专利名称：一种水菖蒲有效部位提取物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于中药的药物用途领域，涉及一种天南星科植物水菖蒲(AcorusCalamus L.)根提取物的有效部位和其在制备防治糖尿病药物中的应用。
背景技术：
糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌绝对或相对不足而引起高血糖的代谢性疾病。长期高血糖可引发一系列以血管病变和神经病变为基础的多个系统慢性并发症，严重危害人类健康。糖尿病在西方发达国家具有很高的发病率；流行病学研究表明，在经济发展迅速、人民生活水平大幅度提高的发展中国家，糖尿病发病率也呈快速上升趋势。抗糖尿病药物的研发已为世界所瞩目，在经济快速发展且人口众多的我国更是攸关民生经济的一项大课题。
糖尿病在临床上主要分为I型(胰岛素依赖型)和II型(非胰岛素依赖型)，其中II型糖尿病占了90％以上。II型糖尿病可通过口服降糖药物来降低血糖，通过有效控制血糖可延缓糖尿病并发症的发生和进展。目前市场上常用的口服抗糖尿病药物从作用机制上主要可分为以罗格列酮为代表的胰岛素增敏药，以二甲双胍为代表的糖代谢改善药，以阿卡波糖为代表的α-葡萄糖苷酶抑制药，以格列本脲为代表的胰岛素促分泌药等多种类型，这些药物虽然能控制血糖，但仍存在长期疗效不佳和不良反应等方面的缺点。因此，世界各国都从植物里面寻找强效、无毒的活性成分来开发新的降糖药。传统中药有效成分的提取分离工作正受到世界各国的广泛关注，从中药中提取有效抗糖尿病部位或单体，为新药的发现提供了有效手段。
在传统中医学中，天南星科植物水菖蒲(Acorus Calamus L.)主要应用于中枢抑制，解痉等。又据文献报道，水菖蒲的乙醇提物具有降血脂的活性。而在美洲和印度尼西亚民间，水菖蒲根被应用于治疗糖尿病，并具有一定的疗效。但至今未见对水菖蒲根抗糖尿病作用的实验研究。
发明内容
本发明所述的水菖蒲有效部位提取物是以异菖蒲二醇(isocalamendiol)、WLJ-9(22-[(6-deoxy-α-L-rhamnopyranosyl)oxy]-3，23-dihydroxy-，methylester，(3β，4β，20α，22β))(22-[(6-脱氧-α-L-鼠李吡喃糖)氧]-3，23-二羟基甲酯(3β，4β，20α，22β))、β-胡萝卜苷(β-daucosterol)、β-细辛醚(β-asarone)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、鲸蜡酸(正十六烷酸，n-hexadecanoic)为主要活性成分的提取物。
组分中主要活性成分的结构式 异菖蒲二醇(isocalamendiol) WLJ-9 β-胡萝卜苷(β-daucosterol) CH3(CH2)14COOH鲸蜡酸(正十六烷酸，β-细辛醚(β-asarone) n-hexadecanoic)
β-谷甾醇(β-sitosterol)发明所述的水菖蒲有效部位提取物是通过下述方法制备水菖蒲根以低于70V/V％的醇溶剂提取，过滤合并滤液，回收溶剂得干膏；将干膏混悬于蒸馏水中，依次以水、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，分别回收萃取液中的溶剂，得到其水萃取部位(Water，简称ACW)、正丁醇提取物(n-Butanol，简称ACB)、乙酸乙酯萃取部位(Ethyl Acetate，简称ACE)和石油醚部位(Petroleum，简称ACP)。本发明所述的优选有效部位为乙酸乙酯萃取部位。
本发明所述的水菖蒲(Acorus calamus L.)为天南星科(Araceae)菖蒲属(Acorus Linn.)植物。
本发明所述的提取物有效部位及其含有该提取物有效部位的药物组合物制备的制剂形式主要包括固体制剂和液体制剂。固体制剂主要包括颗粒剂、片剂、胶囊剂(含软胶囊)、滴丸剂。液体制剂主要包括口服液体制剂和注射液体制剂。
所述制剂的给药形式主要包括口服给药或非肠道给药，优选口服给药。
本发明的另一个目的是提供上述提取物有效部位在制备防治糖尿病药物中的应用，包括含有该提取物的药物组合物。优选用于制备防治II型糖尿病的药物中的应用。
本发明的有益效果如下1.本发明的提取方法简便合理，可以从水菖蒲植物提取物中筛选出高效低毒价廉的具有降血糖作用的有效部位，并应用于治疗糖尿病及其改善症状药物中。
2.对水菖蒲根有效部位体外筛选和研究证明，本发明水菖蒲根有效部位提取物具有明显的体外抗糖尿病活性。该有效部位提取物具有体外胰岛素增敏作用，首先表现为促3T3-L1脂肪细胞分化作用，对HepG2细胞有显著的降糖作用。还表现为可刺激HIT-T15细胞分泌胰岛素，可抑制α-葡萄糖苷酶活性，其IC50为0.40mg/ml，酶抑制类型为混合型。
3.对水菖蒲根抗糖尿病活性部位体内药效学实验证明，本发明水菖蒲根有效部位提取物灌胃给药有明显的体内抗糖尿病活性。对正常小鼠具有短暂降血糖作用，并改善葡萄糖耐量。可改善正常小鼠的淀粉耐量。若连续给药可降低肥胖2型糖尿病db/db小鼠的血糖、血清甘油三酯水平，与罗格列酮合用还可增强罗格列酮的降低胆固醇作用；该有效部位提取物对db/db小鼠的抗糖尿病作用与其降低血清游离脂肪酸水平、升高血清脂联素水平，改善机体胰岛素敏感性有关；它还可改善db/db小鼠多饮多食的症状，同时不出现噻唑烷二酮类胰岛素增敏药所常见的体重增加的副作用。
4.水菖蒲根有效部位提取物中兼具胰岛素增敏、α-葡萄糖苷酶抑制作用以及促进胰岛素分泌作用的成分可能是WLJ-9或其它待鉴定成分。兼有胰岛素增敏和α-葡萄糖苷酶抑制作用的成分可能是异菖蒲二醇或其它待鉴定成分。
图1为3T3-L1细胞不同分化阶段细胞典型形态。
图2为ACE抑制α-葡萄糖苷酶的动力学双倒数图。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步说明。
实施例1 本发明水菖蒲根提取物的制备方法水菖蒲根(简称AC)粉碎后，用低于70V/V％的醇溶剂提取，过滤并合并滤液，回收溶剂得干膏；将干膏混悬于蒸馏水中，依次用4种不同极性溶剂，以水、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，分别回收萃取液中的溶剂，得到其水萃取部位(Water，简称ACW)、正丁醇提物(n-Butanol，简称ACB)、乙酸乙酯萃取部位(Ethyl Acetate，简称ACE)和石油醚萃取部位(Petroleum，简称ACP)。各部位真空干燥后所得重量相当于原生药重量的百分率分别为ACW8.4％，ACB 1.6％，ACE 1.0％，ACP 5.4％。
实施例2 水菖蒲根ACE及其分离组分的纯化和结构鉴定对乙酸乙酯萃取部位(ACE)的进一步分离组分，ACE1为ACE的石油醚/乙酸乙酯(15∶1)洗脱部分；ACE2为石油醚/乙酸乙酯(9∶1)洗脱部分；ACE3为石油醚/乙酸乙酯(4∶1)洗脱部分；ACE4为石油醚/乙酸乙酯(3∶2)洗脱部分；ACE5为乙酸乙酯洗脱部分。
ACE各个分离组分用甲醇转溶得到白色不溶物，滤出后，加氯仿、甲醇加热溶解，上sephadex LH-20，用氯仿/甲醇(1∶1)反复洗脱，得到白色单体，与标准品对照后确定结构。
经分离纯化和鉴定，ACE中的主要成分包括异菖蒲二醇(isocalamendiol)、WLJ-9、β-胡萝卜苷(β-daucosterol)、β-细辛醚(β-asarone)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、鲸蜡酸(正十六烷酸，n-hexadecanoic)。其中，WLJ-9，经鉴定为22-[(6-deoxy-α-L-rhamnopyranosyl)oxy]-3，23-dihydroxy-，methylester，(3β，4β，20α，22β)(22-[(6-脱氧-α-L-鼠李吡喃糖)氧]-3，23-二羟基甲酯(3β，4β，20α，22β))。
从ACE分离组分的高效液相图谱中可见，ACE1中的主要成分是β-细辛醚，ACE4和ACE5中的主要成分为WLJ-9和β-胡萝卜苷。
为了验证本发明有效部位的降血糖活性及其对糖尿病的防治效果，将本发明所得的水萃取部位(Water，简称ACW)、正丁醇提取物(n-Butanol，简称ACB)、乙酸乙酯萃取部位(Ethyl Acetate，简称ACE)和石油醚萃取部位(Petroleum，简称ACP)，首先利用体外抗糖尿病筛选模型进行筛选和研究。
实施例3 水菖蒲根提取部位基于胰岛素增敏作用的体外筛选和研究1、水菖蒲根提取部位对3T3-L1细胞的促分化活性研究(1)材料与方法A.3T3-L1前脂肪细胞分化将3T3-L1细胞接种于24孔板，待细胞融合2天后更换含10％FBS、5μg/ml INS、1μmol/L DEX和0.5mmol/L IBMX的高糖DMEM培养液，并同时分组加药，AC及其4种萃取部位ACW、ACB、ACP、ACB均设2、10、50μg/ml三个浓度组。同时设罗格列酮1μmol/L阳性对照组和溶剂DMSO对照组。2天后换含10％FBS、5μg/ml INS的DMEM培养液并同法加药，以后隔天换仅含10％FBS的DMEM培养液并加药。
B.脂肪细胞内脂滴含量的测定分化第8天收集细胞测定细胞内甘油三酯含量(GPO-PAP法)和细胞总蛋白含量(Bradford法)，以两者的比值作为评价前脂肪细胞分化程度的指标。
C.葡萄糖消耗试验将HepG2细胞接种于96孔板，待细胞长至60％融合，换上含0.2％BSA的含提取物的1640培养液，AC的4种不同溶剂提取物均设2、10、50μg/ml三个浓度组。同时设2×10-5mol/L小檗碱阳性对照组、DMSO对照组和不铺细胞空白组。温育24h后再将培养液移出并用氧化酶法测培养液中的含糖量。用空白孔含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是24h各孔细胞的葡萄糖消耗量。在葡萄糖消耗实验24h孵育结束时，用MTT法测定细胞增殖状况。结果采用x±s表示，显著性检验采用组间t检验。
(2)结果A.3T3-L1前脂肪细胞及不同分化阶段的细胞形态观察及水菖蒲根萃取部位的影响参见图1，显微镜下可见，3T3-L1前脂肪细胞呈梭形贴壁生长(图1A，3T3-L1细胞融合前)，细胞融合后胞体变圆，界限不清(图1B，3T3-L1细胞融合后)，加入促分化剂后，随着分化时间的推移，胞体逐渐变大，胞浆内出现大小不等的脂滴(图1C，DMSO组3T3-L1分化第8天)。加入不同浓度的水菖蒲根提取部位后，ACE组10μg/ml和50μg/ml组细胞内脂滴比溶剂对照组明显增加，与罗格列酮对照组相似，典型形态学见图1D(ACE 50μg/ml组)。
B.水菖蒲根提取部位对3T3-L1细胞内脂肪含量的影响细胞内甘油三酯含量测定结果显示，与DMSO溶剂对照组比较，ACE 10和50μg/ml可明显增加3T3-L1脂肪细胞内甘油三酯的生成量(P＜0.01)，阳性对照药罗格列酮(ROS)1μmol/L也同样具有明显的增加甘油三酯生成作用(P＜0.01)，其它提取部位与溶剂对照组比较无统计学差异(P＞0.05)，参见表1。
表1.水菖蒲根提取部位对3T3-L1细胞内脂肪含量的影响.( x±s，n＝3)
注t检验，**P＜0.01vs DMSO对照组.
C.葡萄糖消耗试验ACE 10、50μg/ml剂量组和阳性对照小檗碱组给药24h时，与DMSO对照组比较，对HepG2细胞葡萄糖消耗量有显著影响，呈现显著降糖作用(P＜0.05)。MTT结果显示，在试验浓度范围内ACE对HepG2细胞数无明显影响，而小檗碱对HepG2细胞有显著的抑制增殖作用(P＜0.001)。ACE10、50μg/ml剂量组和阳性组GC/MTT比值显著升高(P＜0.001)，参见表2。
表2.水菖蒲根提取部位对HepG2细胞葡萄糖消耗量及增殖的影响( x±s，n＝5)
注t检验，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs DMSO对照组(3)结论水菖蒲根乙醇提物的乙酸乙酯部位(ACE)具有明显的体外抗糖尿病活性。ACE具有体外胰岛素增敏作用，首先表现为促3T3-L1脂肪细胞分化作用，对HepG2细胞有显著的降糖作用。
实施例4 水菖蒲根提取部位基于胰岛素促分泌作用的体外筛选和研究(1)材料与方法HIT-T15细胞用含10％小牛血清的高糖型DMEM培养基于细胞培养箱中孵育。将HIT-T15细胞接种于96孔板，待细胞生长融合约50％，更换新鲜培养液，分组加药，AC及其4种萃取部位均设6.25、12.5、25μg/ml三个浓度组。同时设格列齐特10μmol/L阳性对照组和DMSO对照组。24h后收集培养液进行胰岛素含量测定。同时采用MTT法测定细胞增殖情况。同样实验重复3次。
(2)结果HIT-T15细胞给药24h后，与DMSO溶剂对照组比较，ACE 6.25、12.5、25μg/ml可明显增加24h累积胰岛素分泌量(P＜0.05)；AC 6.25、12.5μg/ml也可明显增加胰岛素分泌量(P＜0.05)。MTT结果显示，在实验浓度范围内AC对HIT-T15细胞数无明显影响，ACE可减少细胞数但无统计学意义(P＞0.05)。ACW和ACB可增加HIT-T15细胞的24h胰岛素分泌量MTT结果显示细胞数也同时有所增加，但均无统计学意义(P＞0.05)；ACP萃取部位12.5、25μg/ml可减少胰岛素分泌量，MTT结果显示细胞数也同时减少，但均未见统计学意义(P＞0.05)。阳性对照药格列齐特10μmol/L可明显增加24h胰岛素分泌量(P＜0.05)，参见表3。
表3.水菖蒲根提取部位对HIT-T15细胞内胰岛素分泌及增殖的影响.( x±s，n＝3)
注t检验，*P＜0.05，**P＜0.01vs DMSO对照组(3)结论ACE 6.25、12.5、25μg/ml可明显增加HIT-T15细胞24h累积胰岛素分泌量，提示ACE可能通过促进胰岛素分泌而降低血糖。
实施例5 基于α-葡萄糖苷酶抑制作用的体外筛选和研究1.材料与方法(1)水菖蒲根提取部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性筛选及ACE的IC50计算将0.067mol/L磷酸钾缓冲液2.0ml(含受试药物或DMSO)，1mg/ml还原型GSH 50μl和114U/ml α-D-葡萄糖苷酶3.5μl于37℃保温10min后，加入0.116mol/L PNPG 50μl混匀，于37℃保温10min，然后加入0.1mol/L Na2CO310ml终止反应。用紫外分光光度计在400nm处测定反应产物对硝基酚(PNP)的吸光度。酶活力单位定义为在37℃，pH 6.8条件下，1min内水解PNPG释放1μmol PNP所需的酶量。在相同反应条件下，药物对葡萄糖苷酶的抑制活性按照下式计算酶抑制率＝(1-Ax/A0)×100％，式中A0为加DMSO后酶反应的吸光度值，Ax为加药物后酶反应的吸光度值。相同实验重复3次。
水菖蒲根醇提物及其不同溶剂提取分离产物100mg/ml，阿卡波糖400mg/ml以1％体积比加入反应体系中，筛选出具有较强抑制活性的部位，进而对活性较强的部位进行系列梯度浓度的酶抑制实验，计算IC50值。
(2)ACE抑制α-葡萄糖苷酶的动力学特征在抑制剂ACE的不同浓度(0，0.5，1mg/ml)下，分别加入不同浓度(2.275，2.829，3.379，3.923，5.000mmol/L)的底物溶液，测定酶活力。根据不同抑制剂浓度下系列底物条件下的酶活力，确定酶抑制作用类型。
2.结果(1)水菖蒲根提取部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性筛选及ACE的IC50计算水菖蒲根醇提物(AC)及其不同溶剂萃取部分(ACP、ACB、ACE、ACW)1mg/ml对α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制作用，其中水菖蒲ACE 1mg/ml与400mg/ml的阿卡波糖在体外酶反应体系中对α-葡萄糖苷酶的抑制作用相当，抑制率达65％左右，表明ACE对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制作用；其余部分抑制率约在20％左右。ACE对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着抑制浓度的增加(0.13，0.25，0.5，1，2mg/ml)而增加，表明ACE对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有浓度依赖关系，求得ACE抑制α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度IC50是0.40mg/ml。
(2)ACE抑制α-葡萄糖苷酶的动力学特征以1/[s]为横坐标，1/V 为纵坐标作双倒数曲，得到双倒数曲线，酶反应速度随抑制剂ACE浓度的增大而变小。由不同浓度ACE的双倒数曲线交于坐标轴第一象限可推测，ACE抑制α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合型。见图2。
3.结论ACE抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50为0.41mg/ml，酶抑制类型为混合型。
为进一步验证本发明有效部位的降血糖活性及其对糖尿病的防治效果，将本发明所得的乙酸乙酯部位抗糖尿病活性部位进行体内药效学验证。
实施例6 ACE对正常小鼠血糖水平的影响(1)材料与方法正常小鼠随机分为5组，每组10只，ACE低、中、高剂量组分别给予ACE 200、400、800mg/kg，阴性对照组给予0.5％CMC-Na 20ml/kg，阳性对照组给予格列齐特100mg/kg，每天1次灌胃给药，连续3天，于末次给药前禁食12h，于给药前和给药后1h尾静脉取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
(2)结果对正常小鼠给药3天，末次给药1h后，ACE 400、800mg/kg剂量组和阳性对照药格列齐特100mg/kg组血糖值分别为3.55mmol/L、3.12mmol/L和2.58mmol/L，与阴性对照组(5.10mmol/L)比较，有显著降血糖作用(P＜0.05和P＜0.01)。
(3)结论ACE 400、800mg/kg灌胃对正常小鼠具有短暂的降血糖作用，并可改善葡萄糖耐量。
实施例7 ACE对正常小鼠葡萄糖引起的高血糖的影响(1)材料与方法正常小鼠随机分为5组，每组10只，禁食12小时后灌胃给药，分别给予ACE 200、400、800mg/kg，阴性对照组给予0.5％CMC-Na 20ml/kg，阳性对照组给予格列齐特100mg/kg，给药1h后，每只小鼠腹腔注射葡萄糖2g/kg，注射葡萄糖1h后，小鼠摘眼球取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
(3)结果正常小鼠灌胃给药1h后再腹腔注射葡萄糖2g/kg，1h后测定血糖值。ACE400、800mg/kg剂量组及阳性对照药格列齐特100mg/kg组血糖值分别为3.23mmol/L，5.89mmol/L和4.02mmol/L，与阴性对照组(7.23mmol/L)比较，有明显的降血糖作用(P＜0.001和P＜0.01)。
(4)结论ACE 400、800mg/kg灌胃对正常小鼠具有短暂的降血糖作用，并可改善葡萄糖耐量。
实施例8 ACE对正常小鼠淀粉耐量的影响(1)材料与方法正常小鼠随机分为5组，每组10只，禁食12小时后灌胃给药，ACE低、中、高剂量组分别给予ACE 50、100、200mg/kg，阴性对照组给予0.5％CMC-Na20ml/kg，阳性对照组给予阿卡波糖20mg/kg，给药0.5h后，每只小鼠以可溶性淀粉5g/kg灌胃，分别于给药前，给淀粉后0.5、1、2h尾静脉取血，分离血清，用葡萄糖氧化酶法测定血糖值。
(2)结果正常小鼠灌胃给药0.5h后可溶性淀粉5g/kg灌胃，与阴性对照组(血糖值为8.89mmol/L)比较，ACE 100mg/kg剂量组于给淀粉后1h有明显的降血糖作用，血糖值为5.45mmol/L(P＜0.05)，阳性对照药阿卡波糖20mg/kg组在给淀粉后0.5h和1h均有明显的降血糖作用(P＜0.05和P＜0.01)。
(3)结论ACE 100mg/kg灌胃可改善正常小鼠的淀粉耐量，降低餐后血糖。
实施例9 ACE对遗传性糖尿病db/db小鼠的影响(1)材料与方法选取空腹血糖值接近的9-11周龄db/db小鼠，根据空腹血糖值和体重分为4组，每组5只，组间血糖值和体重无显著性差异。阴性对照组给予0.5％CMC-Na，阳性对照组给予罗格列酮10mg/kg，ACE组给予ACE 100mg/kg，合用组给予ACE 100mg/kg和罗格列酮5mg/kg。各组均以20ml/kg灌胃给药，每天1次。每天记录进食量和进水量。给药后每周于末次给药后禁食5～6小时，尾静脉取血，分离血清，测定血糖、甘油三酯和总胆固醇值；给药3周后眼眶取血，分离血清，分别测定血糖值，甘油三酯，总胆固醇，游离脂肪酸，胰岛素和脂联素。
(2)结果A.ACE对db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平的影响灌胃给药1周时，与阴性对照组比较，各给药组血糖值均有所降低，罗格列酮10mg/kg组、ACE 100mg/kg以及罗格列酮5mg/kg与ACE 100mg/kg合用组血糖值与阴性对照组比较分别下降了23.6％、20.5％和22.3％，但ACE以及ACE与罗格列酮5mg/kg合用组的作用无统计学意义(P＞0.05)，罗格列酮10mg/kg组血糖值明显降低(P＜0.05)。给药2周时罗格列酮、ACE以及合用组血糖值与阴性对照组比较分别下降了40.1％、34.1％和49.0％；3周时，罗格列酮、ACE以及合用组血糖值与阴性对照组比较分别下降了70.1％、54.5％和76.1％；各给药组血糖值均比阴性对照组显著降低(P＜0.001)。
B.ACE对db/db糖尿病小鼠空腹血脂水平的影响灌胃给药1周后，与阴性对照组比较，各给药组血清甘油三酯水平均有明显下降(P＜0.05)，与阴性对照组比较，罗格列酮10mg/kg组、ACE 100mg/kg以及罗格列酮5mg/kg与ACE 100mg/kg合用组甘油三酯水平分别下降了38.1％、23.1％和26.5％；给药2周时罗格列酮、ACE以及合用组甘油三酯水平分别下降了47.0％(P＜0.001)、25.4％(P＜0.05)和41.0％(P＜0.01)；3周时，罗格列酮、ACE以及合用组甘油三酯水平分别下降了46.7％、55.7％和67.1％(P＜0.001)。
3周后ACE 100mg/kg对血清总胆固醇含量均无明显影响，罗格列酮10mg/kg组2周及3周后可降低血清总胆固醇含量(P＜0.05)，罗格列酮5mg/kg与ACE 100mg/kg合用组在给药3周后明显降低血清总胆固醇含量(P＜0.01)，其作用略优于罗格列酮10mg/kg组。
C.ACE对db/db糖尿病小鼠空腹血清胰岛素水平的影响灌胃给药3周后，与阴性对照组比较，各给药组空腹血清胰岛素值均有所降低，但均未见统计学意义，罗格列酮10mg/kg组胰岛素降低百分率为16.5％，ACE 100mg/kg组为5.6％，罗格列酮5mg/kg与ACE 100mg/kg合用组为20.4％。
D.ACE对db/db糖尿病小鼠空腹血清游离脂肪酸水平的影响灌胃给药3周后，与阴性对照组比较，各给药组游离脂肪酸水平均显著下降，罗格列酮10mg/kg组降低了40.5％(P＜0.05)，ACE 100mg/kg组降低了65.1％(P＜0.01)，罗格列酮5mg/kg和ACE 100mg/kg合用组降低了69.6％(P＜0.01)。
E.ACE对db/db糖尿病小鼠空腹血清脂联素水平的影响灌胃给药3周后，与阴性对照组比较，各给药组脂联素水平均显著下降，罗格列酮10mg/kg组降低了83.1％(P＜0.001)，ACE 100mg/kg组降低了35.3％(P＜0.05)，罗格列酮5mg/kg和ACE 100mg/kg合用组降低了51.0％(P＜0.01)。
F. ACE对db/db糖尿病小鼠体重的影响灌胃给药1周后，与阴性对照组比较，罗格列酮10mg/kg组体重增高，ACE 100mg/kg组降低，罗格列酮5mg/kg与ACE 100mg/kg合用组不变。给药结束后，罗格列酮10mg/kg组体重比对照组增加了21％(P＜0.05)，ACE 100mg/kg组降低了5％(P＞0.05)，罗格列酮5mg/kg和ACE 100mg/kg合用组增加了11％(P＞0.05)。
(3)结论ACE 100mg/kg连续灌胃可降低肥胖2型糖尿病db/db小鼠的血糖、血清甘油三酯水平，与罗格列酮合用还可增强罗格列酮的降低胆固醇作用；ACE对db/db小鼠的抗糖尿病作用与其降低血清游离脂肪酸水平、升高血清脂联素水平，改善机体胰岛素敏感性有关；ACE可改善db/db小鼠多饮多食的症状，同时不出现噻唑烷二酮类胰岛素增敏药所常见的体重增加的副作用。
实施例10 体外抗糖尿病筛选模型对ACE分离组分进行筛选和研究(1)具体方法按照是实施例3、4、5(2)结果显示，经3T3-L1脂肪细胞促分化实验，油红O染色法结果显示ACE分离成分WLJ-9可明显增加3T3-L1细胞内脂肪含量(P＜0.05)，提示WLJ-9是ACE的胰岛素增敏作用的活性成分之一。HIT-T15细胞胰岛素分泌实验表明，ACE分离组分中β-细辛醚和WLJ-9可明显增加24h累积胰岛素分泌量(P＜0.05)，提示ACE中具有促进胰岛素分泌作用的成分主要是β-细辛醚和WLJ-9。ACE分离组分对α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制作用，其中β-胡萝卜苷对α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强，异菖蒲二醇、WLJ-9、β-谷甾醇、鲸蜡酸具有中等强度的抑制作用，β-细辛醚的酶抑制作用最弱。
实施例11 含乙酸乙酯(ACE)部位的包衣片制备片剂的组成(1)按实施例1方法制得ACE部位；(2)取30gACE，将其粉碎成细粉，加入糊精5g，混合均匀后过100目筛；(3)在第(2)步的混合物中加入10ml 95v/v％乙醇，过40目筛制成湿颗粒，烘干至其水分含量为5w/w％，依次过40目筛和80目筛，得到粒度为40-80目的干燥颗粒。
(4)以2g滑石粉和1g硬脂酸镁作为润滑剂，用单冲压片剂将干燥颗粒压成片重约0.2g的素片；(5)取丙烯酸树脂IV号10g和羟丙基甲基纤维素2.5g，将其溶于20ml95v/v％乙醇，制成溶液1。
(6)取丙烯酸树脂IV号10g和羟丙基甲基纤维素2.5g，将其溶于20ml70v/v％乙醇，制成溶液2。混合溶液1和2，制得溶液3。
(7)取30ml混合溶液3，依次加入蓖麻油5ml，吐温-805ml，滑石粉20g，钛白粉10g，并依次过胶体磨，反复研磨混匀，制得包衣混悬液。
(8)取(4)步所得的素片100片加入包衣锅内，喷入包衣混悬液进行包衣；(9)最后喷8ml溶液3，抛光，低温干燥，得到薄膜包衣片。
实施例12 药物组合物包衣片制备片剂的组成(1)按实施例1方法制得ACE部位；(2)将1～99w/w％的ACE部位和1～99w/w％的人参的提取物混合。
(3)参照实施例10中(3)-(9)的方法，制备组合物片剂。
本领域技术人员可参照实施例11的方法，制得其颗粒剂；或将所得的干燥颗粒填充入胶囊，即得其胶囊剂。
以上仅为其中一种固体制剂的一种配方形式。作为含该有效部位的各种固体制剂剂型，可以适当使用适合于各种剂型的添加剂或基质，根据中国药典的记载的常规方法进行制备。
可以根据药剂学允许的制剂方法，制备液体制剂和固体制剂。固体制剂主要包括颗粒剂、片剂、胶囊、软胶丸、软胶囊、滴丸剂、栓剂。液体制剂主要包括口服液体制剂和注射液体制剂。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献1.卫玉玲、丁永辉、瞿颂义、张英福、郑天珍、李伟，水菖蒲和石菖蒲对大鼠离体胃平滑肌条作用的比较.甘肃中医学院学报，2000，17(04)，7-9。
2.冯仁清.菖蒲的品种鉴别和应用.山西中医-2005年5期，21。
3.刘邦强高音.三种菖蒲的鉴别和应用.时珍国医国药-2004年8期。
4.Reshma S.Parab and Sushma A.Mengi.Hypolipidemic activity of Acoruscalamus L.in rats.Fitoterapia，Volume 73，Issue 6，October 2002，Pages 451-455。
权利要求
1.一种水菖蒲根有效部位提取物，所述水菖蒲为天南星科菖蒲属植物，其特征是通过下述方法获得水菖蒲根以低于体积比为70％的醇溶剂提取，过滤合并滤液，回收溶剂得干膏；将干膏混悬于蒸馏水中，依次以水、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，分别回收萃取液中的溶剂，得到其水萃取部位、正丁醇提取物、乙酸乙酯萃取部位和石油醚部位，选用的有效部位为乙酸乙酯萃取部位。
2.根据权利要求1所述的水菖蒲根有效部位提取物，其特征是该有效部位提取物是以异菖蒲二醇、WLJ-9、β-胡萝卜苷、β-细辛醚、β-谷甾醇、鲸蜡酸为主要活性成分的提取物。
3.根据权利要求1所述的水菖蒲根有效部位提取物，其特征是由该有效部位提取物与制剂允许的辅料组合的药物组合物在制备防治糖尿病药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的水菖蒲根有效部位提取物，其特征是由该有效部位提取物与制剂允许的辅料组合的药物组合物在制备防治II型糖尿病的药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的水菖蒲根有效部位提取物，其特征是其药物组合物制备的制剂形式选用固体制剂和液体制剂。
6.根据权利要求3或4所述的由水菖蒲根有效部位提取物制备的药物，其特征是固体制剂选用颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊、滴丸剂。
7.根据权利要求3或4所述的由水菖蒲根有效部位提取物制备的药物，其特征是液体制剂选用口服液体制剂和注射液体制剂。
全文摘要
本发明提供水菖蒲根有效部位提取物，包括含有该提取物有效部位的药物组合物。本发明所述的水菖蒲(Acorus calamus L.)为天南星科(Araceae)菖蒲属(Acorus Linn.)植物。本发明的提取方法简便合理，可从水菖蒲植物提取物中筛选出高效低毒价廉的具有降血糖作用的有效部位，药效学实验证明有明显的体内抗糖尿病活性，该有效部位提取物对db/db小鼠的抗糖尿病作用与其降低血清游离脂肪酸水平、升高血清脂联素水平，改善机体胰岛素敏感性有关；可改善db/db小鼠多饮多食的症状，同时不出现噻唑烷二酮类胰岛素增敏药所常见的体重增加的副作用，可应用于治疗糖尿病及其改善症状的药物中。
文档编号C07C35/00GK1973877SQ20061015505
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者楼宜嘉, 朱丹雁, 吴昊姝, 郭美媛, 周长新, 王志强, 张翔南, 马葵芬 申请人:浙江大学