一种检测过氧化氢的荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种新响应基团、选择性好的近红外染料荧 光探针，其合成方法及其在检测细胞内过氧化氢的应用，属于检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞内绝大部分过氧化氢是由线粒体呼吸链产生，首先氧气(02)被还原生成02'， 随后〇 2 '经超氧化物歧化酶(SODs)的歧化作用转变成过氧化氢。
[0003]在生物体中，过氧化氢是一种主要的活性氧，在细胞信号传导过程中扮演重要的 角色。过氧化氢不仅能产生其他活性氧，而且是其他活性氧发生氧化反应时的产物。细胞受 至_激会产生活性氧爆发，这会影响到几类能调控细胞增殖和凋亡的信号蛋白，例如激活 细胞有丝分裂的蛋白激酶家族(MAP)、转绿因子l(AP-l)、蛋白质络氨酸磷酸酶(pTps)、离子 通道和G蛋白。过氧化氢在细胞中的生物化学作用非常复杂，现在普遍认为过氧化氢是细胞 信号传导的第二信使分子，细胞内R0S尤其是过氧化氢含量的相对稳定是维持细胞活性所 必需的，因此过氧化氢在信号通路中起着非常重要的作用。
[0004]许多与人类衰老相关的疾病，比如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病均与氧化应 激有关，氧化应激是活性氧不受调控过量产生的结果，而细胞内氧化还原化学反应的紊乱 会进一步损害组织和器官。在机体中，过氧化氢是一种主要的氧代谢产物，也是氧化应激的 标志物。因此，准确检测细胞内过氧化氢的含量是非常重要的。
[0005]目前，过氧化氢的检测技术有荧光法、电化学法、生物发光法、化学发光法等。荧光 法由于其操作简单、灵敏度高等优点受到了越来越多的关注。
[0006] 近年来，用于检测过氧化氢的大多数探针是以硼酸(Naama Karton_Lifshin，Ehud Segal ,Liora Omer,Moshe Portnoy ,Ronit Satchi-Fainaro, and Doron Shaba , J.Am.Chem.Soc.,2011,133,10960-10965；Lin Yuan,ffeiying Lin,Sheng Zhao,ffensha Gao，Bin Chen,Longwei He,and Sasa Zhu,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,13510-13523)或硼 酉爱酯（Duangkhae Srikun,Evan ff.Miller,Dylan ff.Domaille,and Christopher J.Chang, J.Am.Chem.Soc.,2008,130,4596-4597；Dickinson,B.C.；Huynh ,C.；Chang ,C.J., J · Am. Chem · Soc · , 2010,132,5906)作为过氧化氢的响应基团，但是已有文章 （Thomas F. Brewer ,Francisco J. Garcia, Carl S.Onak,Kate S. Carroll,and Christopher J · Chang, Annu · Rev · Biochem· , 2015,84: 765-790 ·)报道，0N00-会对这类响应基团造成干 扰，另外近几年发表的几篇文章 （Sikora A，Zielonka J，Lopez M，Joseph J，Kalyanaraman B,Free Radic.Biol.Med.,2009,47:1401-7；Zielonka J,Sikora A,Hardy M,Joseph J, Dranka BP,Ka1yanaraman B.,Chem.Res.Toxicol.,2012,25:1793-99；Ji Zhou,Yang Li , Jiaoning Shen,Qiang Li ,Rui Wang,Yufang Xuand Xuhong Qian,RSC Adv.,2014,4, 51589-51592)中详细的介绍了以硼酸或硼酸酯作为响应基团的探针也能与ONOO'CKT发生 反应并引起探针荧光的变化，而且与0Ν00-的反应速度要远远快于与过氧化氢反应的速度。 因此，以硼酸或硼酸酯作为响应基团的探针对过氧化氢的选择性尚待提高。
[0007]另外，TetsuoNagano利用一种新的响应基团设计合成了一种过氧化氢焚光探针 (Masahiro Abo ,Yasuteru Urano，Kenjiro Hanaoka, Takuya Terai,Toru Komatsu, and Tetsuo Nagano, J.Am.Chem. Soc. ,2011，133,10629-10637)，虽然该探针具有灵敏度高的优 点，但是ONOO'TBHP会对探针造成不同程度的干扰，并且该探针的激发发射波长不在近红 外，不能用于活体成像。
[0008] 总的来说，以上探针都存在选择性不好的问题，而且大多数探针的激发发射波长 不在近红外，这会限制探针在生物体中的应用。
【发明内容】
[0009] 为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测过氧化氢的荧光探针及其制备方 法和应用，设计了合成了一种新的过氧化氢近红外荧光探针，成功的提高了探针对过氧化 氢的选择性，并应用到生物体成像中。
[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0011] -种检测过氧化氢的荧光探针，其结构式如下：
[0012]
[0013] 其中，Ri-Ife中任意1个或2个为吸电子基团。
[0014] 本发明的荧光探针响应基团新颖、选择性好、灵敏度高;该探针激发发射波长在近 红外，对组织损伤小且穿透力强，能用于活体成像。
[0015] 优选的，所述吸电子基团为-n〇2、-cn、-s〇3h或-cf 3。该荧光探针效果更好。
[0016] -种检测过氧化氢的荧光探针的制备方法，将3-氨基苯酚与Cy. 7.C1进行取代反 应后得到Cy_Ph_NH2，然后经过retro-Knoevenagel反应得到P-NH2，最后与苯乙醛酸的衍生 物经取代反应得到产物P-R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
[0017] 本发明合成方法简单，适于工业化生产。
[0018] 其反应过程如下：
[0019]
[0020] 其中，中任意1个或2个为吸电子基团。
[0021] 优选的，所述吸电子基团为-n〇2、-cn、-s〇3h或-cf3。
[0022]优选的，其反应步骤为：
[0023] (1)将二碳酸二叔丁酯（Boc)20与3-氨基苯酚溶解在溶剂中加热反应后得到Ph- Boc ；
[0024] (2)将Cy. 7. Cl、氢化钠和步骤（1)得到的Ph-Boc溶解在溶剂中反应后得到Cy-Ph- Boc ；
[0025] (3)将Cy-Ph-Boc溶解在溶剂中，冰浴后，加入二氣乙酸后，加热反应后得到Cy-Ph_ NH2；
[0026] (4)将Cy-Ph_NH2、氢化钠溶解在溶剂中加热回流后得到P-NH2;
[0027] (5)将苯乙醛酸的衍生物溶解在溶剂中，滴入DMF，加入草酰氯加热反应后得到苯 乙醛酰氯的衍生物；
[0028] (6)将P-NH2、三乙胺溶解在溶剂中，滴加苯乙醛酰氯的衍生物，反应后得到产物P- R，即为检测过氧化氢的荧光探针。
[0029] 利用Boc对氨基进行保护，更有利于反应的进行，提高了产品产率，简化纯化步骤。
[0030] 其反应过程如下：
[0031]
[0032] 进一步优选的，所述步骤(1)的反应温度为75-85°C，反应时间为4-6h;
[0033] 所述步骤(2)的反应温度为20-30°C，反应时间为2-3h;
[0034] 所述步骤(3)的冰浴时间为1-2h，反应温度为20-30°C，反应时间为5-8h;
[0035] 所述步骤(4)的反应温度为85-95°C，反应时间为4-6h;
[0036] 所述步骤(5)的反应温度为40_50°C，反应时间为l_2h;
[0037] 所述步骤(6)的反应温度为20-30°C，反应时间为1 _2h。该条件下得到的产品产率 和纯度更高。
[0038] 进一步优选的，所述步骤（1)的溶剂为无水乙醇，所述步骤(2)和(4)的溶剂为DMF， 所述步骤(3)的溶剂为二氯甲烷，步骤(5)和(6)的溶剂为超干二氯甲烷。
[0039] 更进一步优选的，所述步骤（1)中3-氨基苯酚、（Boc)20、无水乙醇的用量比例为1: 2-3:30-40，（g:g:mL);
[0040]所述步骤(2)中07.7.(：1、氢化钠、?11-8〇(3、01^的用量比例为1:0.1-0.2 :0.7-1:15-20, (g:g:g：mL)；
[0041 ] 所述步骤（3)中Cy-Ph-Boc、二氯甲烷、三氟乙酸的用量比例为0.2-0.4: 6-10:1， (g:mL:mL)；
[0042] 所述步骤(4)中Cy-Ph-NH2、氢化钠、DMF的用量比例为 1:0.03-0.05:12-20,（g:g: mL)；
[0043] 所述步骤(5)中4-硝基苯乙醛酸、超干二氯甲烷、草酰氯、DMF的用量比例为1:80_ 100:1-1.5:0.5-0.8,(g:mL:mL:mL)；
[0044] 所述步骤(6)中P-NH2、三乙胺、4-硝基苯乙醛酰氯、超干二氯甲烷的用量比例为1_ 1.5:0.1-0.5:1:130-150,（g:mL:g:mL)。提高原料的转化率，降低成本。
[0045] 进一步优选的，所述步骤(2)和(4)的产物纯化方法为直接色谱分离;所述步骤(3) 和(6)的产物纯化方法为先用饱和碳酸氢钠水溶液和二氯甲烷萃取，然后有机相用无水硫 酸钠干燥，过滤，旋干，最后进行色谱分离。
[0046] 更进一步优选的，所述步骤(2)的色谱分离洗脱剂是石油醚、二氯甲烷和无水乙醇 体积比为20-30:20-30:1的混合液；
[0047]所述步骤(3)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为10-20:1的混合 液；
[0048]所述步骤(4)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇体积为为40-60:3的混合 液；
[0049]所述步骤(6)的色谱分离洗脱剂是二氯甲烷和无水乙醇