专利名称：一种白桂木提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药和食品技术领域，涉及一种白桂木提取物及其制备方法和用途。
具体地，涉及一种白桂木的乙酸乙酯提取物及其制备方法和它作为黑色素生成抑制剂或天 然抗氧化剂的用途。
背景技术：
随着审美标准的提高，人们对拥有美白细致的肌肤的要求日益增加。近些年，皮肤 美白及抗衰老类化妆品市场的开发日趋受到重视，美白同时抗衰老化妆品已成为护肤类化 妆品的主流品种之一，其消费市场在不断扩大。 人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量和分布。皮肤色素沉着是由于黑色素细胞内 黑色素产生过多导致的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成过程中必不可少的关键酶。酪氨酸 酶催化酪氨酸氧化成多巴并且多巴再进一步氧化成黑色素的前体物多巴醌。因此酪氨酸 酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑和老年斑等。虽然目前已有 多种酪氨酸酶抑制剂用于美白，但依然存在问题，不能满足消费市场的需要。曲酸由于不稳 定，美白效果较弱；氢醌化合物具有强烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以诱导皮肤病以 及细胞毒性，许多国家已经禁止使用；熊果苷较安全，但作用微弱。因此，从天然植物中寻找 安全、有效的美白成分已成为化妆品行业研究的趋向。 紫外线照射、电脑辐射、空气污染等均会使皮肤产生大量的自由基，自由基极不稳 定，它使皮肤细胞的细胞膜发生脂质过氧化反应，破坏皮肤的胶原蛋白及弹性纤维，并剌激 黑色素细胞，增加黑色素的分泌，从而导致皮肤干燥松弛，失去弹性，产生皱纹，皮肤变黄变 黑，产生色素沉积和雀斑，从而加速皮肤衰老，并可以诱发皮肤癌变等。因此，美白并能抗自 由基的"全美白概念型美白齐U"具有良好的应用前景。目前市场上这样的产品如Vc曲酸酯 和曲酸亚麻酸酯均拥有了良好的消费市场。具有这样多重功效的天然产物更是具有潜在的 应用价值。 另外，随着生活水平的不断提高，人们对健康绿色食品也有了更新更高的要求。高 效、安全、无毒、纯天然的食品添加剂越来越受到人们的青睐，因此开发高效天然的抗氧化 剂以取代现有化学合成的抗氧化剂已成为今天国际食品界的主旋律。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种白桂木提取物。 本发明的另一个目的是提供上述白桂木提取物的制备方法。 本发明的又一 目的是提供上述白桂木提取物的用途。 本发明的还一目的是提供一种组合物，其含有上述的白桂木提取物。 根据本发明的第一个目的，本发明提供了一种白桂木提取物，该提取物中，异戊烯
基取代的黄酮类化合物的含量为20 40重量％，优选为28 40重量％ ;其中，所述异戊
烯基取代的黄酮类化合物为artopetelin B、artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I。
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采用高效液相色谱法(HPLC-UV)测定本发明白桂木提取物中异戊烯基取代的黄 酮类化合物的含量。色谱条件为色谱柱为C18分析柱，流动相为40-90% (v/v)甲醇-磷 酸水溶液或40-90% (v/v)乙腈-磷酸水溶液，检测波长为300nm，检测时间为60分钟，用 外标法测定保留时间为10.0 50. Omin范围内的异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量，计 算含量为20 40重量％，优选为28 40重量％。其中，所述的异戊烯基取代的黄酮类化 合物为artopetelin B、 artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I。所述异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin禾口
brosimone I的结构式如下
Artocarpin Brosimone I 根据本发明的第二个目的，本发明提供了上述白桂木提取物的制备方法。该制备 方法为 将白桂木(Artocarpus hypargyreus Hance)的茎枝粉碎后，用溶剂提取制备得到
总提取物；将总提取物溶于水后，依次以卣代烃类溶剂和酯类溶剂萃取；取酯类溶剂萃取
相，回收溶剂后干燥，即得到本发明的白桂木提取物。 所述溶剂为醇、水或其混合物。 所述醇为乙醇或甲醇等。 优选地，所述溶剂为95% (v/v)含水乙醇。 所述卤代烃类溶剂可以为氯仿或二氯甲烷；优选为氯仿。 所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯。 所述提取使用的提取方法优选为浸泡或渗漉。 根据本发明的第三个目的，本发明提供上述白桂木提取物的用途，即本发明的白 桂木提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途和在制备自由基清除剂中的用途。
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由此，本发明的白桂木提取物可以用于化妆品、药品、食品和保健品领域。 具体地，本发明的白桂木提取物在制备黑色素生成抑制剂中的用途和在制备抗氧
化剂中的用途。从而可以预防皮肤衰老、保护皮肤或美白皮肤，治疗包括变色、雀斑、斑点等
的皮肤色素沉着。可以作为预防食物因被氧化而变色或防止产品氧化的天然抗氧化剂，用
于食品和保健品的保鲜；具体可以作为动植物油脂、焙烤食品、水产品、肉制品、调味剂及饮
料、医药、化妆品和保健食品的抗氧化剂，以及预防食物包括水果、蔬菜和鱼变色。 根据本发明的第四个目的，本发明提供了一种组合物，其含有上述的白桂木提取物。 在上述组合物中，本发明的白桂木提取物作为酪氨酸酶抑制剂和自由基清除剂可 以单独使用，也可以与其它化合物混合使用，并可以进一步含有化妆品/药学上所允许的 辅料或常规的载体，以制备成用作抑制黑色素生成或清除自由基的延缓衰老的化妆品或药 物。 所述的组合物可以制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
图1为本发明白桂木提取物随时间对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制率的曲线。
图2为本发明白桂木提取物随时间对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制率的柱状图。
图3为本发明白桂木提取物对B16细胞黑色素生成量的影响的柱状图。
图4为本发明白桂木提取物的浓度对B16细胞活力的影响的曲线图。
图5为本发明白桂木提取物的浓度对自由基清除率的影响的柱状图。
具体实施例方式
下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
制备实施例
实施例1 白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，用95% (v/v)含水乙醇100升浸泡12小时后 渗漉，收集渗漉液400升，浓縮干燥，得到浸膏1. 8公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依 次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓縮至干，即得本发 明白桂木提取物500克。经高效液相色谱测定，色谱条件为色谱柱为HyperClone BDS C18(4. 6mmX250mm，5iim)柱，流动相为70% (v/v)甲醇-0. 2%磷酸水溶液，检测波长为 300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin 和brosimone I含量之和为40重量％ 。
实施例2 白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，用70% (v/v)含水乙醇100升浸泡12小时后 渗漉，收集渗漉液400升，浓縮干燥，得到浸膏1. 5公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依 次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓縮至干，即得本发 明白桂木提取物450克。经高效液相色谱测定，色谱条件为色谱柱为HyperClone BDS C18(4.6mmX250mm，5iim)柱，流动相为70% (v/v)甲醇-0. 2 %磷酸水溶液，检测波长为 300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、 artonin A、 artocarpin
5和brosimone I的含量之和为34重量％。
实施例3 白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，依次用100升、80升、60升的80% (v/v)含水甲 醇室温浸泡三次，第一次24小时，第二次和第三次分别12小时，合并提取液，浓縮干燥，得 到浸膏1. 2公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂 萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓縮至干，即得本发明白桂木提取物420克。经高效液相色谱测 定，色谱条件为色谱柱为HyperClone BDS C18(4. 6mmX250mm， 5 y m)柱，流动相为65% (v/ v)乙腈_0.2%磷酸水溶液，检测波长为300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物 artopetelin B、artonin A、 artocarpin禾口 brosimone I的含量之禾口为28重量% 。
测试实施例(即药理实施例) 为了证实本发明白桂木提取物的用途，对本发明白桂木提取物进行了蘑菇及B16 细胞来源的酪氨酸酶的抑制作用、B16黑色素瘤细胞的测试、抗自由基氧化活性测试。结果 显示，本发明白桂木提取物具有强的抑制黑色素生成及清除自由基能力。
实施例4蘑菇来源的酪氨酸酶活性测试 蘑菇来源的酪氨酸酶购自sigma(T3824)。以曲酸作为对照品，首先将底物多巴溶 解在磷酸盐缓冲液(PBS， pH7. 4)中达到4mM。在96孔板中，加入120 y L的PBS、20 y L的 PBS稀释的不同浓度的样品(上述的制备实施例l中制备的白桂木提取物)以及lOyL的 20 ii g/mL的酪氨酸酶的稀释液，最后加入50 ii L的上述4mM底物溶液开始反应，27。C下反应 20分钟，每隔2分钟在492nm下测定每孔的吸光度。 根据在492nm下的吸光度计算化合物对酪氨酸酶的抑制率(％)，并将酶活性抑制 率(％ )达到50%时抑制剂的浓度测定为ICs。值。抑制率(％ )可以根据下式进行
抑制率(％ ) = [ (A-B) - (C-D) ] / (A-B) X 100 上式中，A表示反应20分钟后空白孔在492nm下的吸光度；B表示反应前空白孔在 492nm下的吸光度；C表示反应20分钟后样品孔在492nm下的吸光度；D表示反应前样品孔 在492nm下的吸光度。
结果见表l。 表1对蘑菇来源酪氨酸酶的抑制活性 _ 样品 IC5。(ng/mL) _ 曲酸3400 ±192
本发明实施例1的白桂木提取物 34. 58 ± 4. 31
_ 结论从表1可以看出，本发明的白桂木提取物具有很强的抑制蘑菇来源的酪氨
酸酶的活性，IC50比曲酸强约100倍。 实施例5B16细胞来源的酪氨酸酶活性测试 B 16黑色素瘤细胞(简称B 16细胞)是来源于C57BL6小鼠皮肤的自发性肿瘤。 B16细胞来源的酪氨酸酶提取方法为将B16细胞培养基吸掉，用冰冷的PBS洗2次，加入 适量含1% Triton X-100的PBS，4。C裂解30分钟。将裂解物4°C 12000转离心，取上清即为B16细胞的酶提取液。在96孔板150 L的反应体系中，使用上述的制备实施例1中制 备的白桂木提取物，底物多巴终浓度lmM，酶提取液3倍稀释，反应温度为37°C 。每隔5分 钟测492nm吸光度，共80分钟，计算反应5分钟、20分钟、40分钟、80分钟时的酶的抑制率。 另外12小时过夜后再检测一次，计算反应30分钟和12小时时酶的抑制率，计算方法同"实 施例4"。 结果见表2、图1和图2。图1和图2分别为样品随时间对B16细胞来源酪氨酸 酶的抑制率的曲线和柱状图。 表2对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制活性 _ 样品 IC5。(iig/mL) _ 曲酸 6. 48±0.389
本发明实施例1的白桂木提取物11. 46 ±1. 127
_ 结论从表2、图1和图2可以看出，本发明白桂木提取物具有抑制B16细胞来源的 酪氨酸酶的活性，且随时间抑制作用逐渐增强，而曲酸随时间抑制作用逐渐减弱(见图1)。 12小时后，本发明白桂木提取物仍具有强的抑制作用，而曲酸的抑制作用消失(见图2)。
实施例6对B16细胞黑色素生成的影响测试 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)可促进B16细胞的黑色素的生成。将B16细胞 接种于48孔板，2X 104个/孑L用含10%胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基培养。24小时 后换上含100 ii M IBMX的培养基，同时加入不同浓度的样品(上述的制备实施例1中制备 的白桂木提取物)。72小时后，吸取150 ii L培养液检测后，弃培养基，PBS洗两次，每孔加 入150 ii L的1. 5M的NaOH溶液，60。C水浴放置30分钟后，于492nm处检测培养液和细胞内 的黑色素总的含量。结果见图3(*表示与对照组(IBMX组)相比，p<0.001)。图3为本 发明白桂木提取物对B16细胞黑色素生成量的影响的柱状图。 B16细胞接种于96孔板，2Xl(f个/孔，用DMEM培养基(10XFBS，高糖)培养。 24小时后换上含或不含100 ii M的IBMX的培养基，并加入不同浓度的样品(上述的制备实 施例1中制备的白桂木提取物)。48小时后弃培养基，加入100 ii L的5g/L的3-(4， 5- 二 甲基噻唑-2) -2， 5- 二苯基四氮唑溴盐(MTT) ， 4小时后弃去上清液，加入150 y L的DMSO，酶 标仪上检测吸光度值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。结果见图4。图4为本发明白 桂木提取物的浓度对B16细胞活力的影响的曲线。 结论从图3中可以看出，与对照组相比，本发明白桂木提取物可有效地减少B16 黑色素瘤细胞产生黑色素的量，且从图4可以看出，在小于10iig/mL的浓度范围内对细胞 活力没有明显损伤。 实施例7DPPH法抗氧化能力测试 1， 1- 二苯基苦基苯肼(DPPH)用无水乙醇配成300 y M，将上述的制备实施例1中 制备的白桂木提取物用匿SO配成不同浓度溶液，在96孔板中分别加入95 ii L的DPra溶液 禾口 5 ii L的匿SO (空白孔)、95 ii L的无水乙醇和5 ii L的匿SO (空白对照孔)、95 y L的DPK1 溶液和5 ii L的不同浓度样品溶液(样品孔)、95 ii L的无水乙醇和5 ii L不同浓度样品溶液
7(样品对照孔)，避光25。C室温反应20min， 517nm检测吸收。 测定DPra自由基清除率达到50%时的样品浓度，其为IC5。值。抑制率(％ )可以 根据下式进行 抑制率(％ ) = [ (A-B) - (C-D) ] / (A-B) X 100 上式中，A表示空白孔反应20分钟时在517nm下的吸光度；B表示空白对照孔反应 20分钟时在517nm下的吸光度；C表示样品孔反应20分钟时在517nm下的吸光度；D表示 样品对照孔反应20分钟时在517nm下的吸光度。 结果见图5。图5为本发明白桂木提取物的浓度对自由基清除率的影响的柱状图。
结论从图5可以看出，本发明白桂木提取物可长时间且有效地清除DPra自由基。
正如本文前面所述，本发明的白桂木提取物对蘑菇和小鼠B16细胞来源的酪氨酸 酶有非常强的抑制作用，在对B16细胞基本没有明显毒性的前提下，可以显著的抑制黑色
素的含量。而且，本发明的白桂木提取物可长时间且有效地清除DPra自由基。因此，本发明
的白桂木提取物可用于制备化妆品，具有预防皮肤衰老、保护皮肤或美白皮肤的功能；可用 于制备药物，用于治疗包括变色、雀斑、斑点等的皮肤色素沉着；可用于制备天然抗氧化剂， 用于食品和保健品的保鲜。
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权利要求
一种白桂木提取物，其特征在于，该提取物中，异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量为20～40重量％；其中，所述异戊烯基取代的黄酮类化合物为artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I。
2. 根据权利要求1所述的白桂木提取物，其特征在于，该提取物中，异戊烯基取代的黄 酮类化合物的含量为28 40重量％ 。
3. —种权利要求1或2所述的白桂木提取物的制备方法，其特征在于，将白桂木的茎枝 粉碎后，用溶剂提取制备得到总提取物；将总提取物溶于水后，依次以卤代烃类溶剂和酯类 溶剂萃取；取酯类溶剂萃取相，回收溶剂后干燥，即得到白桂木提取物。
4. 根据权利要求3所述的白桂木提取物的制备方法，其特征在于，所述溶剂为醇、水或 其混合物；所述卤代烃类溶剂为氯仿或二氯甲烷；所述酯类溶剂为乙酸乙酯；所述提取使 用的提取方法为浸泡或渗漉。
5. 根据权利要求4所述的白桂木提取物的制备方法，其特征在于，所述醇为乙醇或甲 醇；所述卤代烃类溶剂为氯仿。
6. 权利要求1或2所述的白桂木提取物的在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途。
7. 权利要求1或2所述的白桂木提取物的在制备自由基清除剂中的用途。
8. 权利要求1或2所述的白桂木提取物的在制备黑色素生成抑制剂中的用途。
9. 权利要求1或2所述的白桂木提取物的在制备抗氧化剂中的用途。
10. —种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1或2所述的白桂木提取物。
全文摘要
本发明属于医药和食品技术领域，涉及一种白桂木提取物及其制备方法和用途。本发明的白桂木提取物中，异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量为20～40重量％。以白桂木的茎枝为原料，用溶剂提取制备得到总提取物；将总提取物溶于水后，依次以卤代烃类溶剂和酯类溶剂萃取；取酯类溶剂萃取相，回收溶剂后干燥，即得到本发明的白桂木提取物。经体外酪氨酸酶、B16黑色素瘤细胞、清除DPPH等活性测试，结果显示，本发明白桂木提取物具有强的抑制酪氨酸酶、黑色素生成和清除自由基作用，可作为黑色素生成抑制剂或美白剂或天然抗氧化剂应用于医药、日用化工和食品领域。
文档编号A61K8/97GK101766691SQ20101002263
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月11日 优先权日2010年1月11日
发明者乔欣, 侯爱君, 王贺瑶, 赵婷, 闫桂蕊 申请人:中国科学院上海药物研究所;复旦大学