专利名称：检测贝氏柯克斯体的专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测贝氏柯克斯体的专用引物。
背景技术：
贝氏柯克斯体是1935年首次从澳大利亚病人中分离到的立克次体样病原体，属专性胞内寄生、革兰氏阴性嗜酸菌。贝氏柯克斯体所致疾病称为Q热(Q fever)。Q热分为急性和慢性两种临床类型。急性Q热表现为急性流感样症状，以头痛、发热、肺炎为主要特征，而慢性Q热主要表现为长期发热，常伴有心内膜炎、肝炎、骨髓炎等。贝氏柯克斯体的感染剂量极低，单个病原体即可致病，因此该病原体已被某些国家用作生物武器、还可能被恐怖组织用作生物恐怖剂。目前已经报道的Q热病例遍及全球各大洲几乎所有国家，成为当前分布最广的人兽共患病之一。传统的普通PCR和实时荧光定量PCR方法等常需要花费较长时间或者需要特定的仪器，难以满足暴发疫情快速诊断的需要。 环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)具有在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶序列的特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组。本发明提供的检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物组中，引物I、引物2、引物3和引物4的摩尔比为I :1:8 :8。本发明的另一个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂。本发明提供的检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂，包括上述的引物组和环介导等温扩增缓冲液。上述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液和水组成；所述引物I和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L，所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L。本发明的第三个目的是提供一种检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。上述的引物组、上述的环介导等温扩增试剂、上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测贝氏柯克斯体产品中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述检测为环介导等温扩增反应，所述环介导等温扩增反应的条件为60-65°C反应30-90min，具体为63°C反应90min ;再80°C 5min终止反应。上述检测和/或辅助检测贝氏柯克斯体为用上述环介导等温扩增试剂对待测样本(贝氏柯克斯体)进行环介导恒温扩增反应，检测环介导恒温扩增反应产物；
上述检测环介导恒温扩增反应产物可通过如下方法判断I)通过反应液的池度进行分析判定核酸大量合成时，dNTP会析出大量的焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与LAMP体系中的Mg2+ (或Mn2+)结合，产生焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀，从而引起反应液的浊度变化；基于该原理，可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列；若浑浊，则为阳性，反之为阴性；2)采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测反应液，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本来自贝氏柯克斯体，为阳性，反之为阴性。本发明的实验证明，本发明发现了 4条专用引物，采用环介导等温扩增法可对贝氏柯克斯体进行特异性检测和定量分析，本发明的引物和方法具有如下优点(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明的引物适用于临床标本的快速检测。
图I为实施例2的灵敏度检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线。图2为实施例2的特异性检测的实时浊度仪扩增结果。图3为实施例2的重复性检测的实时浊度仪扩增结果(A)以及扩增曲线(B)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所用无机化学试剂和有机试剂均符合分子生物学实验的要求。引物由上海生物工程技术公司合成，LAMP试剂盒DNA Amplification Kit,日本荣研公司，CodeNo :LMP204。LAMP 突光检测试剂Fluorescent Detection Reagent,日本荣研公司，CodeNo:LMP221。LAMP反应专用离心管Reaction Tube，日本荣研公司，CodeNo:LMP905。日本DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue Kit，QIAgen 公司产品，Cat No. 69506。LA-320C 实时浊度仪，日本荣研公司产品。下述实施例中部分材料如下，括号的数字代表下述文献编号贝氏柯克斯体新桥株(I)、立氏立克次体(2)、普氏立克次体(2)、莫氏立克次体
(2)、黑龙江立克次体(2)、鼠疫耶尔森菌(2)、金黄色葡萄球菌(3);公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。大肠杆菌BL2I (DE3)(购自 Novagen 公司，货号=7O235-3XI.检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR，中国人兽共患病杂志，第21卷，第8期，652-655，2005。2.实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法建立，解放军医学杂志，第33卷，第 11 期，1297-1299,2008。
3.霍乱弧菌外膜蛋白W的原核表达及抗原性分析，军事医学，第35卷，第10期，746-748,2011 ο实施例I、检测贝氏柯克斯体专用引物的设计和制备根据贝氏柯克斯体新桥株全基因组序列设计的特异性引物序列如下F3 (序列 I) :5，-TTCAATAAGCGTTTTATCGCT-3’ ；B3 (序列 2) :5，-ACAACCATTTAAACCGACAAG-3，；FIP (序列 3) :5，-AAGGCTTCCATCAGTGTGAATTATTTGAAGTTATCGAAAGATTGCGT-3，；BIP (序列 4) :5，-CGAATGGTGTCGCGTGTTTCCCCCTTTATCTCATTTCCGG-3，；
人工合成上述所需引物，用于下述实施例2的检测。实施例2、检测贝氏柯克斯体专用弓丨物的应用—、贝氏柯克斯体样本的制备贝氏柯克斯体新桥株感染的鸡胚卵黄囊膜，加入肉汤进行研磨，制备贝氏柯克斯体感染鸡胚的卵黄囊膜研磨液。采用泛影葡胺密度梯度离心法进行纯化，将纯化后的贝氏柯克斯体采用DNeasy Blood&Tissue Kit提取组织DNA,具体提取方法见该试剂盒的说明书，最后采用NanodroplOOO测定提取的菌体DNA的浓度(ng/ μ L)。贝氏柯克斯体新桥株基因组大小为2Mbp，根据菌体DNA的浓度(ng/μ L)和基因组的大小(2Mbp)，计算出纯化的贝氏柯克斯体新桥株菌体的摩尔数，最后计算所纯化的贝氏柯克斯体新桥株的浓度(个基因组/mL)。使用纯水将提取的菌体DNA进行梯度稀释，得到7种不同浓度的菌体DNA稀释液(浓度分别为I X IO6个基因组/ μ L、I X IO5个基因组/ μ L、I X IO4个基因组/ μ L、I X IO3个基因组/ μ L、I X IO2个基因组/ μ L、I X IO1个基因组/ μ L、I X 10°个基因组/ μ L)。将得到的7种菌体稀释液和PBS (阴性对照)作为8个样本。样本I :浓度为I X IO6个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本2 :浓度为IX IO5个基因组/μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本3 :浓度为I X IO4个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本4 :浓度为I X IO3个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本5 :浓度为I X IO2个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本6 :浓度为I X IO1个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本7 :浓度为I X 10°个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液。样本8:PBS缓冲液。二、专用引物检测贝氏柯克斯体(采用LAMP试剂盒)I、灵敏度检测用实施例I中的专用引物检测上述一得到的待测DNA，所有反应均在专用离心管中进行；待测DNA为样本I-样本8。LAMP反应体系(25 μ I) F3和B3的终浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的终浓度均为 40pmol/L，2X 反应混合液(RM，日本荣研公司，CodeNo LMP204) 12. 5 μ 1，Bst DNA 聚合酶Iy 1，待测DNAly 1，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水定容；以上浓度均为体系中的终浓度。LAMP反应体系在63°C反应90min，然后80°C 5min终止反应。实时浊度仪扩增曲线见图1，其中A为扩增结果，B为对应的扩增曲线，可以看出，样本I至样本5为阳性，样本6至样本8为阴性。该结果说明本发明的引物和方法的灵敏度为100个基因组/反应体系。上述4条引物或者除模板外的上述LAMP反应体系可以作为检测贝氏柯克斯体的试剂盒中的组分。2、特异性检测用实施例I中的专用引物检测7种非贝氏柯克斯体基因组DNA用来评价该专用引物的特异性，7种非贝氏柯克斯体分别如下立氏立克次体、普氏立克次体、莫氏立克次体、黑龙江立克次体、鼠疫耶尔森菌、金色葡萄球菌、大肠杆菌BL21 (DE3)。待测样本的DNA浓度均为IO4个基因组/μ L。检测方法和体系如上述I。 结果如图2所示，其中贝氏柯克斯体新桥株(图2-1)、立氏立克次体(图2-2)、普氏立克次体(图2-3)、莫氏立克次体(图2-4)、黑龙江立克次体(图2-5)、鼠疫耶尔森菌(图
2-6)、金黄色葡萄球菌(图2-7)、大肠杆菌BL21 (DE3)(图2_8);从图上可以看出贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA的LAMP扩增结果为阳性，其他基因组DNA以及阴性对照的LAMP扩增结果均为阴性。该结果说明本发明的引物和方法具有良好特异性。3、重复性检测用实施例I中的4条专用引物重复检测检测样本2(浓度为IX IO5个基因组/ μ L的贝氏柯克斯体新桥株稀释液)。重复次数为8次。检测方法和体系如上述1，结果见图3，1-8分别为重复的8次，A为扩增结果，B为对应的扩增曲线；从图上可以看出8次检测的结果均为阳性，扩增曲线没有明显的差别，说明该专用引物具有较高的重复性。
权利要求
1.检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为I :1:8 :8。
3.检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂，包括权利要求I或2所述的引物组和环介导等温扩增缓冲液。
4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增试剂，其特征在于所述环介导等温扩增试剂由权利要求I或2所述的引物组、环介导等温扩增缓冲液和水组成； 所述引物I和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为5pmol/L， 所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均为40pmol/L。
5.检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求I或2所述的引物组或权利要求3或4所述的环介导等温扩增试剂。
6.权利要求I或2所述的引物组、权利要求3或4所述的环介导等温扩增试剂、权利要求5所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测贝氏柯克斯体产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述检测为环介导等温扩增反应，所述环介导等温扩增反应的条件为60-65°C反应30-90min，再80°C 5min终止反应。
全文摘要
本发明公开了一种检测贝氏柯克斯体的专用引物。本发明提供的检测贝氏柯克斯体的环介导等温扩增引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的优点(1)只需在恒定温度就能扩增反应，不需要特殊设备；(2)特异性高；(3)快速高效，扩增反应在60分钟内即可完成；(4)灵敏度高；(5)鉴定方便简单。本发明特别适用于临床标本的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102925574SQ20121044308
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者王锡乐, 温博海, 熊小路, 齐永, 段长松, 李佳明, 焦俊, 贾引军, 龚文平 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所