评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价细胞因子TNF-α生物活性的 体外检测方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子（TNF- α )由单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等分泌，主要的生理 作用包括影响细胞的凋亡、增殖、分化以及细胞功能。TNF-α与其受体结合后，能启动一系 列的细胞内事件，如作用于巨噬细胞、促进炎症因子、化学因子的释放，加重炎症反应；作 用于内皮细胞，促进分泌粘附分子，增加细胞通透性；作用于成纤维细胞和上皮细胞，影 响组织重构和离子转运通透性等。经研宄发现TNF-α对靶细胞具有明显的细胞毒作用，细 胞死亡率与其浓度呈线性相关。目前已经证实，TNF-α与人类许多疾病有密切关系，如类 风湿性关节炎、炎症性肠病等，抑制TNF-α的过度生成和活化能够有效地抑制各种炎症反 应，促进组织愈合。基于此，TNF-α是一种重要的促炎症因子和免疫调节因子，具有广泛 的生物学功能，该细胞因子TNF-α也是单克隆抗体、蛋白酶抑制剂等生物治疗药物研发领 域的重要靶点分子。
[0003] 在利用DNA重组技术体外表达制备TNF-α过程中，为了便于从大量候选克隆中筛 选到能够表达具有生物活性细胞因子的目标克隆，或者是基于该细胞因子的产品放行或稳 定性研宄，研宄人员需要建立快速，高效的体外检测手段用于准确评价TNF-α的生物学活 性。生物活性体外检测方法可以基于ELISA或细胞学实验。ELISA实验主要考察TNF-α与 受体的结合能力，细胞水平实验则除了考察结合能力外还可评价TNF-α与受体结合之后 的生物学功能，基于细胞水平的活性检测更能反映生物制品的体内作用机理。然而在工业 界，基于产品筛选、放行、稳定性研宄的细胞水平活性检测方法的建立是比较复杂的。包括 细胞系选择、活性方法各个参数的优化、方法实验流程的选择等。除此之外，方法验证也有 严格的要求，包括准确度、精密度、耐用性等。只有满足这些要求的方法才能保证生物活性 检测结果的可靠，用于指导生物制品筛选、产品放行及稳定性研宄等工作。此外，在相同的 实验条件下，最终确定的方法越简单，操作步骤越少越好，因为这样才更加灵活，利于推广， 并且适用于高通量工作。
[0004] 以基于细胞因子TNF-α的细胞水平生物活性方法开发为例，TNF-α对高表达 TNF- α受体的L929小鼠成纤维细胞具有明显的细胞毒作用，是通过TNF- α与细胞表面受 体相互作用后介导下游信号传导来杀死细胞的。根据实验设计作用机理一致性原则，研宄 人员通常利用重组TNF-α对L929细胞的体外杀伤细胞毒作用来评价其生物学活性。然 而到目前为止，该细胞学活性方法，并未得到公认或标准化，关键实验参数包括细胞铺板密 度，TNF-a与细胞作用时间，显色时间以及显色方式等不同文献的报道也并不一致。更重 要的是，在已经报道的TNF-α细胞毒活性方法中，缺乏对检测体系的方法学验证研宄，包 括准确性、精密度、耐用性等方面的相关评价，难以保证检测结果的稳定性与可靠性。已知 文献报道的TNF-a细胞毒检测方法难以满足TNF-α克隆株筛选、生产放行以及稳定性研 宄的需要。
[0005] 所以一种能够克服上述缺陷的TNF- α细胞毒检测方法是十分具有实用价值的。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价细胞 因子TNF-α生物活性过程中，对具有生物活性TNF-α进行筛选、产品放行测试、稳定性评 价的细胞毒生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对准确性，精密度包括重 复性，中间精密度，以及耐用性等方面的要求，能够满足TNF-α在研发筛选以及生产过程 中的需要。
[0007] 本发明公开了一种评价细胞因子TNF-α生物活性的体外检测方法，包括下列步 骤：
[0008] 步骤（1):取对数生长期表达TNF-α受体的细胞经酶消化后，用完全培养基制成 细胞悬液，计数并计算所述的细胞悬液中的细胞密度及活率，并调整活细胞密度为nX IO5 个/ml，得到调整后的细胞悬液；
[0009] 步骤（2):将所述的调整后的细胞悬液等体积加入细胞培养板的孔中，同时设立 空白对照孔，所述的空白对照孔被加入等体积所述的完全培养基，然后将所述的细胞培养 板置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养23-25h，得到第一细胞培养板；
[0010] 步骤（3):取基础培养基、FBS、放线菌数D，配置成含FBS、放线菌数D (ActD)浓度 的样品稀释液；
[0011] 步骤（4):取参考品及供试品，分别用所述的样品稀释液进行稀释，得到稀释浓度 范围的参考品、供试品溶液；
[0012] 步骤（5):取步骤⑵中的所述的第一细胞培养板，将所述的稀释浓度的参考品、 供试品以等体积依次加入所述的第一细胞培养板的孔中，所述的空白对照孔则加入等体积 的样品稀释液，得到第二细胞培养板；
[0013] 步骤(6):将所述的第二细胞培养板放置于37°C、5%二氧化碳培养箱中培养 16_18h，得到第三细胞培养板；
[0014] 步骤（7):采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对所述的第三细胞培养板进行 显色反应；
[0015] 步骤（8):所述的显色反应完成后，测定所述的显色反应的结果，并根据测定结果 计算供试品的细胞毒生物活性。
[0016] 较佳地，所述η = 3-5。
[0017] 较佳地，所述的对数生长期表达TNF-α受体的细胞是小鼠成纤维细胞L929。该细 胞对TNF-α高度敏感，可用于检测其中的TNF-α活性。
[0018] 较佳地，所述的完全培养基是含10% FBS的MEM完全培养基。
[0019] 较佳地，所述的样品稀释液是含2% FBS、1 μ g/mL放线菌数D的MEM分析培养基。 [0020] 较佳地，步骤（4)中的所述稀释是用样品稀释液制备参考品及供试品溶液，所述 的参考品及供试品溶液的浓度范围是20ng/mL-5. I X 10_5ng/mL。
[0021] 较佳地，在步骤（7)中，所述的检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化 合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系。
[0022] 更佳地，所述的四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。其中优选为MTS。相对于其他 四唑类化合物如MTT而言，MTS所形成的还原显色物质可直接溶于水相，无需添加 DMSO助 溶，因此使用更加方便，检测灵敏度也较高。
[0023] 较佳地，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。以便于高通量地进行TNF-α细 胞毒生物活性评价。
[0024] 发明术语"参考品"是指已市售的重组人TNF-α蛋白，已公知其对表达TNF-α受 体的细胞表现出细胞毒生物活性。
[0025] 采用本发明的评价细胞因子TNF- α生物活性的体外检测方法，其作用机理为针 对TNF-α细胞因子的细胞毒性作用，能够快速，准确，高效的对细胞因子TNF-α的细胞毒 生物活性进行检测，用于其体外活性评价。该方法特异性强，准确性高，测定活性范围达到 50%-150%;精密度高，重复性，中间精密度RSD均小于10%，并且双复孔的CV%小于15%， 4参数拟合的拟合常数R 2均大于0. 98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操 作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在针对细胞因子TNF-α的细胞毒生物活性 的筛选、产品放行以及稳定性评价的需要。
【附图说明】
[0026] 图1为实施例1的TNF-α细胞毒生物活性检测参考品及供试品实验4参数拟合 图。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围