专利名称：一种文昌鱼细胞内信号传导蛋白及其表达基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种文昌鱼细胞内信号传导蛋白及其表达基因与应用，特别是一种海洋模式生物文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
Smads蛋白是近年发现的细胞内信号传导蛋白，它在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用。转化生长因子(TGF-β)是由一类结构和功能相关的多肽生长因子亚家族组成，广泛存在于各种生物中，具有广泛的生物学功能，如调节细胞增殖、分化、迁移、粘附，参与早期胚胎发生和器官发育，促进细胞外基质形成，创伤修复、骨的形成和重建等，另外在调节免疫和内分泌方面也起着重要的作用。TGF-β作为配体形成的受体复合物，激活Smads进入核内，共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。有目的地调控和干预Smad信号转导途径，有助于促进对创伤愈合与胚胎发育的理解，加深对肿瘤发生、发展的认识等。Smad家族成员有3种受体活化型或通路限制型Smad (receptor-associatedSmads, R-Smad),共同通路型 Smad (co-operating Smads, Co-Smads)和抑制型 Smad(inhibitory Smads, Ι-Smads)。R-Smad 包括 BMP 下游的 Smadl、Smad5、Smad8 和 TGF β 及 activin 下游的 Smad2 和Smad3。他们都包含2个保守的Mad结构域(Mad-homology, MH),位于N-端的MHl domain和C-端的MH2domain，并通过连接区形成球状结构。MHl是小DNA结合域，MH2负责与受体结合、反式激活及同聚化/异聚化。位于MHl和MH2之间可变的连接区富含Pro并具有serine/threonine磷酸化潜能。R-Smad通过T β RI的磷酸化主要发生在C端保守的SS (M/V) S motif中的2个丝氨酸中。R-Smad通过膜集合胞质蛋白SARA( Smad Anchor forReceptor Activation)聚集到T β RI。未被憐酸化的R-Smad被SARA或endofin运回细胞质中。通过T β RI的磷酸化,R-Smad与Co-Smad,如Smad4形成异构复合物。TGF β家族受体下游的Smad通路中Co-Smad作为聚集点,使R-Smad复合化。R_Smad/Smad4复合物通过胞质蛋白importin定位到细胞核中。复合物作为转录因子直接或通过其他DNA结合蛋白结合到DNA上。一旦进入细胞核，磷酸化的R-Smad/Co-Smad复合物通过MHl结构域与DNA上的 SBEs (Smad-binding elements)结合。Smad3/Smad4 通过 5bp 序列(CAGAC)结合到DNA上，而Smad4、Smadl、Smad5和Smad8则识别不同的富含GC的基序。尽管Smad复合物与DNA的结合力很低，但对Smad靶基因的转录激活是必须的；这就需要与其他转录因子的额外相互作用形成大的转录复合物从而与染色质具有较强的附着力。Smad2的MHl中的30个氨基酸的插入片段使其不能结合到DNA上。Smad2需要Fast家族的核DNA结合蛋白与DNA结合，并通过Smad4的辅助激活转录以应答TGFP和activin。利用生物信息学手段我们在文昌鱼中找到一种R-Smad ;而在脊椎动物的该通路中通常具有2个R-Smad (Smad2和Smad3)，分工更细。我们对上述基因进行了分离，并发现细菌冲击后Bb-Smad2基因转录发生上调，这说明TGF β -SMAD信号通路很可能参与了免疫应答。文昌鱼既具有脊椎动物的基本特征，又具有许多无脊椎动物的特征。深入开展文昌鱼免疫系统的研究不仅有助于阐明脊椎动物和人类免疫性的起源和进化，更可以与其它海洋生物进行纵向比较，帮助找到海洋生物特异的防御机制，认识和阐明海水养殖动物免疫防御机制对病原感染应答的规律，为海水养殖动物的病害控制提供解决方法，为病害的免疫防治技术提供理论依据。从而为我国海水养殖业的健康、持续发展提供有力的保障和促进。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种文昌鱼细胞内信号传导蛋白及其表达基因与应用。术语说明 I. PCR技术链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。2.⑶D分析软件NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。本发明的技术方案如下一种海洋模式生物文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因，核苷酸序列如SEQID No. I所示。一种海洋模式生物文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。一种重组载体，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。该重组载体由pEASY_T3载体插入SEQ ID NO. I所示核苷酸序列获得,该表达载体购自德国Novagen公司。一种重组大肠杆菌，转入了 SEQ ID No. I所示核苷酸序列或上述重组载体。上述文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因、重组载体或重组大肠杆菌在制备海水养殖免疫防治药物中的应用。有益效果本发明从模式动物青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)中克隆了文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因并利用该基因表达了细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3。经验证其在成体文昌鱼各组织中广泛分布，在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，从而揭示了其在先天免疫中的作用。本发明所述的表达基因有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的细菌防治药物奠定基础，并可为海水养殖动物的病害控制提供新思路，为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。
图I.青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)成体总 RNA 提取的电泳图；其中左侧泳道、DNA分子量标记(marker)，右侧泳道、青岛文昌鱼成体总RNA ；
图2.通过PCR扩增克隆的编码文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3基因片段的电泳图；其中左侧泳道、DNA分子量标记(marker)，右侧泳道、扩增的DNA片段；图3、文昌鱼不同组织中细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3表达量的柱状图；图4、革兰氏阳性 、阴性细菌冲击成体文昌鱼后细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3表达量的柱状图。
具体实施例方式下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例I青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3编码基因的克隆I. I青岛文昌鱼总RNA的的提取(提取步骤参照Takara公司的相关试剂盒说明书)I)将IOOmg新鲜组织(文昌鱼成体)剪碎放入预I. 5mlep管中。2)加入ImlTrizol试剂,用研磨件快速研磨组织至无大的组织块,室温静置5min,使组织充分裂解。此时样品可放入-80°C长期保存。3)每ImlTrizol试剂加入O. 2ml的三氯甲烷(氯仿)，加盖封严，剧烈震荡15s，室温静置15分钟。4)4°C,1000g,离心15min。此时样品分为三层下层的红色有机相，中间层及上层水相，RNA即留在上层水相中。5)将上层水相转移如一干净的离心管中。6)在水相中按O. 5ml异丙醇/ImlTrinzol加入异丙醇，混勻，室温放置5min_10mino7)4°C，12000g，离心lOmin，弃上清。RNA沉淀在管底呈凝胶状。8)按lml75%乙醇(DEPC水配制)/ImlTrizol试剂加入75%乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。9) 4°C, 8000g,离心 5min,弃上清。10)室温晾干或真空干燥5-10min。11)用50 μ IDEPC水或TE缓冲液溶解RNA，进行下一步实验或在_70°C冰箱。得到的成体文昌鱼总RNA经lwt%琼脂糖凝胶电泳检测，没有发生降解，结果如图I所示。I. 2cDNA第一链反转(合成步骤参照TIANGEN公司的相关试剂盒说明书)以文昌鱼组织中提取的RNA为模板反转cDNA第一链，按以下顺序及量力口入 200μ1ΕΡ 管中25mM MgCl2，4y I ;10Xbuffer，2y I ;dNTP, 2μ I ;RNaseinhibitor, 0. 5 μ I ；AMV 反转录酶 0. 6 μ I ；01igoT primer, I μ I ;模板，8 μ I ；ddH20 2 μ I ；共 20μ 1，42°C，50 分钟；经PCR扩增，制得第一链cDNA。I. 3利用PCR进行基因序列扩增以第一链cDNA为模板，做PCR扩增，PCR扩增引物如下
BbSmad2/3-F :CCTGGAAAAGCGATGACGTCTATGC，和BbSmad2/3-R CGACATTACGACATGCTCGAACACG 为引物；PCR反应条件为98°C，5分钟；然后94°C，O. 5分钟；55°C，I. 5分钟；72°C，2分钟，35个循环后，72 °C，延伸10分钟。对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1400bp的DNA片段。然后用TIANGEN公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。结果如图2所
/Jn ο实施例2基因序列测定2. I. DNA片段与克隆载体连接将回收DNA片段连接到Transgene公司的pEASY_T3载体上。连接反应体系连接载体酶混合物1μ 1，外源DNA片段4μ 1，手指轻弹离心管，混匀样品，离心2秒钟，把样品集中在管底，37°C连接5分钟。2. 2.按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5 α感受态。2. 3.按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体PEASY-T3转至大肠杆菌DH5a感受态。2. 4.转化的大肠杆菌DH5 a涂于含100 μ g/L氨苄青霉素的麦康凯琼脂培养基，37 °C过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用T7和SP6作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段；T7和SP6的引物序列如下Τ7 TAATACGACTCACTATAGGGSP6:ATTTAGGTGACACTATAG2. 5.将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海博尚生物技术公司测序。因此，获得青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO. I所示。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个1359bp的编码青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的开放阅读框架，共编码452个氨基酸，氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。实施例3青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3成体表达模式研究3. I青岛文昌鱼新鲜成体组织/器官(鳃、肝盲囊、肠、表皮、肌肉、卵巢、精巢)RNA的提取。具体步骤同1.1。3. 2cDNA第一链反转。具体步骤同I. 2。3. 3Real_Time PCR将10 μ I SYBR Premix Ex Taq (2χ)，O. 4 μ I PCR Forward Primer (10 μ M), 0. 4 μ IPCR Reverse Primer (10 μ Μ)，2 μ I DNA template (成体文昌鱼免疫冲击前后各组织 cDNA)和 6. 8 μ I Sterilized ddH20 混勻，微离心。按照如下程序运行real-time PCR 95°C 30s，I 个循环一95°C 5s,60°C 30s，40 个循环—95Γ 15s,60°C lmin,95°C 15s，I 个循环。3. 4对PCR产物浓度作定量分析，发现细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3在成体文昌鱼的肝盲囊(HC)、表皮(Epi)、肌肉、鳃、肠、卵巢和精巢中都有不同程度的表达。并且在鳃中表达量很高,约为同组织中细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的3倍，如图3所示。实施例4青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3免疫冲击前后表达模式研究4. I免疫冲击将成体文昌鱼(Branchiostoma belcheri )培养在IO7大肠杆菌(Ε· coli)或金黄色葡萄球菌(S. aureus)PBS溶液中。等量PBS溶液作为对照。第0，2，4，8，12和24小时取适量文昌鱼进行组织分离。4. 2组织进行RNA提取。具体步骤同I. I。·
4. 3cDNA第一链反转。具体步骤同I. 2。4. 4Real-Time PCR0 具体步骤同 3. 3。4. 5对PCR产物浓度作定量分析，分析结果显示细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3在大肠杆菌冲击2h后转录持续升高；到12h时约为正常水平的3倍。冲击24h时转录水平降低，但仍高于正常状态的转录水平。金葡菌冲击后细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达变化与大肠杆菌冲击后的应答模式相似，如图4所示。实验结果显示青岛文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3在成体文昌鱼各组织中广泛分布以及在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，从而揭示该表达基因在先天免疫中发挥作用的可能。
权利要求
1.一种海洋模式生物文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因，核苷酸序列如 SEQ ID No. I 所示。
2.一种海洋模式生物文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
3.一种重组载体，插入了 SEQ ID NO. I所示核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的重组载体，该重组载体由pEASY-T3载体插入SEQID NO. I所示核苷酸序列获得。
5.一种重组大肠杆菌，转入了 SEQ ID No. I所示核苷酸序列或含有权利要求3所述的重组载体。
6.权利要求I所述文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因、权利要求3所述重组载体或权利要求5所述的重组大肠杆菌在制备海水养殖免疫防治药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种文昌鱼细胞内信号传导蛋白及其表达基因与应用，文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该文昌鱼细胞内信号传导蛋白BbSmad2/3，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述的表达基因有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的细菌防治药物奠定基础，并可为海水养殖动物的病害控制提供新思路，为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。
文档编号C12R1/19GK102911944SQ201210441929
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者冯力骏, 张妍, 孔雨, 张长青, 闫杰, 王建峰, 刘欢欢, 荆韧威, 李开霖, 刘凯兴, 董璇 申请人:山东大学