一种鱼类b细胞激活因子的免疫应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎B细胞激活因子的免疫应用。
【背景技术】
[0002] B细胞活化因子（B cell activating factor，BAFF)，属于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)家族，是一个典型的II型跨膜蛋白，分子量约为31kDa，由胞质区、 跨膜区和胞外功能区组成。在哺乳动物中BAFF在体液免疫中发挥着重要作用，其能结合并 刺激B淋巴细胞，并分泌免疫球蛋白，且它对T细胞的功能亦有一定的调节作用。BAFF与其 三个受体BAFF-R、TACI和BCMA结合后可激活NF- κ B、mTOR、p38、JNK等信号通路，维持免 疫细胞生存、分化和成熟，并且具有抗凋亡的作用。BAFF对B细胞的发育过程具有关键的 调节作用，在BAFF基因完全缺失的小鼠中，B淋巴细胞的发育和抗体的产生受到严重影响。 因此，BAFF为一种与机体免疫调控密切相关的细胞因子。目前鱼类BAFF研宄很少，其功能 几乎完全未知。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种鱼类B细胞激活因子的免疫应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种鱼类B细胞激活因子的免疫应用，半滑舌鳎B细胞激活因子作为疫苗增强因 子的应用。
[0006] 进一步的说，半滑舌鳎B细胞激活因子作为DNA疫苗增强因子的应用。
[0007] 所述半滑舌鳎B细胞激活因子（BAFF)的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀 释液按体积比为1:1比例混合。
[0008] 所述半滑舌鳎B细胞激活因子（BAFF)的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲 液稀释至400ug/ml。
[0009] 所述BAFF表达质粒是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增， PCR产物与载体pBS-T连接，获得质粒pBSBAFF ;用限制性内切酶EcoRV酶切pBSBAFF后回 收0. 5kb片段，与质粒pCN3连接，得BAFF表达质粒pBAFF ;
[0010] 所述 Fl 为 5? -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3? ；R1 为 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
[0011] 本发明具有如下优点：本发明的半滑舌鳎B细胞激活因子BAFF能够显著提高DNA 疫苗的免疫保护效应。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明实施例提供的BAFF增强疫苗诱导的血清抗体水平图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。
[0014] 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：
[0015] 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用"天根生化科技 (北京）有限公司"的相应试剂盒。
[0016] 2.大肠杆菌用 Hanahan 方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)〇
[0017] 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"纽英伦生物技术有限公司"，北京。
[0018] 实施例1
[0019] BAFF的表达质粒pBAFF的构建：
[0020] 本发明的 BAFF 的序列已公开（GenBank accession No. XM_008328682)。BAFF 由 261个氨基酸组成，有一个保守的TNF(tissue necrosis factor)结构域。以半滑舌鳎 cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为：94°C 60s预变性模板DNA，然后 94°〇4〇8,51°〇6〇8,72°〇6〇8,5个循环后改为94°〇4〇8,58°〇6〇8,72°〇6〇8,30个循环。 PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于"天根生化科 技有限公司"，北京）于室温连接2 - 4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有 100 μ g/ml安卡青霉素（Ap)、40 μ g/ml 5-溴-4-氯-3-吲噪-β-D-乳糖苷（x-gal)和 24 μ g/ml异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)的LB固体培养基上培养18 - 24小时，挑出 白色转化子，提取质粒，命名为质粒pBSBAFF。将质粒pCN3 (构建过程参见Jiao XD，Zhang M, Hu YH, Sun L Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine 2009;27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收 5. 4kb 片段，同时将 pBSBAFF用EcoRV酶切回收0. 5kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接 2 - 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培养基上培养 18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pBAFF。通过DNA测序分析证明了 pBAFF为含 有TNF结构域的BAFF序列的表达质粒，其中pBAFF质粒中的BAFF序列与GenBank access ion公开的No. XM_008328682中记载的一致。
[0021] 所述LB组成成分按重量百分比计：1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，1. 0 %氯化 钠，97. 5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5' -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3' ；R1 为 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
[0022] 实施例2
[0023] BAFF表达质粒pBAFF的免疫应用
[0024] 步骤1)免疫半滑舌鳎
[0025] 将迟缓爱德华氏菌DNA疫苗质粒pCEsal(其构建过程见Sun Y，Liu C，Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish Shellfish Tmmunol. 2011 ； 30:273 - 9.)和上述实施例1的pBAFF分别在PBS中稀释至400ug/ml，将二者等体积混合， 即为pCEsal+pBAFF混合液。将pCEsal和pBAFF分别在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCEsal 稀释液和pBAFF稀释液。将140条半滑舌鳎（重约14. 5g)随机分为4组，每组35条。将 这4组分别命名为A、B、C和D。将A组的每条鱼肌肉注射0.1 ml pCEsal稀释液，将B组的 每条鱼肌肉注射0.1 ml pBAFF稀释液，将C组的每条鱼肌肉注射0.1 ml pCEsal+pBAFF混合 液，将D组（对照组）的每条鱼肌肉注射0· Iml PBS。
[0026] 所述PBS组成成分按重量百分比计：0. 8 % NaCl, 0. 02 % KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0· 024% NaH2PO4,余量为水。
[0027] 步骤2)细菌悬液制备
[0028] 将迟缓爱德华氏菌TXl在LB培养基中培养至0D_为0.8,然后离心（5000g， 4°C ) lOmin。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为2xl06cfu/ml。
[0029] 所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保 藏编号为：CGMCC No. 2330,分类命名为迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda)，保藏日期 为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研宄所。
[0030] 步骤3)抗体效价检测
[0031] 在上述步骤1)免疫后第30天，自每组鱼中取5条鱼，用酶联免疫吸附剂测定 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法检测血清中疫苗特异抗体水平（具体 方法参考文献 Sun Y, Liu C, Sun L. Construction and analysis of the immune effect of an Edwardsiella tarda DNA vaccine encoding a D15_like surface antigen. Fish Shellfish Immunol. 2011;30:273 - 9.)。结果表明，与对照鱼相比，免疫 pCEsal 和 pCEsal+pBAFF组鱼皆能产生疫苗特异性抗体，且后者的抗体水平显著高于前者（参见图 1)。免疫PBAFF组鱼无疫苗特异性抗体产生。
[0032] 步骤4)攻毒感染和免疫保护效应检测
[0033] 在上述步骤1)免疫后第30天，将4组的每条鱼腹腔注射IOOul上述步骤2)的细 菌悬液。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总 死亡数目：A组，10条；B组，22条；C组，5条；D组，26条。利用下列公式计算相对免疫保护 效率（RPS):
[0034] RPS = IOOx(1 -免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比）
[0035] 由此得出免疫pCEsal、pBAFF和pCEsal+pBAFF组鱼的RPS分别为 66. 7% ,26. 7% ,83. 3%，其中免疫pCEsal+pBAFF组鱼的RPS显著（P〈0. 01)高于其它组。
[0036] 综上所述，pBAFF是一种高效的疫苗增强因子，能显著提高疫苗诱导的抗体水平 和免疫保护效应。
【主权项】
1. 一种鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：半滑舌鳎B细胞激活因子作为 疫苗增强因子的应用。
2. 按权利要求1所述的鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：半滑舌鳎B细 胞激活因子作为DNA疫苗增强因子的应用。
3. 按权利要求1或2所述的鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：所述半滑 舌鳎B细胞激活因子（BAFF)的表达质粒的稀释液与DNA疫苗质粒的稀释液按体积比为1:1 比例混合。
4. 按权利要求3所述的鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：所述半滑舌鳎B 细胞激活因子（BAFF)的表达质粒与DNA疫苗质粒采用PBS缓冲液稀释至400ug/ml。
5. 按权利要求3所述的鱼类B细胞激活因子的免疫应用，其特征在于：所述BAFF表达 质粒是以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物与载体pBS-T连 接，获得质粒pBSBAFF;用限制性内切酶EcoRV酶切pBSBAFF后回收0. 5kb片段，与质粒pCN3 连接，得BAFF表达质粒pBAFF; 所述Fl为 5? -GATATCGCCACCATGACTATTGTGTCTCAGT-3? ；R1 为 5' -GATATCAACCAGTTTGAAAGCG-3'。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是半滑舌鳎B细胞激活因子的免疫应用。半滑舌鳎B细胞激活因子作为疫苗增强因子的应用。本发明的BAFF表达质粒能显著增强DNA疫苗的免疫保护效应。CGMCC No.233020080109
【IPC分类】A61K38-17, A61P37-04, C12N15-28, A61K48-00, C12N15-85
【公开号】CN104784678
【申请号】CN201510096091
【发明人】孙黎, 孙云, 迟恒
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月4日