专利名称：一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法。属于蛋 白质纯化领 域，是简单高效地制备高纯度，高收率的药用rhGM-CSF原液的方法。
背景技术：
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来源于激活的T细胞、巨噬细胞、成纤维 细胞和内皮细胞，GM-CSF促使造血细胞的增殖和成熟；也能增强抗体依赖的细胞毒活性、 细胞表面受体抗原表达，并刺激细胞因子分泌；特别是能增强肿瘤杀伤细胞因子如肿瘤坏 死因子(TNF) a和IL-10的释放，而TNFa和IL-1 0有很强的抗病毒活性。目前重组人 GM-CSF临床用于治疗因放化疗引起的白细胞减少症，以及用于免疫佐剂。目前报道的关于GM-CSF的专利主要针对以下几点(1)通过特别的菌体破碎步骤 富集GM-CSF 如美国专利4912200 ； (2)采用亲和层析方法纯化，如美国专利5391706 ； (3) 采用分泌型表达宿主菌，如中国专利(申请号03137202. 3)，采用毕赤酵母分泌表达系统， 目标蛋白不需要复性，生物学比活性可达到3.4X107IU/mg;中国专利(申请号98106057) 报道了分泌型表达的大肠杆菌表达系统，目的蛋白表达量占胞周质蛋白的40% ；中国专利 (申请号200810114685. 7)报道也使用毕赤酵母作为表达系统。以上这些报道，大多是强调目的蛋白的表达量和生物学活性，但是对于如何获得 纯度高，相关杂质少的纯蛋白，却基本没有提及。美国专利5391706报道给出了纯化方案， 但这个纯化方案包括了 QAE，亲和层析，硫铵沉淀，凝胶过滤，反相色谱层析等多个步骤，这 一纯化方案显然不符合环保，经济等要求。尤其是反相色谱法纯化蛋白质，需要使用大量的 有机溶剂，不仅价格昂贵，而且有残余溶剂的问题，蛋白质也容易变性失活。纯化产生的有 机溶剂，增加废水污染处理的难度，而且带来潜在的环境污染风险。本专利要解决的恰恰是如何在不使用任何有机溶剂的情况下，获得高纯度的 GM-CSF纯品，满足国外药典中对于本品的质量标准要求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因 子的纯化方法，本发明具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高的特点，在兼顾环保的同 时，提高药品的安全性、可控性和有效性，适合大规模生产。为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人 粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF为包涵体形式，包括下述纯化步骤包涵体超滤复性 -Capto S阳离子柱层析一Superdex 75凝胶过滤层析一得到药用重组人粒细胞巨噬细胞 刺激因子rhGM-CSF原液。所述超滤复性包括如下步骤①取发酵包涵体溶于包涵体溶解液；②将包涵体溶 解液加入复性液中混勻，泵入超滤系统储罐中开始超滤，TMP不大于50psig，要求洗滤液与透过液速度相同，稀释复性35 60分钟；③稀释完毕浓缩收样，按6ml/L加5M醋酸盐调 pH5. 0士0. 05，10000rpm、10°C离心 30min，收集上清。所述的包涵体溶解液配方为盐酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HC150mM ； Nacl40mMo所述的复性液配方为盐酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ；Nacl20mM。所述的Capto S阳离子柱层析步骤中，采用经超滤复性后的样品，进行选择性洗脱 目标蛋白，洗脱条件为50mM醋酸盐和pH为6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。所述的Superdex 75凝胶过滤层析步骤中，洗脱液采用20mM磷酸盐缓冲液。本发明的有益效果是(1)采用超滤复性，以包涵体干重计算，复性率可达到55%以上。(2)工艺简单，步骤少严格控制复性中采用的还原和氧化条件，使复性后样品的 纯度达到80%以上；样品经过第1步柱层析(Capto S柱)后，电泳纯度和HPLC反相纯度 已经达到98%以上，残余菌体蛋白和残余细菌内毒素含量均达到药典标准要求，也就是说 1步柱层析将样品纯化至超过《中国药典》现行版的药用要求；样品只经过2步纯化，即可得 到符合国际标准的原液。(3)原液质量反相色谱纯度(EP)达到98%以上，排阻色谱纯度达到99%以上， 残余工程菌蛋白含量低于0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于 0. 25EU，仅相当于国家标准的120分之1。(4)提高药品的安全性、可控性和有效性，适合大规模生产，工艺单批规模可达到 50g以上。本发明的另一个明显优势是完全避免了强有机溶剂在生产工艺中的使用。乙腈 和甲醇是一种常见的纯化用试剂，以达到蛋白质精细纯化，获得高纯度的目的。当在规模化 生产中使用反相色谱方法进行蛋白的纯化时，乙腈和甲醇等有机溶剂的用量很大，它们都 属于有毒性的溶剂，大量使用有机溶剂带来一系列的问题不仅价格昂贵，生产成本过高； 样品中的残余溶剂可能带来安全性隐患；废水的处理会产生大量的环保处理费用；如排放 到环境中，将对环境带来污染。本工艺在不降低任何收率和纯度指标的情况下，避免使用有 机溶剂，优点突出。
图1是本发明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (还原型SDS-PAGE)银染法电泳图谱；
图2是本发明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非还原型SDS-PAGE)银染法电泳图谱；图3是本发明rhGM-CSF原液HPLC-RPC图谱；图4是本发明rhGM-CSF原液HPLC-SEC图谱；图5是本发明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (非还原型SDS-PAGE)考染法电泳图谱；图6是本发明rhGM-CSF原液SDS-PAGE (还原型SDS-PAGE)考染法电泳图谱。
具体实施例方式下面通过具体实施例，对本发明作进一步的描述。本实施例的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF为包涵体形式，首先进行包涵体超滤 复性①取发酵包涵体(750g士 10%)溶于包涵体溶解液(盐酸胍6M ；pH8. 5士0.05的 Tris-HC150mM ；Nacl40mM)中，加还原剂后充氮避光2小时备用。用0. 5NNa0H溶液清洗 MaxCell UFP-3_C_65超滤系统30min，清洗后用注射水冲洗至中性。②稀释复性将包涵 体溶解液加入复性液(盐酸胍4M ；pH8. 5士0. 05Tris-HC150mM ；Nacl20mM)中混勻，泵入 超滤系统储罐中开始超滤，TMP不大于50psig，要求洗滤液与透过液速度相同，(洗滤液 为pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；恒体积透析一边超滤流出超滤透出液，一边往复性罐中 流加等体积的洗滤液，目的是缓慢地降低复性液中盐酸胍、DTT还原剂等的浓度)稀释复 性35 60分钟。③收样稀释完毕浓缩收样，按6ml/L加5M醋酸盐调pH 5.0士0.05。 10000rpm、10°C离心30min，收集上清，本步骤得到的样品液电泳纯度已达到80%以上。反 相色谱纯度达到80%以上。复性液收率蛋白总量(扫描计)已不低于包涵体重量的8%， 以包涵体干重计算，复性率不低于55%。其次进行CaptoS阳离子柱层析(GM I柱层析)①小100GM I柱层析用0. 5NNa0H 按200士 10% cm/h流速清洗30min，用注射用水按相同流速洗至中性，后用50mM醋酸盐缓 冲液(pH5. 0 士 0. 05)，按300 士 10% cm/h流速平衡I柱约10倍柱体积。②将超滤复性后的样品按300士 10% cm/h流速上样，上样完毕，用50mM醋酸盐 +0. 2M NaCl (PH6. 75士0.05)液按相同流速洗脱，收集目标峰，本步骤得到的I柱后样品，电 泳及液相色谱纯度均达到98%以上。最后进行Superdex 75凝胶过滤层析(GMII柱层析)① 200GMII柱层析用 0. 5NNa0H按20 士 10% cm/h流速清洗30min，用20mM磷酸盐缓冲液按20 士 10% cm/h流速 平衡II柱4倍柱体积。以相同流速上经I柱处理后的样品。②上样完毕，用20mM磷酸盐缓冲液按相同流速洗脱，收集目标峰，取样并送检， rhGM-CSF原液SDS-PAGE (还原型SDS-PAGE)银染法和SDS-PAGE (非还原型SDS-PAGE)银染 法电泳纯度均符合欧洲药典的要求，如图1、2所示。反相色谱纯度(EP)法达到98. 92%， 如图3所示。排阻色谱纯度达到99. 98%，如图4所示。SDS-PAGE (还原型SDS-PAGE)考染 法和SDS-PAGE (非还原型SDS-PAGE)考染法电泳纯度均达到99%以上，高于中国药典的标 准，如图5，6所示。本步骤后得到的得到药用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF原液，排阻 色谱纯度达到99%以上，反相色谱纯度(EP)法达到98%以上，残余工程菌蛋白含量低于 0. 005%，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于0. 25EU，仅相当于国家标准的 120分之1。
权利要求
一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF为包涵体形式，其特征在于包括下述纯化步骤包涵体超滤复性→Capto S阳离子柱层析→Superdex 75凝胶过滤层析→得到药用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF原液。
2.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，其特征在 于所述超滤复性包括如下步骤①取发酵包涵体溶于包涵体溶解液；②将包涵体溶解液 加入复性液中混勻，泵入超滤系统储罐中开始超滤，TMP不大于50psig，要求洗滤液与透 过液速度相同，稀释复性35 60分钟；③稀释完毕浓缩收样，按6ml/L加5M醋酸盐调 pH5. 0士0. 05，10000rpm、10°C离心 30min，收集上清。
3.如权利要求2所述的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于 所述的包涵体溶解液配方为盐酸胍6M ；pH8. 5士0. 05的Tris_HCl 50mM ；Nacl 40mM。
4.如权利要求2所述的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于 所述的复性液配方为盐酸胍4M;pH8. 5士0. 05Tris-HCl 50mM ；Nacl 20mM。
5.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，其特征在 于所述的Capto S阳离子柱层析步骤中，采用经超滤复性后的样品，进行选择性洗脱目标 蛋白，洗脱条件为50mM醋酸盐和pH为6. 75 士 0. 05的0. 2M NaCl。
6.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，其特征在 于所述的Superdex 75凝胶过滤层析步骤中，洗脱液采用20mM磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF为包涵体形式，包括下述纯化步骤包涵体超滤复性→Capto S阳离子柱层析→Superdex 75凝胶过滤层析→得到药用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子rhGM-CSF原液。本发明具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高的特点，在兼顾环保的同时，提高药品的安全性、可控性和有效性，适合大规模生产。
文档编号C07K1/16GK101830976SQ20101017069
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者何艳, 余东新, 孙黎, 杨美花, 林崧, 蔡慧丽, 裴广强 申请人:厦门特宝生物工程股份有限公司