专利名称：人重组组织因子的构建表达、纯化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及人重组组织因子，特别是人重组组织因子的构建表达和纯化方法。本发明还涉及该人重组组织因子的应用。
背景技术：
20世纪初期，Schmid与Moranitz首次发现了组织中血液凝固的启动因子，并将其命名为组织因子(Tissue factor，TF)。到20世纪80年代，组织因子被证实是生理性凝血过程中最重要的启动因子。人们借助重组DNA、人工致突变及基因剔除等现代分子生物学技术，进一步在分子水平和基因水平研究TF，发现TF与全身炎症反应综合症及休克、DIC、血栓性疾病、移植排斥反应、恶性肿瘤等的发生、发展有着密切关系，近年来又研究发现TF还具有参与愈伤组织修复、新生血管形成及胚胎发育等多种生理功能。因此，组织因子在生物制药领域有着良好的应用发展前景。
目前，国内外组织因子的研究主要集中在与组织因子有关的生物技术新药的研究开发和凝血酶原时间检测试剂的研制方面。
在生物制药产业上，组织因子的研究主要集中在抗凝药、心血管病方面的药物上，如研究开发的组织因子单克隆抗体、TFPI(TF pathway inhibitor)、失活的因子VIIa、rNAPc2、抗TF或VIIai的小分子化合物、靶向免疫络合物等。
组织因子是凝血酶原时间(Prothrombin time，PT)检测试剂的主要活性成分，是影响凝血酶原时间测定的主要因素，高质量的组织因子能够敏感地反应出凝血因子的异常与否。凝血酶原时间测定是血液临床检验的常规项目，用于检测病人凝血机制是否正常，特别是心胸外科、骨科、妇产科等手术前检查病人的凝血功能，同时也是口服抗凝药物治疗监控的重要实验室指标，凝血酶原时间的延长和缩短与肝病、肿瘤、炎症、糖尿病、心脏病、血液病、高血压、高血脂等多种疾病有密切关系。
长期以来，凝血酶原时间测定试剂的制备都是由从兔脑、牛脑、人脑、胎盘等组织中提取组织因子配制而成，如美国DadeBehring公司生产的胎盘凝血活酶、法国Diagnostia Stago公司生产的兔脑凝血活酶、我国陕西方舟公司生产的兔脑凝血活酶、上海太阳公司用兔脑制备的含钙冻干组织凝血活酶等。由于这些组织提取物所含的组织因子的浓度不同，尤其是不同种属来源组织中的组织因子对凝血的反应敏感度不同，所以用其生产的凝血酶原时间测定试剂普遍存在产品质量不稳定，敏感性差，检测结果不稳定的问题，不同的临床检验实验室之间得到的检测结果难以比较。尽管采用了WHO的标准参照品，但仍然不能把误差降低到可接受的水平。
近年来，随着分子生物学的飞速发展，人们已经克隆出组织因子的基因，清楚了它的结构，并采用基因工程技术合成了重组组织因子。目前，国外有少数几家公司(如DadeBehring公司)已经利用兔重组组织因子或人重组组织因子开发出了新型的凝血酶原时间测定试剂。临床应用结果表明，由于重组组织因子分子结构均一、质量稳定，且对凝血因子具有极高的敏感性，使用重组组织因子制成的凝血酶原时间测定试剂提高了PT测定的敏感性、精密度和准确度，在临床医学检验上被认为是新一代的标准化凝血酶原时间测定试剂。使用重组组织因子生产的凝血酶原时间测定试剂，已成为相关研究人员的共识和各级医院的首选。
人组织因子是分子量为47KD的糖蛋白，含有263个氨基酸残基，为跨膜受体蛋白质。TF是凝血因子Ⅶ的受体和辅助因子，是外源凝血途径的启动蛋白。TF蛋白分子分为3个部分，胞内区21个氨基酸残基，跨膜部分为23个氨基酸残基，具有疏水性，膜外部分含219个氨基酸残基，为氨基端，带有糖链。研究证实，缺失胞内区的截断型人组织因子(TF243，由跨膜部分和膜外部分组成)具有全部的凝血活性。
国外利用人重组组织因子制备凝血酶原时间测定试剂的文献以及专利报道基本上集中在了组织因子制备凝血酶原时间测定试剂的脂化、缓冲液组成、稳定剂的加入等工艺上。复旦大学的发明专利申请“重组可溶性组织因子及其制备方法和应用”提供了一种含有部分天然TF的氨基酸序列(1～218)及具有启动外源性凝血活性的重组可溶性组织因子r-sTF。其r-sTF的一种具体制备方法是从胎盘组织中提取总RNA，运用RT-PCR、质粒重组和大肠杆菌的阳性克隆筛选，获得sTF基因片段，进一步构建表达质粒r-sTF-pLY-4，并导入大肠杆菌JF1125中表达；然后经过离心收集菌体，菌体破碎，包涵体溶解，复性和Q-Sepharose F.F.层析纯化等步骤，最终得到r-sTF。上述得到的r-sTF经磷脂化处理后，可用于制备凝血酶原时间检测试剂。
在复旦大学的发明专利申请中，获得的r-sTF只是TF的胞外部分，与天然全长型TF或TF243截断型(含有跨膜结构)相比，其生物活性较低。此外，r-sTF在大肠杆菌的表达方式是通过提高发酵温度诱导表达形成包涵体沉淀物，而较高的培养温度常常会降低可溶性蛋白的表达水平，同时包涵体沉淀物需要经过蛋白质变性及复性才能得到有活性的TF样品，因此，r-sTF的纯化过程繁琐，TF结构和活性的均一性较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的人重组组织因子以及构建、表达和纯化该重组组织因子的方法。
本发明的目的还在于应用该重组组织因子，制备高稳定性和高敏感性的凝血酶原时间测定试剂盒。
本发明构建的人重组组织因子recombinant human tissue factor简称rhTF243，其核苷酸序列和氨基酸序列见图1，为由膜外区和跨膜区两部分组成，缺失胞内区的截断型人重组组织因子，即TF的1～243氨基酸序列部分，具有和组织因子同样活性的蛋白。
本发明从人胎盘组织中获取总RNA，根据已知的TF核苷酸序列，设计PCR引物，并加入酶切位点；以总RNA为模板，通过RT-PCR方法得到目的基因片段；将收集的TF基因片段与phoA质粒(由美国血液技术公司焦进安博士提供)重组，构建出TF表达质粒载体pTF243。图2所示为TF表达质粒载体pTF243的物理图谱。
进而将TF表达质粒载体pTF243转化到大肠杆菌MM294中，用添加0.01％氨苄青霉素的LB培养基培养，提取质粒，使用内切酶酶切分析基因片段，筛选确认阳性克隆，得到高效表达的基因重组工程菌株。
取筛选得到的基因重组工程菌株接入到发酵培养基中，在30℃～37℃和pH6.0～7.2条件下直接发酵培养表达，得到含有rhTF243的发酵培养菌液。
本发明的发酵培养基是以LB培养基为基础，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％无机盐溶液和0.01％～0.05％氨苄青霉素后组成的。
其中的无机盐溶液由0.1％～0.5％磷酸二氢钠、0.5％～1.0％磷酸氢二钾、0.01％～0.05％氯化铁、0.01％～0.03％硫酸锌、0.01％～0.03％氯化钴、0.01％～0.03％硫酸铜、0.5％～1.0％硫酸铵和0.05％～0.10％硫酸镁组成。
本发明中，rhTF243在大肠杆菌MM294中的表达是由phoA启动子控制的，而phoA启动子的抑制与激活又受到发酵培养液中无机磷浓度的控制，当无机磷浓度低于0.1mmol/L时，rhTF243蛋白被诱导表达。
当大肠杆菌在含无机磷浓度高的培养液里生长时，phoA启动子受到抑制，不能进行rhTF243的表达，在发酵培养过程中，随着大肠杆菌的生长，无机磷逐渐消耗，当无机磷浓度降低到一定水平(低于0.1mmol/L)时，phoA启动子受到激活，从而诱导rhTF243开始表达。表1、表2列出了不同时间和不同无机磷浓度下的rhTF243表达情况(活性以凝血酶原时间表示，凝血酶原时间长，活性较低，凝血酶原时间短，活性较高)。
表1 不同无机磷浓度下rhTF243的表达活性
表2 发酵过程中rhTF243活性的表达
本发明rhTF243的纯化方法是，取发酵培养菌液溶于Tris-EDTA缓冲液中，用高压匀浆机高压破碎，释放出rhTF243蛋白；先使用Q-Sepharose Fast Flow基质对破碎液进行离子交换层析，得到rhTF243蛋白的粗提液；再将粗提液通过TF单抗免疫亲和层析柱进行吸附和洗脱后，收集得到纯度95％以上的rhTF243蛋白。
TF单抗免疫亲和层析柱的具体吸附和洗脱方法为依次用pH8.0的Tris-HCl缓冲液、pH6.0的磷酸盐缓冲液和pH4.0的醋酸钠缓冲液洗涤，然后用pH3.0的醋酸缓冲液洗脱rhTF243蛋白，并收集。
本发明使用的TF单抗免疫亲和层析柱是由TF单克隆抗体与Amersham公司的CNBr-actvated Sepharose Fast Flow偶联后制备得到的，其中的TF单克隆抗体由美国血液技术公司焦进安博士提供。本发明制备得到的TF单克隆抗体具有很强的专一性，可以重复多次使用。
通过使用紫外分光光度计测定在280nm波长下的吸光度值A280和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定洗脱后的rhTF243蛋白纯度。
本发明制备得到的rhTF243蛋白主要应用于制备凝血酶原时间检测试剂。
在钙和磷脂存在条件下，TF具有引起血浆凝固的功能，TF的血浆凝固功能是通过测定凝血时间进行的。
在进行PT测定时，TF、CaCl2和磷脂混合在一起组成PT试剂。本发明制备凝血酶原时间检测试剂的具体方法是在37℃条件下将纯化的rhTF243蛋白加入溶解有磷脂的100mmol/L Tris缓冲液(pH7.5，含有100mmol/L CHAPS)中得到rhTF243磷脂液，再将rhTF243磷脂液与由100mmol/L HEPES、10mmol/LCaCl2、1mg/mL BSA组成的缓冲液(pH7.0)混合后，得到PT检测试剂。
其中的磷脂是由Sigma公司提供的PC(产品号P6354)与PS(产品号P7769)混合组成。
本发明运用现代分子生物学技术，构建了新型的人重组组织因子的表达载体pTF243，改进了TF的表达机理，使其能够在大肠杆菌MM294的发酵中，随着培养基中无机磷的逐渐消耗而直接表达，不再需要增加诱导物和(或)改变发酵条件进行诱导外源蛋白的表达，简化了发酵生产的工艺，有效地提高了rhTF243蛋白的表达率，也不需要对蛋白质进行变性和复性；同时在rhTF243蛋白的纯化工艺中，采用了TF单抗免疫亲和层析技术，依据人重组组织因子与TF单抗免疫亲和层析柱上的抗体特异性结合，经过洗涤、洗脱得到纯化的重组组织因子蛋白，由于人重组组织因子与TF单克隆抗体之间结合的特异性和温和性，人重组组织因子在纯化过程中没有受到不可逆的损伤，因此获得了高纯度和高活性的rhTF243。纯化的rhTF243纯度95％以上，收率大于60％。
使用本发明纯化的rhTF243蛋白制备得到的PT试剂，稳定性和敏感性均得到了提高，PT测定时间10s～14s，ISI值1.0±0.2。
图1为人重组组织因子rhTF243的DNA序列和氨基酸序列；图2为TF表达质粒载体pTF243的物理图谱；图3为纯化rhTF243蛋白的紫外分光光度图；
图4为纯化rhTF243蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施例方式
实施例1rhTF243表达质粒载体的构建从人胎盘组织中获取总RNA，根据已知的TF核苷酸序列，设计PCR上游引物P1和下游引物P2。
上游引物P15’-ACCAGCCATGGCTCAGGCACTACAAATACTGTGGC-3’下游引物P25’-GGATCCTCAGTGTAGAGATATAGCCAGGATG-3’P1引物含有数个TF蛋白N端氨基酸及NcoI酶切位点，P2引物含有数个TF蛋白C端氨基酸、终止码及BamHI酶切位点。
以总RNA为模板，P1、P2为引物，通过常规RT-PCR方法得到TF目的基因片段；将收集的rhTF243基因片段用限制性内切酶NcoI和BamHI处理，与phoA质粒重组，构建TF表达质粒载体pTF243。
将TF表达质粒载体pTF243转化到大肠杆菌MM294中，用添加0.01％氨苄青霉素的LB培养基培养，提取质粒，使用内切酶酶切分析基因片段，并测定TF基因的DNA序列，筛选确认阳性克隆，使用PT测定方法(检测TF凝血活性)筛选得到高效表达的基因重组工程菌株。
实施例2rhTF243的发酵表达1、发酵培养基的制备组成LB培养基1000mL、葡萄糖50g、无机盐溶液10mL、0.01％氨苄青霉素。其中无机盐溶液由0.1％磷酸二氢钠、0.5％磷酸氢二钾、0.01％氯化铁、0.03％硫酸锌、0.01％氯化钴、0.03％硫酸铜、0.5％硫酸铵和0.05％硫酸镁组成。
将LB培养基、葡萄糖、无机盐的混合溶液在121℃条件下灭菌20～30min后，加入氨苄青霉素制成发酵培养基。
2、摇瓶发酵培养取2mL筛选得到的基因重组工程菌菌液加入到含有1000mL发酵培养基的三角瓶中，放入30℃恒温摇床内，以200r/min转速培养16h～20h，至测定600nm处的OD值在1.5～2.5之间。
3、高密度发酵培养在30L发酵罐中加入6L发酵培养液，加入摇瓶培养的发酵液，开始高密度发酵培养，温度35℃，搅拌速度400r/min，保持水溶性氧(dissolved oxygen)＞20％，用25％氨水维持pH值在6.0～7.5之间，发酵6h、8h时分别补加1L的发酵培养基，发酵18h，培养至测定600nm处的OD值10.0以上，得到发酵培养液。
测定表达rhTF243蛋白的活性为20s～30s(以凝血酶原时间计)。
4、rhTF243蛋白活性的测定方法取纯化的rhTF243蛋白30μL(含量为30μg/ml)、30μL磷脂混合物(含量为1mg/mL)、240μLTBSA缓冲液，振荡混匀，37℃水浴中保温30min，得到脂化的rhTF243。取0.5mL脂化的rhTF243、0.5mL 0.1mol/L CaCl2、4mL TBSA混合，在37℃水浴中保温10min，按照血凝仪使用说明进行凝血酶原时间的测定。
磷脂混合物由Sigma公司的PC(产品号为P6354)和PS(产品号为P7769)按7∶3组成。
实施例3rhTF243蛋白的纯化1、制备TP单抗免疫亲和层析柱称取15mg纯化的TF单抗、1g CNBr-活化的Sepharose基质、100mL0.4mol/L NaHCO3偶联缓冲液(pH8.3)、11.7克NaCl，在温度25℃下混合装柱，缓慢振荡2h，排出液体；再用0.1mol/L Tris缓冲液(pH8.2)封闭2h，25℃静置，排出液体；依次用pH3.0的0.1mol/L乙酸钠溶液和pH8.3的0.1mol/LTris缓冲液洗涤，最后用5倍柱体积的PBS缓冲液4℃保存，制备成TP单抗免疫亲和层析柱。
2、rhTF243蛋白的纯化1)菌体破碎将得到的发酵菌体20g溶于2℃～8℃20mmol/L Tris-EDTA缓冲液100mL中，加1％Triton X-100，振荡混匀，用高压匀浆机以60Mpa～100Mpa的高压进行细胞破碎，连续三次破碎后，在4℃～8℃条件下以20000g离心力离心30min，收集上清液，得到释放rhTF243蛋白的破碎液。
2)Q-Sepharose Fast Flow基质层析将破碎液与Q-Sepharose Fast Flow基质等比例充分混合，静置5min，过滤除去基质，清液在4℃～8℃条件下以20000g离心力离心30min，收集上清液，得到粗提液。
3)TP单抗免疫亲和柱层析将粗提液在4℃～8℃条件下加入TP单抗免疫亲和层析柱，依次用5倍柱体积的pH8.0 TrisI-HCl缓冲液、pH6.0磷酸钠缓冲液、pH4.0醋酸钠缓冲液，以240mL/h流速洗涤亲和层析柱，再用pH3.0的醋酸缓冲液洗脱rhTF243蛋白，收集洗脱液，用MILIPORE ULTRA-15型10KB超滤管离心浓缩，收集得到纯化的rhTF243蛋白，-70℃保存。
用紫外分光光度计测定收集液的A280值，计算蛋白含量1.15mg/mL，体积为2.8mL，SDS-PAGE凝胶电泳分析结果见图4。
实施例4制备凝血酶原时间测定试剂1、rhTF243蛋白的磷脂化称取PC(产品号P6354，Sigma公司提供)28mg，PS(产品号P7769，Sigma公司提供)12mg，溶解于18.8mL含有100mmol/L CHAPS的Tris缓冲液(pH7.5，100mmol/L)中，37℃水浴保温2h，加入纯化的rhTF243蛋白1.2mL(含量为1.15mg/mL)，室温静置2h，得到rhTF243磷脂液。
2、配制PT测定试剂取rhTF243磷脂液20mL与1980mL缓冲液(100mmol/L HEPES pH7.0、10mmol/L CaCl2、1mg/mL BSA)混合，振荡混匀，得到PT测定试剂。
3、试剂测定结果使用上述PT测定试剂，按照血凝仪使用说明，可以进行凝血酶原时间的测定。
1)室温(20℃～25℃)放置的重组PT试剂正常人血浆凝血酶原时间测定结果
2)37℃放置的重组PT试剂正常人血浆凝血酶原时间测定结果
3)试剂的灵敏性与用兔脑组织因子制备的PT试剂进行比较，本发明制备的PT试剂具有明显的高敏感性和稳定性，与Recombiplastin(另一用人重组组织因子制备的PT试剂)产品拥有相同的敏感性和稳定性。
敏感性的测定
*正常血浆是指德灵DADE Ci-Trol 1；80％、40％为正常血浆用生理盐水稀释样**ratio指稀释血浆和正常血浆的比值，比值越大，敏感性越高
权利要求
1.一种人重组组织因子，含有天然人组织因子跨膜部分和膜外部分的243个氨基酸残基，为缺失胞内区的截断型人重组组织因子recombinant humantissue factor，简称rhTF243，具有天然人组织因子的全部凝血活性。
2.权利要求1所述人重组组织因子的构建表达方法，其特征是从人胎盘组织中获取总RNA，设计PCR引物，通过RT-PCR方法得到目的基因片段；将收集的TF基因片段与phoA质粒重组，构建TF表达质粒载体pTF243，转化到大肠杆菌MM294中，筛选得到基因重组工程菌株，接入发酵培养基直接发酵表达，得到含rhTF243蛋白的发酵培养菌液。
3.根据权利要求2所述的人重组组织因子构建表达方法，其特征是所述的发酵培养基是以LB培养基为基础，添加2％～5％的葡萄糖、1％～5％无机盐溶液和0.01％～0.05％氨苄青霉素后组成的。
4.根据权利要求2所述的人重组组织因子构建表达方法，其特征是所述的无机盐溶液由0.1％～0.5％磷酸二氢钠、0.5％～1.0％磷酸氢二钾、0.01％～0.05％氯化铁、0.01％～0.03％硫酸锌、0.01％～0.03％氯化钴、0.01％～0.03％硫酸铜、0.5％～1.0％硫酸铵和0.05％～0.10％硫酸镁组成。
5.根据权利要求2所述的人重组组织因子构建表达方法，其特征是rhTF243在大肠杆菌中的表达是由发酵培养液中的无机磷浓度控制的，随着大肠杆菌的发酵培养，培养液中的无机磷逐渐消耗，当无机磷浓度低于0.1mmol/L时，rhTF243蛋白被诱导表达。
6.根据权利要求2所述的人重组组织因子构建表达方法，其特征是所述的发酵培养在温度30℃～37℃和pH6.0～7.5条件下进行，并保持水溶性氧＞20％。
7.权利要求1所述人重组组织因子的纯化方法，其特征是用高压匀浆机破碎发酵培养菌液释放rhTF243蛋白，先用Q-Sepharose Fast Flow基质进行离子交换层析，再通过TF单抗免疫亲和层析柱，收集得到纯化的rhTF243蛋白。
8.根据权利要求7所述的人重组组织因子的纯化方法，其特征是依次用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液、pH 6.0的磷酸盐缓冲液和pH 4.0的醋酸钠缓冲液洗涤吸附在TF单抗免疫亲和层析柱上的rhTF243蛋白，然后用pH 3.0的醋酸缓冲液洗脱rhTF243蛋白。
9.根据权利要求7所述的人重组组织因子的纯化方法，其特征是所述的TF单抗免疫亲和层析柱是由TF单克隆抗体与CNBr-actvated Sepharose FastFlow偶联后制备得到。
10.权利要求1所述的人重组组织因子在制备凝血酶原时间测定试剂盒上的应用。
全文摘要
本发明涉及人重组组织因子的构建、表达和纯化方法及应用。从人胎盘中获取得到的TF基因片段与phoA质粒重组，构建质粒载体pTF
文档编号C07K14/43GK1687125SQ20051001241
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月22日 优先权日2005年3月22日
发明者焦进安, 赵邑, 郝建平, 李晋川, 谢红, 赵峰梅 申请人:太原博奥特生物技术有限公司