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提慢性淋巴细胞白血病患者骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0. 1%DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取2 ii L上述RNA提取液，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4uL,10X逆转录酶缓冲液 2iiL，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制剂 0. 5 y L，Oligo (dT) 15 0.5iig 和AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 ii L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 y L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I ii L浓度为2 U g/ml内部阳性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保温IOmin,随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24ii L，IOX 逆转录酶缓冲液 L，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制剂 0. 5 y L，Oligo (dT) 15 0. 5 ii g和AMV逆转录酶I. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 y L，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶，加20 ii L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。
取I ii L浓度为2 U g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl2 4 u L, IOX逆转录酶缓冲液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制剂 0. 5 u L, Oligo (dT) 15 0. 5 y g 和 AMV逆转录酶I. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 ii L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 y L无菌水混匀置冰箱-20°C保存。③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例I提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图IA和图IB所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。④CLLUl基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20iiL:含IXPCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2 XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，CLLUl 基因上游引物终浓度0. 2mol/L、CLLUl基因下游引物终浓度0. 2 y mol/L, CLLUl基因Taqman荧光探针终浓度0. 3 u mol/L,被测样品RNA反转录合成的cDNAl. 0 u L，同时加入内部阳性控制序列上游引物终浓度为0. 2 y mol/L、内部阳性控制序列下游引物终浓度为0. 2mol/L、内部阳性控制序列Taqman荧光探针浓度终浓度为0. 3 U mol/L和终浓度为0. 2 U mol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA (②中反转录合成的cDNA)，加入超纯水至总体积20 ii L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后950C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物终浓度均为0. 2 ii mol/L, ABL基因的Taqman荧光探针终浓度0. 2 y mol/L, ABL基因cDNAl. OuL,加入无RNase去离子水补至总体积20 y L。在Iightcycler突光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s, 60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. 0 u L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，CLLUl 基因上、下游引物终浓度均为0. 2 ii mol/L, CLLUl基因Taqman荧光探针终浓度0. 3 ii mol/L,阳性对照RNA反转录合成的cDNA LOuL或者阴性对照去离子水I. 0 y L，加入无RNase去离子水补至总体积20 ii L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin
预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，
如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。
当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出CLLUl
基因相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于0. 0001为阳
性，小于0. 0001为阴性(具体参见表I)表I为荧光定量PCR分析基因CLLUl在慢性淋巴细胞白血病中的表达
Icllui 模板 Iabl 模板 Icllui/abl
慢性淋巴细胞白血病~ 1443562299888413~ 0. 00481
慢性淋巴细胞白血病~43065213277622201 0. 15512
慢性淋巴细胞白血病~46781199256600473~0. 18231
慢性淋巴细胞白血病~ 29783451309114921 0. 09635
慢性淋巴细胞白血病~ 9957811300199203~ 0. 03317
慢性淋巴细胞白血病~43007892336098231 0. 12796
慢性淋巴细胞白血病~40776245308799237~0. 13205
慢性淋巴细胞白血病~ 98764555210834577~ 0. 46845
慢性淋巴细胞白血病~ 21873341308067623~ 0. 07100
慢性淋巴细胞白血病~44907633289993310~0. 15486
慢性淋巴细胞白血病~ 31455376094234~ 0. 00008
慢性淋巴细胞白血病~ 31056783401843447~ 0. 07729
慢性淋巴细胞白血病~ 28374303741563~ 0. 00009
慢性淋巴细胞白血病~ 259234330972300~ 0. 00078
慢性淋巴细胞白血病~ 21922311298993~ 0. 00007
慢性淋巴细胞白血病~ 3476814318999034~ 0. 01090
慢性淋巴细胞白血病~ 9856538301787623~ 0. 0326权利要求
1.一种检测CLLUl基因mRNA表达量的试剂盒，包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括CLLUl基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中 CLLUl基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所不； CLLUl基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所不； CLLUl基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQIDN0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述CLLUl基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有CLLUl基因的总RNA样品。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/LMgCl2 4μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV逆转录酶I. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明涉及一种检测CLLU1基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域，所述试剂盒包含检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括CLLU1基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。CLLU1基因的高度表达与慢性淋巴细胞白血病治疗时间长短以及患者总生存期低密切相关，且CLLU1基因的表达水平与已知慢性淋巴细胞白血病不良预后因素有密切关系。采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR技术检测CLLU1基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明实施例提供的试剂盒为预测慢性淋巴细胞白血病的预后以及化疗方案的确定提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号C12Q1/68GK102965432SQ20121044362
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年9月29日
发明者李艳, 童永清 申请人:李艳, 童永清