专利名称：从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法
技术领域：
本发明涉及到一种从牛胎盘中分离纯化免疫调节活性多肽的方法，属于生物医药提取技术领域。
背景技术：
胎盘免疫调节因子的研究首起我国，是从健康产妇的胎盘中提取的活性成分。1985年，刘月新首先报道了采用“匀浆-透析”法从健康产妇胎盘中提取的一种小分子活性物质，并将这种因子称为胎盘因子；1994年，黄楚华等将新鲜胎盘洗净剪切，加2倍生理盐水组织匀浆，离心沉淀，上清液使用超滤膜超滤，滤过液去菌分装，得胎盘注射液；1996年，张学荣等报道了新鲜胎盘剪去筋膜，用无菌水冲洗干净剪碎称重，按1∶1加入生理盐水用高速组织捣碎机制成胎盘组织匀浆。匀浆于-20℃冰箱冰冻48h以上。在25℃水浴下解冻，超声粉碎15min，经反复冻融低温离心，提取上清液进行透析提取，滤膜过滤得胎盘注射液；2001年，许代娣等基本参照刘月新方法制备胎盘免疫调节因子。
人胎盘免疫调节因子主要是小分子的多肽，大量动物实验和临床应用研究表明，胎盘免疫调节因子安全无毒，无抗原性，长期使用不会因为产生抗体而使活性降低，是一种高效安全的免疫调节剂和增强剂。目前对胎盘免疫调节因子的研究主要集中在功能及应用方面，而对其主要活性成分分离纯化的报道甚少。
发明内容
本发明的目的在于将牛胎盘作为一类新的胎盘资源，提供一种从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法。
本发明从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法的技术方案通过如下步骤实现A、新鲜牛胎盘、清洗切块、加两倍(W/V)的磷酸盐缓冲液、匀浆、离心沉淀分离，上清液经1万分子量截留超滤、纳滤脱盐、冷冻干燥；B、阴离子交换层析取30mg步骤A的冻干粉，溶于5ml pH7.4的20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，上样到2.6×35cm的DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱上，流速为1mL/min，淋洗液A液为20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，B液为A液中加入1.0mol/L氯化钠的溶液，得到含有活性多肽的组分1a；C、凝胶排阻层析将步骤B收集到的组分1a直接上到1.0×75cm的Sephadex G-25柱上，流动相为用2mmol/L，pH7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，流速为10mL/h，等度洗脱，得到含有活性多肽的组分1b；D、反相高效液相层析将步骤C收集到的组分1b直接上到Sephasil C18柱上，流速为1mL/min，流动相为A液选用加入0.05％三氟乙酸的5-10％乙腈，B液选用加入0.05％三氟乙酸的40-60％的乙腈，梯度洗脱，得到含有活性多肽的组分4；
E、对步骤D纯化的组分4检测，脱盐、冻干即可。
所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤A中采用芳香聚酰胺纳滤膜脱盐过滤分离的上清液。
所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤B阴离子交换层析中所述梯度洗脱梯度方式为0-600min A液；600-1000minB液0-100％。
所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤B或C中选用pH6.8的20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤D反相高效液相层析中所述梯度洗脱梯度方式为0-8minA液；8-12min B液0-100％；12-16min B液。
所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤D所述反相高效液相层析中流动相为A液选用加入0.05％三氟乙酸的5％乙腈。
所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤D所述反相高效液相层析中流动相为B液选用加入0.05％三氟乙酸的40％乙腈。
所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤B、C或D得到的组份采用体外培养淋巴细胞增殖实验进行活性检测确认。
所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，步骤D得到的组份采用毛细管电泳进行纯度鉴定。
本发明与传统的免疫调节因子的研究相比，明确了传统的免疫调节因子中起活性功能的成分多肽，纯化程度不同的免疫调节活性多肽能够满足不同行业的需求。离子交换层析和凝胶排阻层析后得到的免疫调节活性多肽为研制具有免疫调节活性的保健食品提供了丰富的原料。
反相高效液相层析后得到的纯度90％以上的免疫调节活性多肽，生物活性可达到药用标准。
从工业生产的角度出发，离子交换层析和凝胶排阻层析后得到的免疫调节活性多肽得率为1％(以干基计1g免疫调节活性多肽/100g牛胎盘)。
图1是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱上的分离图谱；图中峰1a是含有免疫调节活性多肽的组份图2是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱上得到的4个组分体外培养淋巴细胞增殖实验柱形图；图中组份1a是含有免疫调节活性多肽的组份图3是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在凝胶排阻层析SephadexG-25柱上的分离图谱；图中峰1b是含有免疫调节活性多肽的组份图4是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在Sephadex G-25柱上得到的2个组分体外培养淋巴细胞增殖实验；图中组份1b是含有免疫调节活性多肽的组份图5是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在反相高效液相层析Sephsil peptide C18上的分离图谱。
图中峰4是含有免疫调节活性多肽的组份图6是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在Sephsil peptide C18上得到的7个组分体外培养淋巴细胞增殖实验；图中组份4是含有免疫调节活性多肽的组份图7是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在Sephsil peptide C18上的纯度鉴定图谱，免疫调节活性多肽的组份90％以上。
图8是本发明实施例中的免疫调节活性多肽在毛细管电泳上的纯度鉴定图谱。
具体实施例方式
实施例1A、胎盘处理取新鲜牛胎盘、清洗切块、加两倍(W/V)pH 6-8-7.4的磷酸盐缓冲液、匀浆、12000r/m离心、沉淀、取上清液经1万分子量截留超滤、芳香聚酰胺纳滤膜脱盐、冷冻干燥得到含有免疫调节活性多肽的样品冻干粉；B、阴离子交换层析
取30mg冻干粉，溶于5ml pH 7.4的20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，上样到2.6×35cm的DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱上(Pharmacia公司)，流速为1mL/min，梯度洗脱 洗脱液A液为20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，B液为A液中加入1.0mol/L氯化钠的溶液。梯度方式为0-600min A液600-1000min B液0-100％ (0-100％是指从100％A液+0％的B液到100％B液+0％A液的梯度洗脱)洗出层析图见附图1，活性检测采用体外培养淋巴细胞增殖实验，实验结果见附图2，从活性检测实验结果可以看出，离子交换层析所得的组分1a含有免疫调节活性多肽。
C、凝胶排阻层析将收集到的DEAE柱上的组分1a直接上到1.0×75cm的Sephadex G-25柱上(Pharmacia公司)，流动相为用20mmol/L，pH 7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，流速为10mL/h，用等度洗脱。
洗出层析图见附图3，活性检测采用体外培养淋巴细胞增殖实验，实验结果见附图4。从活性检测实验结果可以看出，凝胶排阻层析所得的组分1b含有免疫调节活性多肽。
D、反相高效液相层析将收集到的Sephadex G-25柱上的组分1直接上到Sephasil C18柱上(Pharmacia公司)，流速为1mL/min。流动相为，A液含0.05％三氟乙酸的10％乙腈；B液含0.05％三氟乙酸的60％乙腈。梯度方式为0-8minA液8-12min B液0-100％12-16min B液洗出层析图见附图5，活性检测采用体外培养淋巴细胞增殖实验，实验结果见附图6。经从活性检测实验结果可以看出，反相高效液相层析所得的组分4即为较高纯度的免疫调节活性多肽。
E、将组份4进一步纳滤脱盐，冷冻干燥即得到免疫调节活性多肽成品。将其在Sephsil peptide C18上和毛细管电泳上进行的纯度鉴定，图谱见附图7和附图8。
实施例2离子交换层析和凝胶排阻层析选用pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例3离子交换层析和凝胶排阻层析选用pH7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例4反相高效液相层析所用的A液为含有0.05％三氟乙酸的5％乙腈；其它操作工艺方法同实施例1。
实施例5
反相高效液相层析所用的B液为含有0.05％三氟乙酸的40％乙腈；其它操作工艺方法同实施例1。
本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明这种从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，而不对本发明的范围构成任何限制，用本发明实施例得到的产品和经由本发明权利要求书所述均可得到活性多肽。
权利要求
1.从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于它是经过如下步骤实现的A、新鲜牛胎盘处理清洗切块，加两倍(W/V)的磷酸盐缓冲液匀浆，离心沉淀分离，上清液经1万分子量截留超滤、纳滤脱盐、冷冻干燥；B、阴离子交换层析取30mg步骤A的冻干粉，溶于5ml pH7.4的20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，上样到2.6×35cm的Sepharose CL-6B阴离子交换柱上，流速为1mL/min，淋洗液A液为20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，B液为A液中加入1.0mol/L氯化钠的溶液，梯度洗脱得到含有活性多肽的组分1a；C、凝胶排阻层析将步骤B收集到的组分1a直接上到1.0×75cm的Sephadex G-25柱上，流动相为用20mmol/L，pH7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，流速为10mL/h，等度洗脱，得到含有活性多肽的组分1b；D、反相高效液相层析将步骤C收集到的组分1b直接上到Sephasil C18柱上，流速为1mL/min，流动相为A液选用加入0.05％三氟乙酸的5-10％乙腈，B液选用加入0.05％三氟乙酸的40-60％的乙腈，梯度洗脱，得到含有活性多肽的组分4；E、对步骤D纯化的组分4检测，脱盐、冻干即可。
2.根据权利要求1所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤A中采用芳香聚酰胺纳滤膜脱盐过滤分离的上清液。
3.根据权利要求1所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤B阴离子交换层析中所述梯度洗脱梯度方式为0-600min A液；600-1000minB液0-100％。
4.根据权利要求1所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤B或C中选用pH6.8的20mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
5.根据权利要求1所述从牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤D反相高效液相层析中所述梯度洗脱梯度方式为0-8minA液；8-12min B液0-100％；12-16min B液。
6.根据权利要求1所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤D所述反相高效液相层析中流动相为A液选用加入0.05％三氟乙酸的5％乙腈。
7.根据权利要求1所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤D所述反相高效液相层析中流动相为B液选用加入0.05％三氟乙酸的40％乙腈。
8.根据权利要求1所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤B、C或D得到的组份采用体外培养淋巴细胞增殖实验进行活性检测确认。
9.根据权利要求1所述牛胎盘分离纯化免疫调节活性多肽的方法，其特征在于步骤D得到的组份采用毛细管电泳进行纯度鉴定。
全文摘要
本发明提出将牛胎盘作为一类新的胎盘资源，清洗切块、匀浆抽提、离心沉淀分离、上清液经超滤、纳滤脱盐、冷冻干燥得到含有活性免疫调节活性多肽基础产品；在经过阴离子交换层析、凝胶排阻层析、反相高效液相层析几步分离纯化，透析冻干得到提纯的成品。本发明与传统的免疫调节因子的研究相比，明确了传统的免疫调节因子中起活性功能的成分多肽，纯化程度不同的免疫调节活性多肽能够满足不同行业的需求。离子交换层析和凝胶排阻层析后得到的免疫调节活性多肽为研制具有免疫调节活性的保健食品提供了丰富的原料。反相高效液相层析后得到的纯度90％以上的免疫调节活性多肽，生物活性可达到药用标准。
文档编号C07K14/47GK1687107SQ20051001246
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者王玉良, 生庆海, 夏文水, 房新平, 魏鹏, 翟红梅 申请人:石家庄三鹿集团股份有限公司