专利名称：：Il-4和/或il-10细胞因子在人癌症中的差异表达的制作方法IL-4和/或IL-10细胞因子在人癌症中的差异表达本发明涉及诊断癌症类型的方法，其中测定抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中的表达。本发明的鉴别诊断用于将肿瘤疾病分类并用于推荐所需要的治疗和用于监控进程和对治疗的反应。细胞存活和细胞死亡之间的平衡由促凋亡和抗凋亡因子控制，其调节异常促成数种病理状态的发展，包括癌症。通常在人癌症中发现抗凋亡因子的高表达率并促成赘生性细胞增殖和耐受细胞毒性药物的治疗作用。据报道抗凋亡细胞因子由肺瘤细胞的自分泌生产强烈地调整对受体和经化学疗法诱导的凋亡的敏感性。特别是，以前曾经报道过，IL-4和IL-10在肿瘤细胞中起自分泌生长因子的作用，诱导保护肿瘤细胞避免经化疗药物诱导的死亡的抗凋亡蛋白的增量调节(Stassi等人，CancerRes.63，6784-90(2003)，Todaro等人，CancerRes.66，1491-9(2006))。肺瘤由具有不同治疗特性和不同增殖潜力的细胞的异质组合组成。特别是，癌细胞可以产生细胞表型多样的子代，其被赋予一定的增殖潜力或具有有限的增殖潜力或无增殖潜力。在这方面，最近的证据表明致瘤生长能力实际上局限在所谓的癌症干细胞(CSC)的小亚群上。国际申请PCT/IT2005/000523公开了分离和培养来自实体瘤的干细胞的方法。该亚群的癌细胞可以自我更新并产生显示多样差异程度的异质细胞群。此外，最近发现这些癌症千细胞显著抗拒药物诱导的凋亡，因此逃避了抗肿瘤治疗并且这可能是化学疗法无效的根本原因。现已证明CSC主要生产IL-4和IL-10并是上述改变对药物诱导的细胞死亡的敏感性的原因。现在本发明的发明人还发现实体瘤可以鉴于抗凋亡细胞因子表达水平和/或表达谱来鉴别。在相同器官的个体肿瘤之间且甚至在单一肿瘤的细胞内或部分内抗凋亡细胞因子的表达不同。这些结果导致在肿瘤诊断和/或治疗方面新的有效的策略。特别是，本发明的目的为提供允许鉴定和诊断表达抗凋亡细胞因子的癌症类型和癌细胞的方法。因此，本发明提供了使用抗凋亡细胞因子作为靶点，诊断肺瘤类型，特别是实体瘤类型的方法。特別是，本发明涉及诊断癌症类型的方法，包括以下步骤(a)提供来自实体瘤的包含肿瘤细胞的样品，(b)测定至少一种抗凋亡细胞因子在所述肿瘤细胞中的表达，和(c)将实体瘤分类为非细胞因子表达性肺瘤或细胞因子表达性肺瘤。因此，本发明涉及借助测定和/或量化抗凋亡细胞因子在肺瘤样品中的表达i普和/或表达水平而鉴别诊断癌症类型。作为抗凋亡细胞因子，优选IL-4和/或IL-10，特别是IL-4。根据本发明的鉴别诊断允许将肿瘤类型分类并鉴定显示表达抗凋亡细胞因子和对用化疗剂的治疗不反应的那些肿瘤类型。因此抗凋亡细胞因子的表达是肿瘤分类的重要标记，其允许选择靶向治疗策略。例如，本发明的方法可以用于预测患有某种癌症类型的患者对某种疗法是否耐受或敏感并提供最佳的治疗策略。根据本发明，发现癌症类型可以分类为非细胞因子表达性肿瘤或细胞因子表达性肺瘤。如果测定IL-4和/或IL-10的表达，更特别地，IL-4的表达，可以将实体瘤关于它们只表达IL-4或只表达IL-10或同时表达IL-4和IL-IO这二者而进行分类。因此，本发明的方法允许在分类为IL-4表达性肺瘤或IL-4非表达性肿瘤的实体瘤之间，分类为IL-IO表达性肿瘤或IL-10非表达性肿瘤的实体瘤之间，和分类为IL-4兼IL-IO表达性肿瘤或非IL-4兼非IL10表达性肿瘤之间进行鉴别。本发明的方法优选在实体瘤上并特别是在上皮肿瘤上实施。所述上皮肿瘤可以选自下组甲状腺、乳腺、前列腺、膀胱、结肠、胃、胰腺、肾、肝和肺的癌。更优选，上皮肿瘤为结肠、胃、乳腺、肺、膀胱或前列腺的癌。本发明的诊断方法可以在来自实体瘤的不同细胞样品中实施。试样优选为来自从受试者，例如人类患者分离的原代肿瘤和/或肿瘤环境的细胞样品。例如，可以测验通过活组织检查、切除术或其它技术获得的肿瘤细胞组织。所述肿瘤样品包含肿瘤细胞。抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中的表达优选在原代肿瘤细胞和/或癌症干细胞上测定。抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中表达的测定方法在本
技术领域：
是众所周知的。抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中的表达，特别是过表达的测定通过在蛋白质水平和/或核酸水平上检测所述细胞因子来进行。细胞因子蛋白的测定可以在肿瘤细胞中或在肿瘤的微环境中实施。用来测定细胞因子蛋白在给定样品中的存在和量的方法是本领域技术人员众所周知的并可以是免疫化学法例如免疫组织化学、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和ELISA法。基于质谱分析法的其它方法，包括MALDI-MS可以用于测定细胞因子蛋白的存在和量。在此，借助本领域技术人员众所周知的任何方法检测和量化细胞因子核酸。杂交技术与任选的扩增法一起经常用于检测核酸。细胞因子mRNAs的表达可以例如通过RM印迹分析或通过逆转录和随即通过PCR扩增来检测。本发明的方法可以包含进一步的步骤(d)确定细胞因子表达性肺瘤的细胞在所述被表达的细胞因子和/或其受体的拮抗剂存在和/或缺失的情况下，对至少一种化疗剂或促凋亡剂的敏感性。为了研究细胞因子表达性肿瘤细胞对化疗和/或促凋亡剂的敏感性，可以测量暴露于所述化疗剂或促凋亡剂的肿瘤细胞在细胞因子中和剂缺失和/或存在的情况下的存活。用于确定肺瘤细胞对给定试剂的敏感性的方法是本领域技术人员众所周知的(例如，在实施例中所述)。基于所述测定，本发明的方法可以进一步包含步骤(e)选择癌症类型-特异性疗法正如已经提及的那样，本发明基于观察到的实体瘤可以通过它们对抗凋亡细胞因子和特别是IL-4和IL""IO细胞因子的表达或表达程度来鉴别。由于IL-4和IL-10抗凋亡细胞因子在肿瘤或肿瘤细胞中的表达是形成对治疗，例如采用化疗和/或促凋亡剂不应性的原因，应该将抗凋亡细胞因子中和以便提高肿瘤对治疗的敏感性。因此本发明也可以包括检测针对化疗和/或促凋亡剂与肺瘤表达的细胞因子的拮抗剂的联合的敏感性和抗性。在优选的实施方案中，在所述方法的步骤(d)中实施的敏感性试验旨在确定细胞因子表达性肿瘤的细胞对其特别敏感的化疗剂或促凋亡剂。因此，根据本发明的步骤(e)，可以选择成功的肿瘤类型-特异性疗法，包括联合给予细胞因子中和剂和化疗剂或促凋亡剂。细胞因子中和剂可以是降低细胞因子的量和/或活性的任何化合物。例如，细胞因子中和剂可以是抑制由肿瘤细胞自分泌表达的细胞因子引发的信号转导途径的试剂。因此，考虑能够直接和/或间接调制细胞因子的表达和/或功能的任何试剂，即影响相应的细胞因子蛋白和/或细胞因子受体的表达和/或功能的任何试剂。优选，细胞因子中和剂是IL-4和/或IL-10中和剂，即能够抑制由IL-4和/或IL-10的自分泌表达引发的信号转导途径的任何试剂。细胞因子中和剂可以尤其是选自下组抑制和/或降低表达的细胞因子蛋白活性的试剂，降解所表达的细胞因子蛋白的试剂和抑制细胞因子生产的试剂。阻断细胞因子活性的试剂是，例如阻断细胞因子受体的拮抗剂，例如肽、小分子、与细胞因子的原信号相比显示拮抗活性的细胞因子突变蛋白变体。这种突变蛋白的实例特别是IL-4突变蛋白诸如Pitrakinra⑧和来自Aerovance的Aerolast⑧和来自Bayer的BAY-36-1677。可以使用针对细胞因子受体的抗体或针对细胞因子蛋白的抗体。抗体优选为针对IL-4和/或IL-10的抗体，例如来自Amgen和Immunex的抗体或针对IL-4受体和/或IL-10受体的抗体，例如来自Glaxo的抗体Pascolizumab。所述抗体可以是完全抗体，例如IgG抗体，或其抗原结合片段。优选抗体为单克隆嵌合或具有人恒定区，例如人恒定的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4区的人源化抗体。更优选，所述抗体为此外还包括人构架区的人源化抗体。还优选抗体片段，例如二价或单价的抗体片段例如F(ab)2片段。另一方面，所述抗体可以是重组抗体，例如单链抗体或其片段，例如scFv片段。可溶的细胞因子受体，优选无跨膜域和胞内域，也可以用作阻断细胞因子活性的试剂。这些可溶受体，例如，来自Regeneron，特别是IL-4R/IL-13R-Fc融合蛋白和来自Amgen和Immunex的可溶受体，特别是Nuvance⑧和Altrakincept逸。可溶受体的特别实例包括人IL-4受体的胞外域(ECD),例如来自人IL-4Ra缩短ECD的氨基酸24至氨基酸224，225，226，227，228，229或230和任选的其它结构域，例如人IL-13受体的胞外域和/或人Fc免疫球蛋白结构域。作为优选的使所表达的细胞因子蛋白降解的试剂的实例在本发明的上下文中可以提及设计(designer)蛋白酶。另一方面(inturn)，细胞因子蛋白的生产可以被例如在核酸水平上作用的试剂诸如反义核酸、siRNA分子和/或核酶抑制。优选的细胞因子拮抗剂描迷于国际专利申请WO2004/069274中。针对细胞因子的抗体优选用作细胞因子中和剂。在欧洲专利申请EP-A-0730609中公开的抗-IL-4抗体特别适合作为本发明方法的细胞因子中和剂。在非常优选的实施方案中，衍生自由杂交瘤细胞系ACC93100620产生的单克隆抗体6A1或其抗原结合片段的抗体用作细胞因子中和剂。在步骤(d)和/或(e)中使用的化疗剂选自下组抗代谢物质、DM-碎裂剂(DM-fragmentingagents)、DM-交联剂、嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、拓朴异构酶I和II抑制剂、微管定向剂(micro-tubule-directedagent)、激酶抑制剂、激素和激素拮抗剂。特别是，化疗剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。作为优选的促凋亡剂，可以选择凋亡素2配体(TRAIL)和CD95配体。基于对胂瘤细胞联合给予抗化疗细胞因子拮抗剂和化疗和/或促凋亡剂而获得的结果，可以基于已证实有效的药物特别联合开发治疗策略。因此本发明进一步的目的为细胞因子中和剂与化疗剂或促凋亡剂联合使用并制备肺瘤治疗用药物，诸如一线肿瘤治疗或二线或三线肿瘤治疗用药物，例如用于治疗顽固性肿瘤，诸如对一种或多种抗肿瘤剂变得不反应的肿瘤。因此，本发明进一步的方面为以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂用于制备治疗分类为细胞因子表达性肿瘤的癌症类型的药物。引起肿瘤细胞耐药性的主要原因之一基于观察到的存活的少量胂瘤细胞，特别是肿瘤干细胞，在看似完全阻遏或手术切除原代肿瘤后，会使肿瘤再生并促成微小残留病(MRD)。在此方面，由于联合疗法特别适合于提高肿瘤干细胞的治疗敏感性，本发明的另一方面为以下试剂的联合(Ui)至少一种细胞因子中和剂(iv)至少一种化疗剂或促凋亡剂来制备用来治疗微小残留病的药物。根据本发明的优选实施方案，上述试剂(i)和(ii)的联合疗法的使用可以进一步与手术和/或放射疗法结合。特别是，药物联合与手术和/或放射疗法同时、分开或相继地结合。根据本发明的一个优选实施方案，同时开始给予试剂(i)和试剂(ii)。可替代地，联合疗法可以逐步开始。根据本发明的该优选实施方案，在给予化疗剂或促凋亡剂(ii)<1周之前开始给予细胞因子中和剂(i)。在给予细胞因子中和剂(i)之前>1周可以开始给予化疗剂或促凋亡剂(ii)。本发明的更进一步的实施方案为可溶IL-4受体多肽或者融合多肽，所述融合多肽包含C-末端缩短的胞外域，例如缩短l，2，3,4,5，6，7，8或更多个氨基酸的结构域或者编码这类多肽的核酸分子。缩短的胞外域可以例如衍生自C末端终止在氨基酸230、229、228、227、226、225或224处的人IL-4受体ot(NCBI登录号NP—000409)。优选的C-末端终端为氨基酸224。多肽可以包含至少一个其它结构域，例如N-末端信号肽，另一个效应子结构域例如IL-13受体胞外域，Fc免疫球蛋白结构域，和/或纯化结构域。缩短的IL-4R多肽的实例在实施例4中描述。缩短的IL-4R多肽适合于制药学应用，例如用于治疗肿瘤，特别是用于治疗如上述的IL-4-相关肿瘤。通过以下的实施例进一步说明本发明实施例材料和方法人体组织。癌症标本根据负责人体实验的机构委员会的伦理标准在手术治疗时获得。而正常組织获自手术切除的胂瘤的对照侧(controlateral)部分。组织学诊断基于决定组织学类型和级别的癌细胞的微观行为特征。人体原代细胞的纯化。如前所述(1)将正常组织和癌组织用胶原酶(1.5mg/ml)(GibcoBRL.，GrandIsland,NY)和透明质酸酶(20jag/ml)(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)消^f匕2小时。一旦消化，细胞就被保留在于37。C下在5%C02的湿润气氛中的DMEM介质(EuroCloneLtd.,WestYork,UK)中的塑料上。在进一步培养12小时后，允许癌细胞以单层生长用于免疫细胞化学或用胰岛素+EDTA分离用于功能性、蛋白质表达和基因转录水平分析。对于结肠和胃细胞培养，将塑料用/cm2胶原(CalbiochemGmbH,Darmstadt,德国)涂覆。将癌细胞在人重组IL-4(20ng/ml)，IL-10(40ng/ml)(Euroclone，Paignton,UK)、针对人IL-4(10ja/ml)(R&DSystems,Europe,Ud)的中和抗体的存在或缺失下培养48小时。使用抗-CD95(niAbCH-ll，IgM;UpstateBiotechnologyInc.)或对照IgM(Sigma)或异亮氨酸拉链结构TRAIL(iz-TRAIL;200ng/ml)来确定在肿瘤细胞中对CD95-或TRAIL-诱导的凋亡的敏感性。此外，在暴露于抗-IL-4和抗-IL-lO之后将癌细胞用奥沙利柏(100pM)或阿霉素(5jtiM)或顺铂(300ng/ml)，或紫杉醇(5juM)(Sigma)或依托泊苷(1UM;Biomol，PlymouthMeeting,PA)处理。存活和死亡试验。为了评估凋亡事件将DNA进行染色并实施流式细胞术分析。如在Stassi等人，CancerRes.2003，63(20):6784-90中所迷地评估亚二倍体细胞核的百分比。可替代地，将人经纯化的癌细胞一式三份以15,000个细胞/孔平铺于96-孔板上并培养。根据厂家的说明书由CellTiterAqueousAssayKit(PromegaCorporation,WI，USA)检测存活细胞的数量。将以2x150/ml平铺并用CD95-活化抗体CHll(200ng/ml)处理的HuT78细胞用作细胞死亡测量的阳性对照。免疫组织化学分析。免疫组织化学在5Mm厚的石蜡包埋的结肠、胃、前列腺、乳腺、肺、肝、胰腺、肾和膀胱的正常和肿瘤样品切片上实施。将脱腊的切片在微波炉中以0.1M的柠檬酸盐緩冲液处理IO分钟。然后，将切片用包含10%的AB人血清的Tris緩冲生理盐水(TBS)温育10分钟来阻断非特异性染色。在去除过量血清后，将切片于4。C下过夜暴露于适当稀释的针对IL-4(B-S4小鼠IgGl，CaltagLaboratories,Burlingame，CA)、IL-IO(B-NIO小鼠IgG2a，Caltag)、IL-4Rot(C-20家兔IgGSantaCruzBiotechnologyInc，SantaCruz,CA)、IL-10R(C—20家兔IgGSantaCruzBiotechnology)、TRAIL-Rl(HS101小鼠IgGl，AlexisBiochemicals,Lausen，CH)、TRAIL-R2(HS201小鼠IgGl，Alexis)的特异性抗体或同种型匹配的对照中。在暴露于一抗中之后将细胞用生物素标记的抗家兔或抗小鼠的免疫球蛋白处理，在TBS中洗涤且然后用链霉抗生物素过氧化酶(DakoLSAB2Kit,DakoCorporationCarpinteriaCA，USA)温育。使用3-氨基-9-乙基呼唑(AEC)作为比色底物检测染色。使用含水苏木精实施细胞的复染色。RT-PCR分析。根据厂家的说明书使用RneasyMiniKit(QiagenGmbH,德国)由培养的细胞制备总RNA。使用OneStepRT-PCRKit(Qiagen)对于具有1ug总RNA的每个制剂实施逆转录和PCR扩增。选捧特异性用于编码IL-4的序列5'-CCACGGACACAAGTGCGATA的核苷酸436-455(外显子1)和与核苷酸564-584(外显子3)(GenBank登录号NM000589.2)互补的5'-CCTTGCAGAAGGTTTCCTTCT-3'的两种引物来特异性扩增IL-4。GAPD基因由与作为管家对照(编码序列5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3'的核苷酸843-863和与核苷酸1033-1053互补的5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。登录号NM-002046)的相同的RNA制剂扩增。实施了三十五个循环，各包括以下的条件94t:，30秒；58°C,30秒；72X:，30秒。蛋白质分离和蛋白质印迹法分析。将细胞丸粒重悬浮于包含蛋白酶抑制剂的水冷的NP-40溶胞緩冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEGTA，1%NP-40)中，如在Stassi等人，NatureImmunology2000，1,l-6中所述。对肌动蛋白(Ab-1,小鼠IgM，Calbiochem，Da簡Udt，德国)、CD95L(G247-4，小鼠IgGl,PharMingen，SanDiego)、CD95(C-20，SantaCruzBiotechnology)、cFLIP(NF6小鼠IgGl，AlexisBiochemicals，瑞士)、PED/PEA-15(由G.Condorelli友情提供的家兔IgG)、Bc卜2(124，小鼠IgGl，UpstateBiotechnologyInc.)和Bcl-X!(H-5，小鼠IgGl，SantaCruzBiotechnology)特异性的Abs的免疫印迹，由匿-共扼的抗-小鼠或抗一家兔Abs(AmershamBiosciencesUKLimited,England)测定并用化学发光检测系统(SuperSignalWestDuraExtendeddurationSustrate，Pierce,Illinois,USA)显像。实施例1IL-4在癌细胞中的自分泌生产为了研究肿瘤的微环境是否影响癌细胞的表型和功能，评估以前发现的由癌甲状腺细胞自分泌生产的IL-4和IL-10的存在。免疫组织化学分析证实所有研究的实体瘤組织型都表达高水平的IL-4,而IL-IO很少可检测得到。结果展示在表l中。表1.细胞因子在癌细胞中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>有趣的是，对位于结肠、乳腺、肺、胃、肝、前列腺、胰腺、肾和膀胱癌细胞的IL-4的反应性，表明赘生性细胞是IL-4高产量和IL-IO低产量的根源(表1和图la)。为了排除在肿瘤细胞中观察到的反应性完全归因于由浸润T细胞释放2型细胞因子的可能性，通过RT-PCR分析新纯化的结肠、乳腺、胃和肺癌细胞。与免疫组织化学的结果一致，与相关的正常细胞相比，经纯化的癌细胞的IL-4niRNA的表达水平大大提高(图lb)，证明IL-4的自分泌生产不只局限于甲状腺癌细胞中，还出现在来自生产可观量IL-4的实体瘤的其它上皮恶性细胞中。上皮癌细胞表达高水平的抗凋亡蛋白。结肠、乳腺、胃和肺癌细胞抗拒死亡配体—^秀导和化学疗法"i秀导的细胞死亡。为了确定该不应性的机理，研究抗凋亡因子的异常表达是否可能与被损害的由死亡配体或化疗产生的"外源性"和"内源性"凋亡信号途径有关。通过免疫组织化学和蛋白印迹分析发现上皮癌细胞表达CD95、TRAIL-R1和TRAIL-R2(图2a和b)。因此，本发明的发明人评估了cFLIP、PED/PEA-15、Bel-xL和Bcl-2在结肠、乳腺、胃和肺的正常细胞和癌细胞中的存在并测量表达水平。与正常的结肠、乳腺和肺细胞相比，在新纯化的癌细胞中cFLIP和PED/PEA-15水平高出约三倍，而Bel-xL水平高出四倍(图2a)。与正常细胞相比，在所有分析的癌细胞中Bcl-2的表达水平只高出两倍。因此抗凋亡基因在结肠、乳腺、胃和肺癌细胞中的增量调节可以赋予对CD95-TRAIL-和化学诱导的凋亡的抗#_。IL-4增加了上皮赘生性细胞的存活、生长。评估了IL-4受体在正常和赘生性细胞中的表达。在石蜡包埋的切片上的免疫组织化学显示IL-4受体在所有分析过的癌组织中都表达。结果展示在以下的表2和图3a中。表2.IL-4R在癌细胞中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>为了研究IL-4对肿瘤细胞存活的可能关联，将结肠、乳腺、胃和肺的正常细胞暴露于20ng/ml的IL-4中并分析细胞生长。IL-4显著提高了结肠、乳腺和肺正常细胞的生长速率(图3b)。此外，为了确定在癌细胞对CD95、TRAIL和化疗剂的不应性中IL-4的关联，将正常的结肠、乳腺、胃和肺细胞与IL-4一起预温育且然后分析与死亡配体和化疗细胞死亡抗性有关的那些抗凋亡蛋白的表达。IL-4提高了cFLIP、PED/PEA-15、Bcl-xL和Bc卜2在正常的结肠、乳腺(图3c)和胃和肺细胞中的表达，表明IL-4的自分泌生产可能保护癌细胞免于化学疗法和死亡受体的刺激，增量调节抗凋亡因子。IL-4中和作用在肿瘤细胞中促进由CD95、TRAIL生长停滞和和化疗i秀导的细胞死亡为了直接证明IL-4的自分泌生产提供保护免于由CD95、TRAIL和化疗诱导的细胞死亡，我们研究了IL-4中和作用在结肠、乳腺和肺癌细胞中的效应。将新纯化的结肠、乳腺、胃和肺癌细胞暴露于针对IL-4的中和抗体持续48小时使癌细胞对化疗和死亡受体诱导的细胞死亡敏感证实IL-4在实体癌中的抗凋亡作用。结果展示在图4a-c中。此外，IL-4中和作用阻断结肠、乳腺、胃和肺肿瘤细胞的生长直至15天(图5)并减量调节cFLIP、PED/PEA-15、Bcl-xL和Bcl-2的表达水平。这些数据显示IL-4的自分泌生产可能在生长控制方面发挥重要作用并对于癌细胞存活是特别需要的。将来自刚手术过的肿瘤患者的组织标本通过多种标准方法如RT-PCR、蛋白印迹和免疫组织化学篩查IL-4和IL-10的表达。同样，通过相同的方法分析它们各自受体的表达。然后测试纯化的癌细胞对化疗剂诸如依托泊普、阿霉素、奥沙利铂和凋亡诱导剂诸如TRAIL和CD95配体的敏感性。结果展示在以下的表3中。表3.对死亡受体-和化学疗法诱导的细胞死亡的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>-4抗体的存在下温育时，表达IL-4和/或IL-1Q的正常抗性的原代肿瘤细胞变得对所测试的化疗剂和/或促凋亡剂敏感使得多于90%的细胞在两日内死亡。对死亡受体和化疗诱导的细胞死亡的特别有意义的致敏化在结肠、胃、乳腺、肺、前列腺和膀胱癌细胞中显示。实施例2在该实施例中报道的数据揭示纯化的结肠癌干细胞产生高水平的IL-4且将癌细胞暴露于针对IL-4的中和抗体中致使细胞对细胞毒性药物和TRAIL-诱导的凋亡敏感。此外，以下数据显示用化疗剂和抗-IL-4试剂联合治疗肿瘤显著减少了肿瘤的赘生。为了研究结肠CSC对化疗药物的敏感性，测量了暴露于顺铂(300ng/ml)和奥沙利钼(100jaM)中的结肠CSC球状体的存活，剂量相等于在体内癌症治疗期间达到的剂量。此外，用诱导凋亡的死亡配体TRAIL(200ng/ml)治疗结肠CSC。来自人结肠癌标本的原代(贴壁)细胞对所有三种测试药物体外都显示敏感性，而结肠CSC显著耐药，证实CSC对药物诱导的凋亡是相对惰性的(图6a)。这表明CSC可能逃避抗肿瘤疗法并可能是化学疗法无效的根本原因。为了形式上证明IL-4在结肠CSC中的生产是抗凋亡蛋白增量调节并由此疗法不应性的原因，将CSC用IL-4-中和抗体预处理两天且然后测量细胞死亡和抗凋亡表达。之前展示的在癌症中由IL-4调控的c-FLIP、Bel-xL和PED、抗凋亡蛋白的蛋白水平在暴露于抗IL-4的CSC中下降了~两倍(图6b-c)。更重要的是，在IL-4阻断的CSC之后，通过用化疗药物或TRAIL(图6d-e)治疗显著提高细胞死亡率。为了直接证实IL-4保护由CSC产生的结肠癌免受化疗药物，研究了IL-4中和作用的体内效应。允许肺瘤生长IO天(大小~0.2cm3)且然后用针对IL-4的中和抗体或对照IgG每周两次肿瘤内治疗3周。尽管用奥沙利铂腹膜内(i.p.)治疗每周一次治疗4周，与对照IgG联合降低了小鼠内肿瘤的大小，通过IL-4中和抗体(图7a和7b)显著提高了化疗治疗的效果。实施例3IL4RIL13R-Fc融合多肽的构建体将信号肽和IL4-受体-a的胞外域(NCBI登录号NP-000409的aal-aa231)N-末端地融合到IL13-受体a的胞外域(NCBI登录号NP—001551的aa27-aa343)上。在IL4R-a1-序列(Gly2-〉Va12和Cys207->Ser207)中引入两个点突变，并在IL13R-otl-序列(Cys46-〉Ala46)中引入单个点突变。点突变的数字标示还涉及NCBI-数据库进入号，NP—000409对应IL4R-ocl和NP—001551对应IL13R-otl。将该IL4RIL13R蛋白质序列融合在人IGHG1(NCBI登录号AAH69020的aa254-aa479)的Fc部分。此外C-末端添加柔性连接单元和Flexstreptag-II基序(SSSSSSAWSHPQFEK)。将获得的如下所述的IL4RIL13R-Fc-构建体的氨基酸序列反翻译(backtranslated)成合成DNA-序列且将密码子针对基于哺乳动物细胞的表达优化。基因合成由ENTELECHONGmbH(Regensburg，德国)进行。将最终的表达盒使用质粒的独特Hind-III-和Not-I-位点亚克隆为pCDNA4-HisMax-主链。SEQIDNO:1SEQIL4RIL13R-Fc.PRO关键词蛋白质起始点1M^WLCSGLLFpySCLVLI^QVASSGNMKVLQEPTCVSDYMS工STCEWKMNGPTNCSTELRL一61LYQIAT"SEAHTCIPENNGGAGCVCHLiMDDWSADNYTLDLWAGQQt^WKGSFKPSEK121VKPRAPGN3LTVHTNVSDTLLJLTWSNPYPPDNYUYNHLTYAVNIWSENDPADFRIYNVTYL181EPSLRIAASTLKSGISYRARVRAWA吸YN了TWSEWSPSTKWHNSYREPFEQAPTETQPPV241TNLSVSVENL&TVIWTVmPPEGASSNCSLWYFSHFGDKQDKKIAPETRRS工EVPUVEKZC一301LQVGSQCSTNESEKPSILVEKCISPPEGDPESAVTELQCIWKNLSYMKCSWLPGRNTSPD361TNYTLYYWHRSLEKIHQCENIFREGQYFGCSFDI/TKVKDS^FEQHSVQIMVKDNAGKIKP421SFNIVPLTSBVKPDPPH工KNLSFHNDDLYVOWENPQNFISRCLFYEVEVNNSQTETHNW■481YVGEAKCEMPEFERNVENTSCFMVPGVLPDTLNTVRIRVKTNKLCYEDDKLWSKWSQEMS541IGKKRNSTGDKTHTCPPCPAPELU3GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDP601EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYWSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVYNKALPAP661IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY721KTTPLVLDSDGSFFLYSKXTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSSSSS781SAWSHPGFEKaal-aa23:信号肽aa24-aa231:IL4R-ctlECDaa232-aa548:IL13R-alECDaa549-aa775:IGHG1的Fc部分aa786-aa790:Flexstreptag-IIIL4R-IL13R-Fc融合多肽的修饰可以如下所示-缺失信号肽或存在异源信号肽；-存在不同的，例如缩短的IL-4RECD，例如无或有不同的突变，特别是点突变，-存在不同的效应器结构域，-存在不同的Fc结构域，和/或-缺失C-末端純化结构域(特别是对于制药学应用)。实施例4IL4R-Fc融合多肽的构建体将信号肽和IL4-受体-a的缩短的胞外域(NCBI登录号NP—000409的aal-aa224)N末端融合到人IGHG1的Fc部分(NCBI登录号AAH69020的aa250-aa479)。在IL4R-oc1-序列(Gly2->Val2和Cys207->Ser207)中引入两个点突变。在所述两个结构域之间插入单个的甘氨酸并将在铰链区的人IGHGl的Lys251突变为精氨酸。所述突变的数字标示还涉及NCBI-数据库进入号，NP—000409对应IL4R-ocl和NCBI登录号AA,020对应IGHG1)。此外，C末端添加柔性连接单元和Flexstreptag-II基序(SSSSSSAWSHPQFEK)。将获得的如下所述的IL4R-Fc-构建体的氨基酸序列反翻译成合成DNA-序列并将密码子基于哺乳动物细胞的表达优化。基因合成由ENTELECHONGmbH(Regensburg，德国)进行。将最终的表达盒使用质粒的独特的Hind-III-和Not-I-位点亚克隆为pCDNA4-HisMax-主链。SEQIDNO:2SB(JIL4RA-Fc.PR0关键词蛋白质颜色序列=1特征=0起始点1MYWLCSGLLFPVSCLVLLGVPTNCSTELRL61LYQLVFLLSEAHTCIPENNGWKGSFKPSEH121VKPRAPGNLTVHTNVSDTL^DFRIYNVTYL181EPSLRIAASTLiKSGISYRARKTHTCPPCPA241PEl^GGPSVF1LFPPKPKDTLVEVHNAKTKP301REEQYNSTYRWSVLTVLHQQPREPQVYTL361PPSREEMTKNQVSLTCliVKGGSFFLYSKLT421VDKSRWQQGNVFSCSVMHEAAal-aa23:IL4R-ccl信号肽Aa24-aa224:IL4R-cclECDAa225-aa455:IGHG1的Fc部分Aa456-aa470:Flexstreptag-II缩短的IL-4R融合多肽的修饰如下所示-缺失信号肽或存在异源信号肽；21ASSGNWKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGGAGCVCHLLMDDWSADNYTLDLWAGQQLLLTWSNPYPPDNYLYNKLTYAVNIWSENDPAVRAWAQ§YNTTWSEWSPSTKWHNSGSjgSCDMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDLHNHYTQKSLSLSPGSSSSSSAWSHPQFEK-存在不同的，例如缩短的IL-4RECD，例如无或有不同的突变，特别是点突变，-存在不同的Fc结构域，-IL-4RECD和Fc结构域之间的不同融合区，例如删除一个或多个氨基酸序列RSC(位置227-229)和/或-C-末端纯化结构域的缺失(特别是对于制药学应用)。实施例5IL4-结合蛋白、IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc的表达和纯化将在补加了10%FBS、100单位/ml青霉素和100ng/ml链霉素的DMEM+GlutaMAX(GibCo)中生长的Hek293T细胞分别用编码IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc的质粒瞬时转染。转染后三天收获包含重组蛋白的细胞培养上清液并通过在300g下的离心净化接着通过0.22^im的无菌过滤器过滤。用于亲和纯化将Streptactin琼脂糖填充到柱(凝胶床1ml)中，用15ml緩冲液W(100mMTris-HCl、150mMNaClpH8.0)平衡并将相应的细胞培养上清液以4ml/min的流速施加到所述柱中。随即，将所述柱用緩沖液W洗涤并通过添加6xlml緩冲液E(100mMTris-HCl、150mMNaCl、2.5mM脱硫生物素pH8.0)将被束绰的IL4R-Fc或IL4R-IL13R-Fc逐步洗脱。将洗脱物级分的蛋白质量量化并将峰级分通过超滤浓缩并通过体积排阻色谱法(SEC)进一步纯化。在图8A中展示了IL4R-IL13R-Fc的Streptactin亲和纯化接着进行银染色的SDS-PAGE。SEC在Superdex200柱上使用Akta色镨系统(GE-Healthcare)实施。将所述柱用磷酸盐緩冲的盐溶液平衡并将浓缩的、streptactin纯化的IL4R-Fc或IL4R-IL13R-Fc各以0.5ml/min的流速加载到SEC柱上。通过在280nm处的吸光率监测的洗脱图谱显示对于IL4R-IL13R-Fc在10.31ml(图8B)和对于IL4R-Fc在12.97ml(图9A)的主蛋白质峰。此外通过SDS-PAGE和银染色分析在变性条件下IL4R-Fc的SEC组分(图9B)。为了确定在天然条件下的表观分子量将Superdex200柱加载已知分子量的标准蛋白质。根据标准蛋白质的洗脱体积计算校准曲线并测得经纯化的IL4R-Fc的表观分子量为137KDa，其与通过SDS-PAGE观测的分子量很好地吻合。对于单体蛋白质，基于IL4R-Fc的氨基酸序列的理论分子量为52.8Kda。根据生物化学分析IL4R-Fc极其可能表达为蛋白质二聚体。对于IL4R-IL13R-Fc，基于SEC的表观分量计算为约600KDa。基于SDS-Page分析，所述蛋白质为具有约250Kda的单条带。基于IL4R-IL13R-Fc的氨基酸序列的理论分子量为87.7KDa。原则上，所述分子的构建体应该导致具有约180Kda的理论分子量的稳定二聚蛋白质。因此由SEC观测到的高表观分子量显示在SEC中蛋白质的不正常行为或进一步的低聚反应。IL4-下拉试验为了测试IL4特异结合IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc，将4pg的这两种蛋白质各通过它们的Strep-Tag固定于Streptactin琼脂糖上。随即将经固定的蛋白质与400ng重组表达的人白介素4(IL4)在总体积400pi的磷酸盐緩冲的盐溶液中温育60分钟。随即洗涤微珠并将被束绰的蛋白质分别用在总体积40|iil的洗脱緩冲液中的脱硫生物素洗脱。最后将经洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE和银染色来分析。如在图IO中所示，由在对照试验中不能观察到的IL4蛋白质(12Kda)的存在说明IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc都显示了对人IL4的特异结合。实施例6对癌症干细胞和原代肿瘤细胞的体外有效性为了测试IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc诱导凋亡的能力，将这两种蛋白质单独或与阿霉素联合添加到乳腺癌干细胞生长介质中。图1U展示了用PBS(w/o)或10|jgIL4R-Fc、IL4R-IL13R-Fc或抗IL4-抗体预处理24小时并随后暴露于5|jM阿霉素中另24小时的乳腺癌细胞球状体的免疫荧光分析。将所述细胞用橙色的吖啶/溴化乙锭染色(红色死亡细胞；绿色存活细胞)。与单一治疗(只有阿霉素)相比，阿霉素联合IL4R-Fc或IL4R-IL13R-Fc,分别明显提高了凋亡的乳腺癌干细胞的量。区分凋亡和存活细胞，随后标绘的细胞存活的百分数也证实联合治疗对于诱导凋亡的有效性(图IIB)。重要的是在与该实验中用作阳性对照的针对IL4特异性抗体所示的相同的范围内，IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc都能够致使乳腺癌干细胞对阿霉素诱导的凋亡敏感。对原代结肠癌细胞，测试了IL4R-Fc和IL4R-IL13R-Fc构建体与奥沙利铂的联合治疗。将原代结肠癌细胞用PBS(w/o)或10|jgIL4R-Fc、IL4R-IL13R-Fc或抗IL4-抗体预处理24小时并随即暴露于100|jM奥沙利铂中另24小时。图表展示了通过MTS分析(CellTUer96，Aquos，Promega)测量的细胞存活的百分比。如在图11C中所示的那样，通过与单独用奥沙利铂相比显示降低的细胞存活，这两种构建体都能够致使原代结肠癌细胞对奥沙利柏诱导的凋亡敏感。权利要求1.诊断癌症类型的方法，包括步骤(a)提供来自实体瘤的包含肿瘤细胞的样品，(b)测定至少一种抗凋亡的细胞因子在所述肿瘤细胞中的表达，和(c)将实体瘤分类为非细胞因子表达性肿瘤或细胞因子表达性肿瘤。2.根据权利要求l的方法，其中抗凋亡细胞因子为IL-4和/或IL-10，优选IL-4。3.根据权利要求1和2的方法，其中实体瘤分类为IL-4表达性或IL-4非表达性胂瘤。4.根据权利要求1和2的方法，其中实体瘤分类为IL-IO表达性或IL-10非表达性肺瘤。5.根据权利要求1至4的方法，其中实体瘤分类为IL-4兼IL-IO表达性肿瘤或非IL-4兼非IL-10表达性肿瘤。6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中实体瘤为上皮肿瘤。7.根据权利要求6的方法，其中上皮肿瘤选自由甲状腺、乳腺、前列腺、膀胱、结肠、胃、胰腺、肾、肝和肺的癌组成的组。8.根据权利要求7的方法，其中肿瘤优选为结肠、胃、乳腺、肺、膀胱或前列腺的癌。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中肿瘤细胞为原代肿瘤细胞和/或癌干细胞。10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中检测抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中的表达包括在蛋白质水平上和/或在核酸水平上的检测。11.根据权利要求10的方法，其中在蛋白质水平上的检测包括检测抗凋亡细胞因子，优选用免疫化学和/或质镨分析法。12.根据权利要求10的方法，其中在核酸水平上的测定包括用核酸杂交和任选地扩增法，优选用RT-PCR法测定抗凋亡细胞因子mRM的表达水平。13.根据前述权利要求中任一项的方法，还包括步骤(d)确定细胞因子表达性胂瘤细胞在所述表达的细胞因子和/或其受体的拮抗剂存在和/或缺失的情况下对至少一种化疗剂或促凋亡剂的敏感性，和(e)任选地选择癌症类型-特异性治疗。14.根据权利要求13的方法，其中在步骤(d)中确定细胞因子表达性肿瘤的细胞对其敏感的化疗剂或促凋亡剂。15.根据权利要求13或14的方法，其中在步骤13(e)中，选择包括给予细胞因子中和剂与化疗剂或促凋亡剂组合的疗法。16.根据权利要求14或15的方法，其中化疗剂选自抗代谢物、DNA碎裂剂、DNA-交联剂、嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、拓朴异构酶I和II抑制剂、微管定向剂、激酶抑制剂、激素和激素拮抗剂。17.根据权利要求16的方法，其中化疗剂选自顺铂、卡铂和奥沙利铂。18.根据权利要求14或15的方法，其中促凋亡剂选自TRAIL和CD95配体。19.根据权利要求14至18中任一项的方法，其中细胞因子中和剂为抗体，优选抗-IL-4抗体和/或抗IL-10抗体或其抗原结合片段。20.根据权利要求19的方法，其中抗IL-4抗体为衍生自杂交瘤细胞ECACC93100620的抗体或其抗原结合片段。21.根据权利要求14至18中任一项的方法，其中细胞因子中和剂为可溶的IL-4受体多肽或融合多肽。22.以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂，用于制备治疗微小残留病的药物的用途。23.以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂，用于制备治疗分类为细胞因子表达性肿瘤的癌症类型的药物地用途。24.以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂，用于制备与手术和/或放射疗法相结合地治疗分类为细胞因子表达性癌症类型的药物的用途。25.根据权利要求24的用途，其中所述药物用于与手术和/或放射疗法同时、分开或相继的联合疗法。26.以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂，用于制备治疗细胞因子表达性肿瘤的药物的用途，其中同时开始给予(i)和(ii)。27.以下试剂的联合(i)至少一种细胞因子中和剂和(ii)至少一种化疗剂或促凋亡剂，用于制备治疗细胞因子表达性胂瘤的药物的用途，其中逐步开始给予(i)和(U)。28.根据权利要求27的用途，其中在(ii)之前〉l周开始给予(i)或其中在(i)之前>1周开始给予(ii)。29.可溶的IL-4受体多肽，其包含C末端缩短的细胞外IL-4受体结构域。30.权利要求29的多肽，其为融合多肽。31.编码权利要求29或30的多肽的核酸分子。全文摘要本发明涉及诊断癌症类型的方法，其中测定抗凋亡细胞因子在肿瘤细胞中的表达。本发明的鉴别诊断用于将肿瘤疾病分类并推荐所需要的治疗和用于监控进程和对治疗的反应。文档编号G01N33/574GK101529253SQ200780029578公开日2009年9月9日申请日期2007年6月21日优先权日2006年6月21日发明者C·杰弗斯,G·斯塔希,M·托达洛,M·斯尔曼,O·黑尔申请人:阿珀吉尼科斯有限公司