专利名称：：一种基因工程免疫刺激因子及其免疫增效的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于DNA重组和药物
技术领域：
，具体涉及编码一种新的免疫剌激因子(ICEM，ImmuneCo-enhancingMolecule)的DNA序列，用基因工程制备该免疫剌激因子(ICEM)的方法，以及该免疫剌激因子(ICEM)在縮短乙肝疫苗抗体产生时间和提高抗体效价中的应用。
背景技术：
：乙型肝炎病毒感染(h印atitisBVirus,HBV)是全球性的公共卫生问题，全世界约有3.5亿乙型肝炎病毒感染者，我国也是乙肝高发区，约有1.2亿乙肝携带者。我国预防乙肝病毒传染的主要手段是接种乙肝疫苗，但是目前使用的乙肝疫苗存在免疫次数多，免疫周期长，接种人群约有10%15%对疫苗无反应或弱反应，急需新的方法提高疫苗的免疫效力。本发明用基因工程手段将免疫剌激因子(ICEM)基因克隆到原核表达载体并在大肠杆菌或酵母中表达纯化获得重组蛋白，与重组酵母乙肝疫苗联用可显著提高抗HBsAg抗体效价。
发明内容本发明的目的是提供一种新的免疫增效分子，作为乙型肝炎病毒疫苗的免疫剌激因子(ICEM)及编码该免疫剌激因子(ICEM)的基因，并提供表达该蛋白的方法和应用。本发明提供的乙型肝炎病毒疫苗的免疫剌激因子(ICEM)及其编码基因，其基因序列和氨基酸序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。将该免疫剌激因子(ICEM)基因克隆到pBV220原核表达载体中，在大肠杆菌中进行温度诱导表达，收集并裂解大肠杆菌，提取包涵体，再用Ni-NATagarose柱亲和纯化，经透析复性后最终得到目的蛋白。评价该蛋白对乙肝疫苗免疫效果的影响将实验动物分为三组，ICEM:乙肝疫苗=3:l组(摩尔数)，l:l组，乙肝疫苗对照组。以小鼠为例，于免疫后的第15天，27天，39天取血，分离血清。ELISA法测定小鼠体内抗HBs抗体的水平。SPSS软件分析实验组和对照组，结果发现该蛋白可以明显增强小鼠体内抗HBs抗体的水平。ICEM:乙肝疫苗=3:i组(摩尔比)的抗体效价明显高于对照组和i:i组，p<o.oi，说明icem具有上调小鼠体内抗乙肝表面抗原抗体的能力，可以增强乙肝疫苗的免疫效果。由此可见，ICEM可以作为一种乙肝疫苗的佐剂应用于乙肝疫苗领域。ICEM与乙肝疫苗联用，既能增强乙肝疫苗的免疫效果，又可以减少乙肝疫苗的注射次数。另一方面，根据ICEM对抗乙肝表面抗原抗体的特异性增效功能，可将其用于乙型肝炎病毒携带者和乙肝病人的治疗性乙肝疫苗。图1ICEM对Balb/c小鼠抗HBs抗体水平的影响，小鼠血清稀释1000倍后ELISA测定小鼠体内抗HBs抗体的水平。具体实施例方式以pBV-220质粒为基础，构建增效剂的原核表达载体。具体步骤如下设计并合成引物P1、P2PI:5'-CCGGAATTCATGGACGTCTGGGGCCAAGGG-3';(SEQIDNo.3)P2:5'-CGCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTTTACCCGGGGACAGGGAGA-3';(SEQIDNo.4)Pl、P2为扩增编码增效剂基因的引物。PI引入起始密码子ATG及EcoRI酶切位点GAATTC;P2引入终止子TGA，6XHis及BamHI酶切位点GGATCC。构建表达载体的具体步骤如下以P1、P2为引物，PCR扩增ICEM基因编码序列，产物以EcoRI和BamHI酶切(Takara公司)。以EcoRI和BamHI双酶切pBV220质粒。各酶切片断琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4DNA连接酶连接各片段。所得到的重组质粒即ICEM的表达载体。按常规将表达载体转化大肠杆菌DH5a，从氨苄抗性菌落中分离质粒，酶切鉴定，测序确认。所得的细菌即为本发明的工程菌。挑取一个工程菌菌落于液体培养基中培养并进行温度诱导发酵首先在37t:培养至0D6。。=0.6，然后升温至42tH秀导发酵5小时，发酵结束后离心收集菌体，裂解菌体，提取包涵体，包涵体粗纯后用Ni-NATagarose柱亲和纯化，经透析复性后最终得到目的蛋白。用Western和ELISA实验验证所获得的蛋白正是所需要的目的蛋白。评价该蛋白对乙肝疫苗免疫效果以小鼠为例，选取6周龄Balb/c小鼠，雌雄各半，小鼠大腿肌肉注射，免疫方案如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>于免疫后的第15天，27天，39天取血，分离血清。ELISA法测定小鼠体内抗HBs抗体的水平将HBsAg蛋白包被在ELISA板上，封闭洗板后加入稀释1000倍的小鼠血清，洗板后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，最后经0PD底物显色30min，2mo1硫酸终止反应，酶标仪495nm波长读数.结果(见图1)发现，ICEM:乙肝疫苗=3:1组(摩尔比)的抗体效价明显高于对照组和i:i组，说明该蛋白具有上调小鼠体内抗乙肝表面抗原抗体的能力，可以增强乙肝疫苗的免疫效果。具体应用传统乙肝疫苗的免疫效果在人群中的个体差异很大，常规注射三针以后仍有很多个体不能产生有足够保护作用的抗体。本发明提供的这种新的免疫剌激因子(ICEM)与乙肝疫苗联用，能够增强乙肝疫苗的免疫原性，增加体内抗HBs抗体的效价，从而提高疫苗的免疫效率，并减少乙肝疫苗用量和注射次数。序列表SEQIDNo.1基因核苷酸，ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAASEQIDNo.2蛋白氨基酸GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNo.3引物PI5'-CCGGAATTCATGGACGTCTGGGGCCAAGGG-3'5SEQIDNo.4引物P25'-CGCGGATCCTCAATGATGATGATGATGATGTTTACCCGGGGACAGGGAGA-权利要求一种免疫刺激因子基因，其特征在于具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.—种免疫剌激因子蛋白，其特征在于具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。3.如权利要求2所述的免疫剌激子蛋白或权利要求1所述的免疫剌激因子作为乙型肝炎疫苗佐剂的应用。全文摘要本发明属于DNA重组和药物
技术领域：
，具体为一种基因工程免疫刺激因子及其免疫增效的应用。本发明根据生物信息学及生物大分子结构与功能关系和免疫学原理，设计并合成该免疫刺激因子(ICEM)DNA序列，通过基因工程方法将该基因克隆到原核或真核表达载体，表达纯化后获得重组蛋白。ICEM与其他抗原交联，可显著增强这些抗原的免疫效果。ICEM与乙型肝炎病毒疫苗联用可显著提高疫苗的免疫效果，增加抗乙肝表面抗原抗体的产生。ICEM可以用作乙肝疫苗的佐剂。文档编号A61K39/39GK101792759SQ201010022789公开日2010年8月4日申请日期2010年1月14日优先权日2010年1月14日发明者朱乃硕,杨超,龚立申请人:复旦大学