专利名称：一种微流体细胞捕获芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞捕获工具及其制备方法，尤其涉及一种分离、富集和识别循环肿瘤细胞的微流体细胞捕获芯片及其制备方法，该微流体细胞捕获芯片可用作为肿瘤诊断、辅助治疗、及生化分析研究的有利工具。
背景技术：
目前，肿瘤诊断通常根据大量病理状况进行诊断。这类方法，例如活检或直肠癌指检通常采取侵入性分析，具有一定程度的创伤性，不利于病患。
另外也有采用外周血中生物分子标志物进行检查，例如血清学参数(PSA剂量)检测，由于其敏感性和特异性都不是很理想，使得癌症诊断和治疗较难取得良好效果。
对许多癌症患者而言，其死亡主要是由于转移瘤引起的。当病人手术切除主要肿瘤后，目前检测手段很难及时反应治疗情况，鉴定转移瘤，指导后续的放化疗过程，从而导致病人错过最佳治疗时机和无法及时有效调整无效治疗和用药方案。因此不能够成功治疗所有的转移瘤，导致病人最终死亡。从临床角度看来，转移瘤可以看作是癌症自然发展过程中的结论性事件。
人们急待开发非创伤性过程从患者提取肿瘤细胞样品的工具。
循环肿瘤细胞(CTCs)是指在血液中以极低水平存在的活实体瘤细胞。随着对循环肿瘤细胞研究的不断深入，富集和鉴定这些细胞已经成为辅助癌症诊断的一种方法。监管机构(例如FDA)已经批准一些基于循环肿瘤细胞捕获、鉴定系统的临床应用。
为了分离和富集体液中循环肿瘤细胞和扩散肿瘤细胞，人们利用这类细胞尺寸、 表面分子表达等特点开发出一些相应的捕获、富集方法(例如，多孔滤膜法、免疫磁珠富集法)。
传统的多孔滤膜法存在缺点有(I)孔径单一与实际临床病人细胞尺寸多样性不符，存在遗漏现象；(2)试剂消耗量大，难以进行后期鉴定工作；(3)容易出现堵塞现象，影响实验结果；(4)专用滤膜制备工艺复杂，成本较高。
免疫识别富集法，主要有磁珠富集和芯片富集两种。由于生物的复杂性与多样性， 体液中肿瘤细胞可能存在细胞特征识别基团退化，从而导致免疫识别效率下降，导致假阴性或假阳性出现。无论磁珠富集和芯片富集，都存在细胞与免疫识别基团接触几率不高、结合不牢，影响最后检测和诊断情况。同时此类芯片成本较高，不易于加工。为此要对现有的循环肿瘤细胞分离、富集方法进行改进。发明内容
本发明要解决的技术问题在于提出一种能够通过从人体液体样本中分离、富集罕见细胞的微流体细胞捕获芯片，以解决现有技术中侵入采样等问题。
解决本发明的技术问题所采用的技术方案是提供一种微流体细胞捕获芯片，其包括上部硬质材料和下部硬质材料,所述上部硬质材料和下部硬质材料之间形成有一条沟道，所述沟道具有入口和出口，所述上部硬质材料和下部硬质材料至少一个是透明的材料， 所述沟道从入口到出口的高度由高向低逐渐过渡且呈楔形或者沟道部分区域呈楔形，所述沟道最低处接近或小于至少一种目标细胞尺寸。
作为本发明的进一步改进，所述沟道的宽度为O. 05 200毫米，长度为I 500毫米。
作为本发明的进一步改进，所述沟道的上下底面沉积一层纳米颗粒层或纳米纤维层或用于增加细胞与接触面间摩擦阻力的微纳结构。其中，所述纳米颗粒层或纳米纤维层为纳米Ti02、SiO2或者Fe2O3O
作为本发明的进一步改进，对所述上部硬质材料或者下部硬质材料的至少一个表面进行免疫修饰，能够至少对一种目标细胞进行分子特异性识别。
作为本发明的进一步改进，在所述沟道的入口处，在所述上部硬质材料和下部硬质材料之间塞有厚度为5(Γ200微米厚的钢片，在所述沟道的出口处，在所述上部硬质材料和下部硬质材料之间塞有厚度为广50微米厚的钢片，所述沟道在所述两块钢片之间形成。
作为本发明的进一步改进，所述上部硬质材料和下部硬质材料均为玻璃或者亚克力材料。
解决本发明的技术问题所采用的另一技术方案是提供一种微流体细胞捕获芯片的制作方法，其包括如下步骤
步骤一、将上部硬质材料和下部硬质材料重叠在一起；
步骤二、在所述上部硬质材料和下部硬质材料重叠的一端塞入厚钢片并用夹具压紧，在所述上部硬质材料和下部硬质材料重叠的另一端塞入薄钢片并用夹具压紧，从而在所述上部硬质材料和下部硬质材料中间形成楔形沟道；
步骤三、在所述上部硬质材料和下部硬质材料的侧边用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人体液体样本不能从所述上部硬质材料和下部硬质材料的侧边流出；
步骤四、所述楔形沟道的两端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚钢片处设置通孔以形成所述楔形沟道的入口，在薄钢片处设置通孔以形成所述楔形沟道的出口，人体液体样本能从所述楔形沟道的入口流入，并从所述楔形沟道的出口流出。
作为本发明的制作方法的进一步改进，进一步包括步骤五、在所述楔形结构的入口和出口分别插上能使人体液体样本通过的孔针。
作为本发明的制作方法的进一步改进，厚钢片的厚度为5(Γ200微米，薄钢片的厚度为f 50微米。
作为本发明的制作方法的进一步改进，所述沟道的宽度为O. 05 200毫米，长度为I 500毫米。
作为本发明的制作方法的进一步改进，在步骤一中，所述上部硬质材料和下部硬质材料的表面沉积一层纳米颗粒层或纳米纤维层或有利于增加细胞与接触面摩擦力的微纳结构。其中，所述纳米颗粒层或纳米纤维层为纳米Ti02、SiO2或者Fe203。
作为本发明的制作方法的进一步改进，对所述上部硬质材料或者下部硬质材料的至少一个表面进行免疫修饰，能够至少对一种目标细胞进行分子特异性识别。
作为本发明的制作方法的进一步改进，对所述至少一个表面进行修饰步骤为步骤一、用无水乙醇配制4%的3-巯丙基三甲氧基硅烷溶液，将其注满芯片沟道，在常温下反应I小时后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤二、用二甲亚砜将蛋白质交联剂4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再将其注入芯片沟道，在常温下反应 45min后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤三、用磷酸盐缓冲液配制50 μ g/mL的链霉亲和素溶液，再将其注入芯片沟道，然后置入4°C冰箱中过夜反应后用pH=7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液清洗5分钟；步骤四、将上皮细胞黏附因子抗体溶液注入芯片沟道，并在常温下静置反应 1-2小时后用PBS将沟道冲洗5分钟。
作为本发明的制作方法的进一步改进，所述上部硬质材料和下部硬质材料均为玻璃或者亚克力材料。
本发明采用非侵入式方式从患者提取人体液体样本，将人体液体样本从微沟道芯片的入口注入，由于微沟道的高度呈楔形分布，目标细胞在沟道中通过时将实现自动分离和富集。本发明的微流体细胞捕获芯片结构简单、便于制作、成本低廉，能够对不同尺寸和具有特异性分子表达的细胞进行快速高效分离、富集。
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中
图I为以本发明微流体细胞捕获芯片的实施例的结构不意图2为本发明微流体细胞捕获芯片的纵截面放大示意图3为本发明微流体细胞捕获芯片的细胞分离的示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图I至图3所示，本发明的实施例提供了一种微流体细胞捕获芯片100，用于捕获微流体细胞200。该微流体细胞捕获芯片100包括上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20，该上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之间形成有一条沟道30，该沟道具有入口 32和出口 34，该沟道30从入口 32到出口 34的高度由高向低逐渐过渡且呈楔形或者沟道部分区域呈楔形，该沟道最低处接近或小于至少一种目标细胞尺寸。在本实施例中，微流体细胞200为循环肿瘤细胞。在本实施例中，不限于本发明的这些透明玻璃片，这些透明玻璃片可以用透明的硬质材料替代，，例如亚克力材料，并且，上部透明玻璃片和下部透明玻璃片也可以用一个透明的硬质材料和一个不透明的硬质材料替代，也就是说，两者之中只要其中一个是透明的硬质材料即可。
该沟道30的宽度为O. 05 200毫米，长度为I 500毫米。该上部透明玻璃片 10或者下部透明玻璃片20的至少一个表面可进行表面修饰。对该至少一个表面进行表面修饰步骤为步骤一、用无水乙醇配制4%的3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)溶液，将其注满芯片沟道，在常温下反应I小时后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤二、用二甲亚砜(DMSO)将蛋白质交联剂4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)配制成I μ mol/mL的溶液，再将其注入芯片沟道，在常温下反应45min后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤三、用磷酸盐缓冲液(PBS)配制50μ g/mL的链霉亲和素(SA)溶液，再将其注入芯片沟道，然后置入4°C冰箱6中过夜反应后用PBS (磷酸盐缓冲液，pH=7. 2-7. 4)溶液清洗5分钟；步骤四、将上皮细胞黏附因子抗体(Anti-EpCAM)溶液注入芯片沟道，并在常温下静置反应1_2小时后用PBS将沟道冲洗5分钟。在经过表面修饰以后可对至少一种目标细胞进行分子识别的特异性抗体。 在该沟道30的入口 32处，在该上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之间塞有厚度为 50 200微米厚的钢片40，在该沟道30的出口 34处，在该上部透明玻璃片10和下部透明玻璃片20之间塞有厚度为f 50微米厚的钢片40，该沟道在该两块钢片40之间形成。
本发明实施例提供的一种能够通过从人体有机液体样本中分离、富集细胞的微流体细胞捕获芯片，该微流体细胞捕获芯片100内的沟道30高度按一定规律变化，且沟道30 上下底面通过特殊处理(即在该沟道上下底面的玻璃表面沉积一层Ti02、Si02或者Fe2O3等纳米薄膜或者纳米纤维或有利于增加细胞与接触面摩擦力的微纳结构，其厚度为5 200纳米)提高目标细胞捕获效率。本发明的微流体细胞捕获芯片结构简单、便于制作、成本低廉， 能够对不同尺寸和具有特异性分子表达的细胞进行快速高效分离、富集。
本发明的微流体细胞捕获芯片100以非手动方式分离、富集该细胞。该细胞是基于液体流动在微流体细胞捕获芯片里自动分离和富集。本发明的微流体细胞捕获芯片，该细胞至少用一种类型的示踪物标记识别。本发明采用非侵入式方式从患者提取人体液体样本，将人体液体样本从微流体细胞捕获芯片100的入口 32注入，由于沟道30的高度呈楔形分布，目标细胞在沟道30中通过时将实现自动分离和富集。
本发明还提供了一种微流体细胞捕获芯片的制作方法，其包括如下步骤
步骤一、将上下两片透明玻璃片10、20重叠在一起；
步骤二、在两玻璃片重叠的一端塞入厚度为5(Γ200微米厚的精密钢片40并用夹具压紧，在两玻璃片重叠的另一端塞入厚度为f 50微米厚的精密钢片并用夹具压紧，从而在两玻璃片中间形成楔形沟道30 ；
步骤三、两玻璃片的侧边用聚二甲基硅氧烷(PDMS)封涂，然后在加热台上烘干，使人体液体样本不能从玻璃片的侧边流出；
步骤四、该楔形沟道的两端也用聚二甲基硅氧烷封涂烘干，并在两端打孔，使人体液体样本能从图I所示的楔形沟道30的入口 32流入，并从出口 34流出；
步骤五、在图I所示的楔形沟道30的入口 32和出口 34分别插上能使人体液体样本通过的孔针，这样，该微流体细胞捕获芯片就制作完成了。
实验原理
(I)如图I所示，本发明采用楔形沟道结构设计，在两玻璃片中间形成的沟道的宽度为O. 05 200毫米，沟道长度为10 500毫米的楔形沟道；
(2)本发明的楔形沟道的入口高度为5(Γ200微米，出口高度为f 50微米，当人体液体样本通过入口流入楔形沟道时，由于流体空间的限制，随人体液体样本流入的目标捕获细胞将在特定的位置卡住；
(3)此实验的基本思路是将待检测的患者的人体液体样本通过本发明的楔形微流体细胞捕获芯片，最终使不同尺寸的目标细胞在沟道中通过时实现自动分离和富集。
实验步骤
(I)依据发明的制作方法，制作出带有图I所示的微流楔形循环肿瘤细胞捕获芯片；
(2)将待检测人体液体样本从上述芯片的入口注入，并在芯片的出口处收集目标细胞分离后的人体液体样本；
(3)继续通过入口加入磷酸盐缓冲溶液(即PBS溶液，pH=7. 2-7. 4，NaC1137mmol/ L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L)进行清洗；
(4)继续通过入口选择加入示踪物质(如染细胞核的突光染料如DAPI或者 Hoechst染料)或加入免疫试剂，对目标细胞进行识别；
(5)再次通过入口加入PBS进行清洗；
(3)将芯片放置在显微镜下观察捕获的目标细胞。
实验效果分析
(I)、如图2所示，分别选择区域一、区域二、区域三、区域四中的四个观测点，可以看到目标细胞在上述芯片中的分离和富集。
(2)、在上述四个区域的四个观测点观测到的目标细胞的分布可以看出，目标细胞的分离和富集是由于目标细胞的尺寸和楔形沟道的尺寸相互作用的结果，大尺寸细胞富集在离出口远处，小尺寸细胞富集在离出口近处。
(3)、本实验能实现不同尺寸的目标细胞的分离、捕获，操作简单，可重复性强。
(4)、本实验装置使用的楔形微流体细胞捕获芯片结构简单、便于制作、成本低廉， 能够对不同尺寸和具有特异性分子表达的细胞进行快速高效分离、富集。
本发明采用非侵入式方式从患者提取人体液体样本，将人体液体样本从微沟道芯片的入口注入，由于微沟道的高度呈楔形分布，目标细胞在沟道中通过时将实现自动分离和富集。本发明的微流体细胞捕获芯片结构简单、便于制作、成本低廉，能够对不同尺寸和具有特异性分子表达的细胞进行快速高效分离、富集。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。8
权利要求
1.一种微流体细胞捕获芯片，其包括上部硬质材料和下部硬质材料，所述上部硬质材料和下部硬质材料之间形成有一条沟道，所述沟道具有入口和出口，所述上部硬质材料和下部硬质材料至少一个是透明的材料，其特征在于，所述沟道从入口到出口的高度由高向低逐渐过渡且呈楔形或者沟道部分区域呈楔形，所述沟道最低处接近或小于至少一种目标细胞尺寸。
2.如权利要求I所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于所述沟道的宽度为O.05 200毫米，长度为I 500毫米。
3.如权利要求I所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于所述沟道的上下底面沉积一层纳米颗粒层或纳米纤维层或用于增加细胞与接触面间摩擦阻力的微纳结构。
4.如权利要求3所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于所述纳米颗粒层或纳米纤维层为纳米Ti02、SiO2或者Fe203。
5.如权利要求I或4所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于对所述上部硬质材料或者下部硬质材料的至少一个表面进行免疫修饰，能够至少对一种目标细胞进行分子特异性识别。
6.如权利要求I所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于在所述沟道的入口处，在所述上部硬质材料和下部硬质材料之间塞有厚度为5(Γ200微米厚的钢片，在所述沟道的出口处，在所述上部硬质材料和下部硬质材料之间塞有厚度为广50微米厚的钢片，所述沟道在所述两块钢片之间形成。
7.如权利要求I所述的微流体细胞捕获芯片，其特征在于所述上部硬质材料和下部硬质材料均为玻璃或者亚克力材料。
8.一种微流体细胞捕获芯片的制作方法，其特征在于，其包括如下步骤 步骤一、将上部硬质材料和下部硬质材料重叠在一起； 步骤二、在所述上部硬质材料和下部硬质材料重叠的一端塞入厚钢片并用夹具压紧，在所述上部硬质材料和下部硬质材料重叠的另一端塞入薄钢片并用夹具压紧，从而在所述上部硬质材料和下部硬质材料中间形成楔形沟道； 步骤三、在所述上部硬质材料和下部硬质材料的侧边用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，使人体液体样本不能从所述上部硬质材料和下部硬质材料的侧边流出； 步骤四、所述楔形沟道的两端也用聚二甲基硅氧烷封涂，然后烘干，在厚钢片处设置通孔以形成所述楔形沟道的入口，在薄钢片处设置通孔以形成所述楔形沟道的出口，人体液体样本能从所述楔形沟道的入口流入，并从所述楔形沟道的出口流出。
9.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于进一步包括步骤五、在所述楔形结构的入口和出口分别插上能使人体液体样本通过的孔针。
10.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于厚钢片的厚度为5(Γ200微米，薄钢片的厚度为广50微米。
11.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于所述沟道的宽度为O.05 200毫米，长度为I 500毫米。
12.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于在步骤一中，所述上部硬质材料和下部硬质材料的表面沉积一层纳米颗粒层或纳米纤维层或有利于增加细胞与接触面摩擦力的微纳结构。
13.如权利要求12所述的制作方法，其特征在于所述纳米颗粒层或纳米纤维层为纳米 Ti02、SiO2 或者 Fe2O3 =
14.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于对所述上部硬质材料或者下部硬质材料的至少一个表面进行免疫修饰，能够至少对一种目标细胞进行分子特异性识别。
15.如权利要求14所述的制作方法，其特征在于对所述至少一个表面进行修饰步骤为步骤一、用无水乙醇配制4%的3-巯丙基三甲氧基硅烷溶液，将其注满芯片沟道，在常温下反应I小时后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤二、用二甲亚砜将蛋白质交联剂4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯配制成I μ mol/mL的溶液，再将其注入芯片沟道，在常温下反应45min后用无水乙醇冲洗5分钟；步骤三、用磷酸盐缓冲液配制50 μ g/mL的链霉亲和素溶液，再将其注入芯片沟道，然后置入4°C冰箱中过夜反应后用pH=7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液清洗5分钟；步骤四、将上皮细胞黏附因子抗体溶液注入芯片沟道，并在常温下静置反应1-2小时后用PBS将沟道冲洗5分钟。
16.如权利要求8所述的制作方法，其特征在于所述上部硬质材料和下部硬质材料均为玻璃或者亚克力材料。
17.一种根据权利要求8-16任意一项制作方法制作出来的微流体细胞捕获芯片。
全文摘要
本发明涉及一种微流体细胞捕获芯片，其包括上部硬质材料和下部硬质材料，所述上部硬质材料和下部硬质材料之间形成有一条沟道，所述沟道具有入口和出口，所述上部硬质材料和下部硬质材料至少一个是透明的材料，所述沟道从入口到出口的高度由高向低逐渐过渡且呈楔形或者沟道部分区域呈楔形，所述沟道最低处接近或小于至少一种目标细胞尺寸。本发明还涉及一种微流体细胞捕获芯片的制作方法。本发明的微流体细胞捕获芯片结构简单，便于制作，成本低廉，能够对不同尺寸和具有特异性分子表达的细胞进行快速高效分离、富集。
文档编号C12M1/00GK102925337SQ20121044263
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月8日 优先权日2012年11月8日
发明者刘侃, 汪胜祥, 张南刚, 周鹏飞 申请人:武汉友芝友生物制药有限公司