粒细胞集落刺激因子的制作方法

专利名称：粒细胞集落刺激因子的制作方法
粒细胞集落刺激因子本发明涉及粒细胞集落刺激因子(GCSF)融合多肽及二聚体；编码所述多肽的核 酸分子，以及使用所述蛋白质/ 二聚体的治疗方法。细胞因子受体可分为三种独立的类别。第1类(称之为造血生成素 (haemotopoietin)或生长激素家族)受体的特征是，在它们的胞外结构域的氨基末端部分 中含有4个保守半胱氨酸残基，并且在C末端部分中出现保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基 序。该受体由两条多肽链组成。第1类受体可以细分为GM-CSF亚家族(包括IL-3、IL-5、 GM-CSF、GCSF)和IL-6亚家族(包括IL_6、IL_11和IL-12)。在IL-6亚家族中，具有共同的 转导亚基(gpl30)，该转导亚基与一个或两个不同的细胞因子亚基结合。还有一种亚家族被 称为IL-2亚家族(包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)。在第2类(干扰素受体家族)中也 存在重复的Cys基序，其配体为α、β和Y干扰素，但是缺乏保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser 基序。GCSF刺激粒细胞祖细胞的增殖和分化。GCSF由编码来源于不同的mRNA剪切的两 个多肽的单一基因编码。所述多肽的长度为177和180个氨基酸，成熟多肽具有19. 6kD的 分子量。GCSF由内皮和巨噬细胞生成，并且通过在骨髓粒细胞祖细胞上表达的GCSF受体 (GCSFR)起作用，所述骨髓粒细胞祖细胞在活化时导致成熟为粒细胞。然后，它们可以分化 为嗜中性粒细胞前体和成熟的嗜中性粒细胞。重组GSCF的主要治疗应用是在经受癌症化 疗而导致嗜中性粒细胞丢失且随后发展中性粒细胞减少症的患者的治疗中。中性粒细胞减 少症导致免疫抑制，并使患者暴露于感染和败血病。另外，在收集并于造血干细胞移植中使 用之前，使用重组GCSF来增加体内造血干细胞的数量。
本公开内容涉及具有改良的药代动力学(PK)和活性的GCSF重组形式的鉴别。该 新型GCSF分子具有生物活性，形成二聚体并具有改良的稳定性。根据本发明的一方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码具有粒细胞 集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地与粒细胞集落刺激因子 受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域相连的粒细胞集落刺激因子多肽。根据本发明的一方面，提供了一种融合多肽，所述融合多肽包含直接或间接地与 粒细胞集落刺激因子受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域相连的粒细胞集落刺激因 子多肽或其活性部分的氨基酸序列。在本发明的一个优选的实施方案中，所述融合多肽包含粒细胞集落刺激因子受体 多肽的两个细胞因子同源结合结构域。在本发明的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽还含有免疫球蛋白样结构 域。在本发明的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽包括至少一个纤连蛋白III 结构域；优选地2或3个纤连蛋白III结构域。GCSFR是一种复合体，它含有一系列有助于自身分子结构的结构域。GCSFR可以细 分为若干个从结构和功能上定义的区域。该受体长度为812个氨基酸，并且就其包括细胞 外结构域、单个跨膜结构域和细胞质结构域而言，该受体是典型的细胞因子受体。细胞外结构域具有一种模块式结构，所述模块式结构包含成熟多肽的氨基末端；免疫球蛋白样结构 域(氨基酸1-97)；第一细胞因子同源结构域(97-201)和第二细胞因子结构域(202-313)， 以及三个纤连蛋白III结构域。在功能上，第一和第二细胞因子结构域结合GCSF。在本发明的一个优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID NO 31中所表示的 氨基酸残基97-201。在本发明的一个备选的优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ IDNO 31的氨 基酸残基202-313。在本发明的一个备选的优选的实施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨 基酸残基97-313。在本发明的又一个优选的实施方案中，所述融合多肽含有SEQ IDNO 31的氨基酸 残基1-97。在本发明的一个优选的实施方案中，多肽与细胞因子结合结构域相连接，其中在 所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述细胞因子结合结构域的氨基末端。在本发明的一个备选的优选的实施方案中，粒细胞集落刺激因子多肽与细胞因子 结合结构域相连接，其中在所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述细 胞因子结合结构域的羧基末端。在本发明的一个优选的实施方案中，粒细胞集落刺激因子通过肽连接体，优选地 柔性肽连接体与粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域相连接。在本发明的一个优选的实施方案中，所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer0在本发明的一个优选的实施方案中，所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或10 个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer。优选地，所述肽连接分子由6个拷贝的肽GlyGlyGlyGlySer组成。在本发明的一个备选的实施方案中，所述多肽不含有肽连接分子，而是粒细胞集 落刺激因子多肽和粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域的直接融合体。根据本发明的一个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含选自如下的核 酸序列i)SEQ ID NO 5中所表示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 7中所表示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 9中所表示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 11中所表示的核酸序列；v) SEQ ID NO 13中所表示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 15中所表示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 17中所表示的核酸序列；viii) SEQ ID NO 19中所表示的核酸序列；或一种核酸分子，该核酸分子包含在严格杂交条件下与SEQ IDN0:5-SEQ ID NO 19 杂交的核酸序列，并且该核酸分子编码具有粒细胞集落刺激因子受体调节活性的多肽。在本发明的一个优选的实施方案中，所述核酸分子编码具有激动剂活性的多肽。
在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子编码具有拮抗剂活性的多肽。当两个互补的核酸分子相互之间经受一定数量的氢键合时，发生核酸分子的杂 交。杂交严格性，可根据核酸周围的环境条件、杂交方法的本质，以及所用核酸分子的组成 和长度而发生变化。关于获得特定程度的严格性所需的杂交条件的计算，在以下中进行了 讨论Sambrook 等，MolecularCloning :A Laboratory Manual (分子克隆实验室手册) (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,2001)；禾口 Tijssen, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes (生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交)，第一 部分，第二章(ElseviehNew York，1993)。Tm是核酸分子的50%的给定链与其互补链发生 杂交时的温度。下述为杂交条件的示例性设定，但不限于此驢細削牛(介Λ糊辟Φ 90%胃一性請歹斷棘)杂交5XSSC，65°C，16 小时洗涤两次2 X SSC,室温(RT)，每次15分钟洗涤两次0. 5 X SSC, 650C，每次20分钟 鼎(介Λ糊辟Φ 80%胃一性請歹丨隨棘)杂交5X_6XSSC，65°C-70°C，16-20 小时
洗涤两次 2 X SSC, RT,每次5-20分钟洗涤两次1 X SSC, 550C -70°C，每次30分钟低严格性(允许共有至少50%同一性的序列进行杂交)杂交6XSSC，RT-55°C, 16-20 小时洗涤至少两次 2 X -3 X SSC, RT_55°C，每次20-30分钟在本发明的一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5中所表示的 核酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 11中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:13中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:15中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:17中所表示的核 酸序列或由其组成。在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID N0:19中所表示的核酸序列或由其组成。根据本发明的一方面，提供了一种多肽，该多肽由根据本发明的核酸编码。根据本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽包含选自以下组成的组的氨基酸序列或由其组成SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、18、20、25、26、27、28、29 或 30。在本发明的一个优选的实施方案中，所述多肽具有激动剂活性。在本发明的一个备选的优选的实施方案中，所述多肽具有拮抗剂活性。根据本发明的一个方面，提供了一种同型二聚体，所述同型二聚体由两个多肽组 成，其中所述多肽中的每一个包含i)包含粒细胞集落刺激因子或其受体结合结构域的第一部分，所述第一部分任选 地通过肽连接分子连接于ii)包含粒细胞集落刺激因子受体的细胞因子同源结合结构域或其部分的第二部 分。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO :6或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO :8或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 10或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 12或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 14或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 16或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO: 18或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 20或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 25或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 26或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 27或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 28或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 29或由其组成。在本发明的一个优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包 含SEQ ID NO 30或由其组成。根据本发明的另一个方面，提供了 一种载体，该载体包含根据本发明的核酸分子。在本发明的一个优选的实施方案中，所述载体是适于表达根据本发明的核酸分子的表达载体。包含根据本发明的核酸的载体不需要包括启动子或其它调节序列，尤其是在所述 载体被用于将核酸引入细胞内以重组到基因组内用于稳定转染时。优选地，载体内的核酸 可操作地连接到适宜的启动子或其它调节元件以在宿主细胞内转录。该载体可以是在多种 宿主内发挥作用的双功能表达载体。“启动子”是指转录起始位点上游的核苷酸序列，且该 序列包含转录所需的所有调节区域。适宜的启动子包括用于在真核或原核细胞内表达的组 成型的、组织特异性的、可诱导的、发育的或其它启动子。“可操作地连接”是指作为相同核 酸分子的一部分结合，适当地定位并定向，以便从启动子起始转录。可操作地连接于启动子 的DNA，是启动子“转录起始调控下的”。在一个优选的实施方案中，启动子是组成型的、可诱导的或可调控的启动子。根据本发明的另一个方面，提供了一种细胞，该细胞使用根据本发明的核酸分子 或载体进行转染或转化。优选地，所述细胞为真核细胞。可选地，所述细胞为原核细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，所述细胞选自以下组成的组真菌细胞(例 如毕赤酵母属(Pichia spp)、酵母属(Saccharomyces spp)、链孢霉属(Neurospora spp))； 昆虫细胞(例如灰翅夜蛾属(Spodoptera spp))；哺乳动物细胞(例如COS细胞，CHO细 胞)；植物细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，所述细胞是稳定转染或转化的。根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发 明的多肽，包含赋形剂或载体。在本发明的一个优选的实施方案中，所述药物组合物与另外的治疗剂组合。在施用时，本发明的药物组合物以药学可接受的制品施用。这种制品可常规地含 有药学可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体，以及任选的其它治疗剂。本发明的药物组合物可以通过任何常规的途径施用，包括注射。所述施用和应用 可以是，例如，口服的、静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、腔内的、关节内的、皮下的、局部的 (眼睛)、皮肤的(例如乳膏状脂溶性插入物，插入皮肤或粘膜)、透皮的或鼻内的。本发明的药物组合物以有效量施用。“有效量”是单独、或与另外剂量或协同药物 一起产生期望响应的药物/组合物的量。这可包括仅暂时延缓疾病的进程，虽然更优选的 是，它包括永远终止疾病的进程。这可以采用常规的方法进行监测，或可以根据诊断方法进 行监测。施用于受治疗者的药物组合物的剂量，可以根据不同的参数进行选择，尤其是根 据所使用的施用方式以及受治疗者的状态(即，年龄、性别)。当施用时，本发明的药物组 合物以药学可接受的量，以及以药学可接受的组合物应用。当在药物中使用时，盐应当是药 学可接受的，但是非药学可接受的盐可以方便地用来制备其药学可接受的盐，并且不排除 在本发明的范围之外。此类药理学和药学可接受的盐包括但不限于，由下述酸制备的盐盐 酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸，及类似 酸。另外，药学可接受的盐可制备为碱金属盐或碱土盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。如果需要，药物组合物可以与药学可接受的载体结合。此处使用的术语“药学可接 受的载体”，指的是适宜施用于人类的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”指的是天然或合成的有机或无机成分，活性成分与其结合以促进应用。 药物组合物的组分还能够以不产生显著影响预期药效的方式与本发明的分子以及相互之 间共混。药物组合物可以包含适宜的缓冲剂，包括盐形式的乙酸；盐形式的柠檬酸；盐形 式的硼酸；和盐形式的磷酸。药物组合物还可以任选地包含适宜的防腐剂，例如苯扎氯铵；三氯叔丁醇；对羟 基苯甲酸酯类和硫柳汞。
药物组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过任何一种药剂学领域公知 的方法进行制备。所有的方法都包括将活性剂与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步 骤。一般而言，通过均一和紧密地将活性化合物与液体载体、精细分开的固体载体，或两者 结合而制备所述组合物，之后如果需要，将该产品塑形。适宜口服施用的组合物，可以制备成离散的单元，例如胶囊、片齐U、锭剂，每种都含 有预定数量的活性化合物。其它组合物包括水性液体或非水性液体中的悬浮液，例如糖浆 齐U、酏剂或乳剂。适宜肠胃外施用的组合物方便地包括无菌水性或非水性制品，所述制品优选地与 接受者血液等渗。采用适宜的分散剂或湿润剂以及悬浮剂，根据已知的方法可以配制该制 品。无菌的可注射制品还可以是在无毒、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射 的溶液或悬浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇中的溶液。可用的可接受的溶剂是水、林格溶液和 等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油方便地用作溶剂或悬浮介质。对于此目的，可以使 用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸，可以 用于制备注射剂。适用于口服、皮下、静脉内、肌肉内等施用的载体配方，见Remington’ s Pharmaceutical Sciences (雷明顿制药禾斗学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。根据本发明的另一方面，提供了一种治疗患有将受益于施用粒细胞集落刺激因子 激动剂的病况的人类受治疗者的方法，所述方法包括施用有效量的根据本发明的至少一种 多肽。在本发明的一个优选的方法中，所述多肽静脉内施用。在本发明的一个备选的优选的方法中，所述多肽皮下施用。在本发明的另一个优选的方法中，所述多肽以两天的间隔施用；优选地，所述多肽 以每周、每2周或每月的间隔施用。在本发明的一个优选的方法中，所述病况是中性粒细胞减少症。根据本发明的另一方面，提供了一种刺激人类受治疗者造血祖细胞增殖和/或分 化的方法，所述方法包括施用有效量的根据本发明的至少一种多肽。在本发明的一个优选的方法中，所述方法是体外方法。在本发明一个备选的优选的方法中，所述方法是体内方法。在本发明的一个优选的方法中，在刺激造血祖细胞之后，从所述人类受治疗者收 集骨髓，并用于造血祖细胞移植。优选地，将所述收集的骨髓施用于需要骨髓移植的人类受治疗者。根据本发明的一个方面，提供了根据本发明的多肽用于制备治疗中性粒细胞减少 症的药物的用途。
在本发明的又一个优选的实施方案中，所述多肽以两天的间隔施用；优选地，所述 多肽以每周、每2周或每月的间隔施用。根据本发明的另一个方面，提供了有效量的根据本发明的多肽在制备用于刺激人 类受治疗者的造血祖细胞增殖和/或分化的药物中的用途。根据本发明的另一个方面，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体与根据本发 明的多肽或二聚体结合。优选地，所述单克隆抗体是与所述多肽或二聚体结合，但是不具体地特异性结合 粒细胞集落刺激因子或粒细胞集落刺激因子受体的抗体。所述单克隆抗体与本发明的多肽，或包含本发明多肽的二聚体呈递的构象抗原结
I=I O
在本发明的另一方面，提供了一种制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细 胞系的方法，所述方法包括以下步骤i)使用含有至少一种根据本发明的多肽的免疫原来免疫具有免疫活性的哺乳动 物；ii)将被免疫的具有免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂 交瘤细胞；iii)根据对(i)中的多肽的结合活性，筛选通过步骤(ii)中的杂交瘤细胞产生的 单克隆抗体；iv)培养该杂交瘤细胞以便增殖和/或分泌所述单克隆抗体；和ν)从培养上清液中回收单克隆抗体。优选地，所述具有免疫活性的哺乳动物为小鼠。或者，所述具有免疫活性的哺乳动 物为大鼠。使用杂交瘤细胞生产单克隆抗体是本领域中公知的。用来生产单克隆抗体的 方法，由以下公开Kohler 和 Milstein，Nature 256,495-497(1975),以及 Donillard 和 Hoffman, "Basic Facts about Hybridomas，，in Compendiumof Immunology V. II ed. by Schwartz (Schwartz编写的第V. II版免疫学概要中的“杂交瘤基本理论”)，1981，其通过引 用并入。根据本发明的另一方面，提供了一种杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系通过根据 本发明的方法获得或可获得。根据本发明的另一方面，提供了一种检测生物样品中的根据本发明的多肽的诊断 测试，所述测试包括i)提供待测试的分离的样品；ii)将所述样品与结合根据本发明的多肽或二聚体的配体接触；和iii)检测所述样品中的所述配体的结合。在本发明的一个优选的实施方案中，所述配体是抗体；优选地，是单克隆抗体。在整个说明书的描述和权利要求中，单词“包含(comprise)，，和“含有 (contain) ”，以及这些单词的变形，例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises) ”，指的 是“包括但不限于”，并且不预期(和确实不)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。
在整个说明书的描述和权利要求中，单数包含复数，除非文中另有要求。尤其是，在使用不定冠词的地方，该说明书理解为包括复数和单数，除非文中另有要求。结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特点、化合物、化学 部分或组，将被理解为适用于文中所描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与之不 相容。现在，将仅仅通过例子和参考以下的附图描述本发明的实施方案图Ia编码在哺乳动物细胞系中表达的GCSF的核酸序列。信号序列以粗体小写字 母表示。*指的是终止密码子。核苷酸长度= 522bp，(不包括信号序列)；图Ib氨基酸序 列长度=174aa(不包括信号序列)；图2a编码在大肠杆菌(pET21a(+))中表达的GCSF的核酸序列，具有6X组氨酸 标签;ATG起始密码子以粗体表示。*指的是终止密码子。粗斜体字母指的是在5’末端由 于组氨酸标签而产生的过量序列；图2b成熟氨基酸序列长度=182aa(不包括甲硫氨酸起 始点)；图3a编码GCSF-L6-GCSFrEC(l-3)的核酸序列含有通过G4SX6与GCSF细胞外 受体结构域1-3 (Ig，BN和BC)连接的GCSF。*指的是终止密码子。信号序列以粗体小写字 母表示；图3b氨基酸序列长度=511aa(不包括信号序列)；图4a编码在大肠杆菌中表达的GCSF-L6-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有通过 G4SX6与GCSF细胞外受体结构域l_3(Ig，BN和BC)连接的GCSF。*指的是终止密码子； ATG起始密码子以粗体表示。*指的是终止密码子。粗斜体字母指的是在5’末端由于组氨 酸标签而产生的过量序列；图4b氨基酸序列长度=519aa(不包括甲硫氨酸起始点)；图5a编码在哺乳动物细胞系中表达的GCSF-L8-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有 通过G4SX8与GCSF细胞外受体结构域1-3 (Ig，BN和BC)连接的GCSF。*指的是终止密码 子。信号序列以粗体小写字母表示；图5b氨基酸序列长度=521aa(不包括信号序列)图6a编码在大肠杆菌中表达的GCSF-L8-GCSFrEC(l_3)的核酸序列含有通过 G4SX8与GCSF细胞外受体结构域l_3(Ig，BN和BC)连接的GCSF。*指的是终止密码子； 图6b氨基酸序列长度=529aa (不包括甲硫氨酸起始点)图7a编码GCSF-L6-GCSFrEC(l-2)的核酸含有通过G4SX6与GCSF细胞外受体 结构域l-2(Ig和BN)连接的GCSF。*指的是终止密码子。信号序列以粗体小写字母表示； 图7b氨基酸序列长度=404aa(不包括信号序列)图8a编码GCSF-L6-GCSFrEC(2-3)的核酸含有通过G4SX6与GCSF细胞外受体 结构域2-3(BN和BC)连接的GCSF。*指的是终止密码子。信号序列以粗体小写字母表示； 图8b氨基酸序列长度=416aa(不包括信号序列)图9a编码GCSFrEC (1-3) -L6-GCSF的核酸含有通过G4S X 6与GCSF连接的 GCSFrEC(结构域1-3)。*指的是终止密码子。信号序列以粗体小写字母表示；图9b氨基 酸序列长度=511aa(不包括信号序列)图IOa编码在哺乳动物细胞系中表达的GCSFrEC (2-3)-L6-GCSF的核酸含有通过 G4SX6与GCSF连接的GCSFrEC(结构域2-3)。*指的是终止密码子。信号序列以粗体小写 字母表示；图IOb氨基酸序列长度=416aa (不包括信号序列)图Ila编码在哺乳动物细胞系中表达的GCSFrEC的核酸序列含有GCSF受体细胞外结构域1-3。信号序列以粗体小写字母表示。*指的是终止密码子；图lib氨基酸序列长度=307aa (不包括信号序列)；以及

图12a在pET21a(+)中表达的核酸序列GCSFrEC (细胞外结构域1-3)，具有6 X组 氨酸标签(*指的是终止密码子，粗体字母指的是外Xhol限制性位点和6X组氨酸标签)； 图12b氨基酸序列长度=315aa(不包括Met)；图13a)使用PCR生成由侧翼于适宜的限制性位点(包含在引物Rl_4内)的感兴 趣的基因组成的DNA。b)PCR产物连接进入适宜载体中连接体区域的任一侧。c)然后对构建 体进行修饰以引入正确的连接体，其不包含任何不需要的序列(即，非天然限制性位点)； 以及图14a)设计寡核苷酸以形成具有独特重叠的部分双链区域，并且在退火和加工 时，所述寡核苷酸将编码具有侧翼区的连接体，其将退火至配体和受体。b)使用“大引物 (megaprimer) ”和末端引物(Rl和R2)进行PCR,以形成LR-融合基因。Rl和R2引物被设 计为引入有用的侧翼限制性位点以便连接入靶载体；图15是粒细胞集落刺激因子受体的完整氨基酸序列；图16示出表达GCSF嵌合构建体的CHO flpln稳定细胞系的蛋白质印迹分析。泳 道1 = 4A1 ；泳道2 = 4D1 ；泳道3 =模拟培养基；泳道4 = 4A1 ；泳道5 = 4D1 ；泳道6 =模 拟培养基；A =非还原条件；B =还原条件。4A1和4D1都介于75kDa和IOOkDa之间运行。 GCSF介于37kDa和45kDa之间运行，如针对糖基化蛋白所预期的；图17是GCSF LR-融合构建体的图示；图18是表达4A1和4D1构建体的CHO Flp-In稳定细胞系的免疫印迹分析。泳道 M=分子量标记(250、150、100、75、50、37、25*20kDa)；泳道 1 = 4A1 ；泳道 2 = 4D1 ；泳道 3 =模拟培养基；泳道4 = 4A1 ；泳道5 = 4D1 ；泳道6 =模拟培养基；泳道1_3 =还原条件， 而泳道4-6=非还原条件；图19是表达GCSF、4B1、4C1、4C2和4E1构建体的CHO Flp-In稳定细胞系的免疫 印迹分析。泳道 M=分子量标记(250、150、100、75、50、37、25、20*15kDa) ；_=无 DTT (二 硫苏糖醇)(非-还原的)；+=含DTT (还原的)；图20(A)4A1纯化步骤的考马斯染色的凝胶。泳道M =分子量标记(250、150、100、 75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =粗培养基IOX浓缩物；泳道2 = pH4. 5沉淀的粒状沉 淀(pellet)；泳道3 = pH4. 5沉淀的上清液，泳道4 = pH5. 5SP未结合的，泳道5 = pH5. 5SP 结合的，泳道6-8 =从pH8. OQ柱中得到的级份4至6，泳道9 = 50%硫酸铵沉淀的粒状沉 淀。⑶纯化的4A1的免疫印迹。泳道M =分子量标记(如上所述)，泳道1 = 4A1 (含DTT ； 还原的)，泳道2 = 4A1 (无DTT;非还原的)；以及图21示出测量GCSF、Neulasta和GCSF LR融合体4A1活性的体外生物测定。材料和方法体外检测检测GCSF融合多肽活性的体外方法是本领域已知的。例如，收集动物血液、骨骼 和脾细胞以检测GCSF的集落形成能力是已知的(见Liu等Blood，15 May 2000 ；95 (10), P3025-3031)。另外，表达GCSFR的细胞例如M-NFS-60细胞的用途，以及如通过3H-胸苷所 测量的被刺激而增殖的细胞的用途，是已知的。
体内检测可以使用不同的动物模型来检测GCSF的活性。例如，Harada等(NatureMedicine 11 305-311,2005)描述了一种小鼠心肌梗塞模型，其中检测GCSF的作用，以便监测所施用 的重组GCSF对心脏功能的作用。免疫学检测测量粒细胞集落刺激因子与多克隆和单克隆抗体结合的免疫测定是本领域已 知的。可以用商购获得的粒细胞集落刺激因子抗体来检测样品中的粒细胞集落刺激因 子，并用于竞争性抑制研究。例如见，http //www, scbt. com/index, html, Santa Cruz Biotechnology Inc0融合蛋白的重组牛产通过使用经设计退火至配体或受体，以及引入适宜限制性位点以便克隆进入靶载 体的引物的PCR，来生成融合蛋白的组分(图13a)。PCR模板含有靶基因，并且由IMAGE克 隆、cDNA文库或定制合成的基因获得。一旦具有适宜侧翼限制性位点的配体和受体基因被 合成，它们就在靶载体中连接体区域的任一侧连接(图13b)。然后通过在连接体区域任一 侧的两个独特限制性位点之间插入定制合成长度的DNA，通过ssDNA修饰技术突变连接体 区域，通过在适宜限制性位点之间插入引物双链体/多链体，或通过PCR修饰，来对构建体 进行修饰以使其含有无侧翼限制性位点的正确连接体(图13c)。或者，经设计退火至所选配体或受体结构域的具有侧翼序列的连接体，最初是通 过创建寡核苷酸双链体，然后对其加工以产生双链DNA而合成的(图14a)。之后，使用作为 “大引物”的连接体序列，针对“大引物”退火至的配体和受体的相反末端设计的引物，以及 作为模板的配体和受体，进行PCR。末端引物设计有适宜的限制性位点，以连接进入所选的 表达载体(图14b)。融合蛋白的表达和纯化在适宜的系统(例如，哺乳动物CHO细胞、大肠杆菌)中进行表达，而这依赖于 其中产生LR-融合基因的载体。然后使用多种方法针对表达进行分析，所述方法可包括 SDS-PAGE、非变性PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种。一旦获得了适宜水平的表达，就大规模表达LR-融合体，以产生足够的蛋白用于 纯化和随后分析。使用一种或多种色谱学程序的适宜组合来进行纯化，所述程序例如离子交换色谱 法、疏水相互作用色谱法、硫酸铵沉淀法、凝胶过滤法、尺寸排阻和/或亲和色谱法(使用镍 /钴_树脂、抗体_固定树脂和/或配体/受体_固定树脂)。使用多种方法分析纯化的蛋白，所述方法可包括Bradford测定、SDS-PAGE、非变 性PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种。LR-融合体的特征使用变性PAGE、非变性PAGE凝胶和蛋白质印迹来分析融合多肽，并且采用对 LR-融合体非-构象地(non-conformationally)敏感的抗体进行蛋白质印迹。非变性溶解 状态分子量信息，可以从诸如使用Superose G200分析柱的尺寸排阻色谱法和分析型超速 离心的技术获得。统计
如果两个组的方差为正态分布，则采用Student’ s检验进行比较，或者如果是非 正态分布，则采用Student-Satterthwaite，s检验。采用F检验对分布进行检验。使用单 因素方差分析来比较3组或更多组的平均值，如果显著性水平为ρ < 0. 05，采用Durmett's 检验进行单独比较。所有统计学检验在5 %显著性水平都是双侧的，并且不针对漏失值进行 归因。嵌合克降的构建GCSF细胞外受体结构域1-3，直接来源于从Image Consortium获得的克隆的PCR， 并且克隆进入哺乳动物表达载体pSecTag-link。使用基因合成构建4A1 (图3a ；图3b) 和4D1 (图9a ；图9b)两种基因，并且克隆进入哺乳动物表达载体pSecTag-link，以形成 pGCSFsecTag-4Al和 4A5。GCSF和嵌合克降的哺乳动物稳定表汰
使用改良的Invitrogen载体pSecTag-V5/FRT_Hist，建立哺乳动物表达系统。该 系统允许在宿主基因组内的特异位点中快速产生稳定克隆，以形成高表达。这可以用于分 泌型或胞质表达的蛋白。Flp-In宿主细胞系(flp-InCHO)具有单个Flp重组酶靶(FRT)位 点，该位点位于转录活性的基因组基因座。通过将载体(含FRT靶位点)和pOG44(瞬时表 达flp重组酶的质粒)共转染进入Flp-In细胞系，而形成稳定的细胞系。采用潮霉素B进 行选择。因为DNA的整合是定向的，所以不需要进行克隆的选择。培养Flp-In细胞系使 用基本的细胞培养技术，按照生产商说明书进行。使用Fimene-6的CHO Flp-In细胞的稳定转染在转染的前一天，以6X IO5每IOOmm培养皿将CHO Flp-In细胞接种于总体积为 IOml的Hams F12培养基，该培养基包含10% (ν/ν)胎牛血清、青霉素/链霉素和4mM L-谷氨酰胺。第二天，将570 μ 1不含血清的培养基(不含抗生素)加至1.5ml聚丙烯管。 之后，加入30μ1 fugene-6，并通过轻轻摇晃混合。针对每一次转染，形成单独的质粒混合 物，该混合物将2 μ g感兴趣的质粒与18 μ g pOG44合并(质粒包含将质粒正确整合入宿主 基因组所必需的重组酶)。对照板中不含质粒。通过轻轻摇晃将其与fugene-6混合，室温放 置15分钟，之后，逐步施用于每个培养皿的表面，该培养皿含有在F12培养基+10% FCS中 的CHO Flp-In细胞。轻轻摇晃所述板，确保充分混合，并在37°C /5% C02下放置24小时。 第二天，将培养基更换为含600 μ g/ml潮霉素B的选择培养基。通常，将细胞保持在60%汇 合或更低。细胞一直在存在600 μ g/ml潮霉素B的情况下生长，直至对照板细胞(未转染 细胞)死亡(即，无潮霉素抗性)。SDS-PAGE分析和蛋白质印迹稳定转染的CHO Flp-In细胞系在75cm2瓶中生长大约3-4天，此时，收集样品用于 分析。在存在和不存在25mM DTT的情况下，样品与等体积的Laemmli上样缓冲液混合，并 煮沸5分钟。在4-20% (w/v)双丙烯酰胺凝胶上分离样品，并转移至PVDF膜(图16)。在 含5% (w/v)牛奶蛋白质的PBS-0.05% (v/v)Tween 20中封闭之后，使用特异性的抗GCSF 抗体，结合辣根过氧化物酶(HRP)轭合的二抗，进行样品检测。采用HRP检测试剂盒，在胶 片上经化学发光进行显像。LR-融合体的构建4Α1和4D1是合成的基因(Genecust，France)，并且插入到哺乳动物表达载体pSegTag中。通过使用PCR截短4A1和4D1基因，分别产生4B1和4E1。通过合成连接体区 域的引物双链体，并使用PCR将其延伸为GCSF和GCSFR序列，产生4A2、4C1和4C2。由于 PCR未能将出4幻8连接体序列延伸为全长基因，因此没有合成4A2。4C2作为4C1合成的副 产物产生。GCSF-LR融合蛋白构建体的图示，示于图17。LR-融合体的表汰使用改良的Invitrogen载体pSecTag-V5/FRT_Hist，建立了哺乳动物表达系统。 在Invitrogen's Flp-In系统中，使用该载体来指导靶基因整合进入宿主细胞系，允许在宿 主基因组内特异位点中快速产生稳定克隆，以形成高表达。培养Flp-In细胞系使用基本细胞培养技术，按照生产商说明书进行。
在6孔板内，使用Fugene-6作为转染试剂，产生稳定的细胞系。CHOFlp-In细胞与 表达载体和P0G44共转染，pOG44是一种表达flp重组酶的质粒，所述flp重组酶是一种使 得LR-融合基因重组进入细胞染色体“热点”的酶。使用潮霉素B来挑选具有阳性重组体 的细胞。一旦建立了稳定的细胞系，就将其培养在75cm2培养板中，在50_70%汇合时，将培 养基更换为无血清培养基。将培养物再孵育2-4天，之后，收集培养基样品。将这些在13% SDS-PAGE凝胶上运行，并转移至PVDF膜以便进行免疫印迹。在含5% (w/v)牛奶蛋白质的 PBS+0. 05% (v/v)Tween20中封闭之后，使用特异性的抗GCSF抗体，结合辣根过氧化物酶 (HRP)轭合的二抗，进行样品检测。使用HRP检测试剂盒，在胶片上经化学发光进行显像。 显示LR-融合体表达的免疫印迹，示于图18和19。LR-融合体的纯化下面详述了 GCSF-LR的纯化方法，且示于图20。a)将蛋白酶抑制剂加入表达4A1的细胞的IOX浓缩培养基中。b)将该 IOX 浓缩培养基对 50mM TRIS, ImM EDTA, ρΗ8· 0 透析 2-4 小时。c)将来自(2)的蛋白和透析管转移至IOmM TRIS, ImM EDTA, pH8. 0的溶液，持续 16小时(过夜)。d)加入0. 25倍体积的0. IM乙酸盐缓冲液，pH4. 5。使用pH试纸(indicator strip)检测pH，并以0. Iml等份试样加入更多的0. IM乙酸盐缓冲液，pH4. 5，直至pH达到 4. 5。e)然后在冰上孵育2小时，并定期混合。f)进行离心以去除沉淀，并将上清液转移至新管中。g)以0. Iml等份试样将0. 5M/0. IM NaOH加至上清液，直至pH变为5. 5_使用pH 试纸分析的PH。h)之后，将该溶液上样到预先用25mM乙酸盐缓冲液，pH5. 5平衡的5ml SP FF柱 上。收集未结合的蛋白。i)将未结合级分对25mM TRIS, ImM EDTA, ρΗ8· 0透析16小时(过夜)。j)将透析的样品上样至预先用25mM TRIS pH8. 0平衡的5ml Q FF柱上。k)用20倍柱体积的25mM TRIS，pH8. 0洗涤柱子。1)之后，用O-IM NaCl梯度在20倍柱体积内从柱子上洗脱蛋白，收集1倍柱体积 的级份。[4A1在5ml柱子的级份4-7中被洗脱]。
m)将含有> 70%纯4A1的级份汇集在一起，并在冰上孵育。η)加入等体积冰冷的饱和硫酸铵溶液，以达到50%硫酸铵的饱和度。在冰上孵育 2-3小时。ο)然后离心蛋白样品，以使沉淀的蛋白成粒状沉淀。ρ)将粒状沉淀重悬于PBS，并将其对PBS透析。
q)之后，分析蛋白样品。体外牛物测定细胞制备将AML-193细胞(ATCC，批号3475266)从液氮储器中取出，并在37°C水浴中放置2 分钟。之后，把管形瓶中的内容物转移至含有9ml培养基(在Iscove's改良的Dulbecco's 培养基中含有5 % FBS、4mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、5ng/mlGM_CSF、 5yg/ml胰岛素、5yg/ml转铁蛋白)的15ml管中。以123Xg离心细胞5分钟，在培养基 中重悬细胞粒状沉淀，并且将细胞密度调整至2. 3X IO5个细胞/ml。细胞培养在CO2培养箱(5%C02，37°C)中，以3 X 105_2 X IO6个细胞/ml的密度于培养基中 培养细胞。每周进行传代两次，确保细胞密度不超过2. 5X IO6个细胞/ml。通过台盼蓝排 除评估细胞存活力。在测定前，通过以 125 Xg离心(spinning) 5分钟用PBS洗涤细胞3 次。之后，在测定培养基(在Iscove's改良的Dulbecco's培养基中含有5% FBS、4mML-谷 氨酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素、5 μ g/ml胰岛素、5 μ g/ml转铁蛋白)中重构粒 状沉淀，并且将细胞密度调整至5X IO5个细胞/ml。标准品/样品制备在PBS(1% BSA)中制备4A1的GCSF蛋白溶液的适当稀释液，用于生物活性检测。 在50%磷酸盐缓冲的盐水溶液和水(都是无菌的)中，将GCSF(国际标准品，NIBSC，批号 88/502)重构成lOng/ml (10000IU/ml)的浓度，分成40 μ 1的等份试样，并在_80°C保存。在 每天测定时，从冰柜中取出1个管形瓶，并制备成工作浓度。GCSF-LR(4A1)的体外生物活性，示于图21。
权利要求
一种核酸分子，其包含编码具有粒细胞集落刺激因子活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地与粒细胞集落刺激因子受体多肽的至少一个细胞因子结合结构域连接的粒细胞集落刺激因子多肽。
2.一种融合多肽，其包含直接或间接地与粒细胞集落刺激因子受体多肽的至少一个 细胞因子结合结构域连接的粒细胞集落刺激因子多肽或其活性部分的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含粒细胞集落刺激因子受体多 肽的两个细胞因子结合结构域。
4.如权利要求2或3所述的融合多肽，其中所述多肽还含有免疫球蛋白样结构域。
5.如权利要求2-4中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一个纤连蛋白 III结构域。
6.如权利要求2-5中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31中所表 示的氨基酸残基97-201。
7.如权利要求2-6中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸残基202-313。
8.如权利要求2-7中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸残基97-313。
9.如权利要求2-8中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽含有SEQIDNO :31的氨基 酸残基1-97。
10.如权利要求2-9中任一项所述的融合多肽，其中粒细胞集落刺激因子多肽与细胞 因子结合结构域相连，其中在所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述 细胞因子结合结构域的氨基末端。
11.如权利要求2-9中任一项所述的融合多肽，其中粒细胞集落刺激因子多肽与细胞 因子结合结构域相连，其中在所述融合多肽中，所述粒细胞集落刺激因子多肽被置于所述 细胞因子结合结构域的羧基末端。
12.如权利要求2-11中任一项所述的融合多肽，其中粒细胞集落刺激因子多肽通过肽 连接体与粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域相连。
13.如权利要求12所述的融合多肽，其中所述肽连接分子含有至少一个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer0
14.如权利要求13所述的融合多肽，其中所述肽连接分子含有2、3、4、5、6、7、8、9或10 个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer。
15.如权利要求14所述的融合多肽，其中所述肽连接分子由6个拷贝的肽 GlyGlyGlyGlySer 组成。
16.如权利要求2-11中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽不含有肽连接分子，而 是粒细胞集落刺激因子多肽和粒细胞集落刺激因子受体多肽的结合结构域的直接融合体。
17.一种核酸分子，其包含选自如下的核酸序列i)SEQID NO 5中所表示的核酸序列；ii)SEQID NO 7中所表示的核酸序列；iii)SEQID NO 9中所表示的核酸序列；iv)SEQ ID NO 11中所表示的核酸序列；ν) SEQ ID NO 13中所表示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 15中所表示的核酸序列；vii)SEQ ID NO 17中所表示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 19中所表示的核酸序列；或一种核酸分子，其包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO :5-SEQ IDNO 19杂交的核酸序 列，并且该核酸分子编码具有粒细胞集落刺激因子受体调节活性的多肽。
18.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有激动剂活性的多肽。
19.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有拮抗剂活性的多肽。
20.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :5中所表示的 核酸序列。
21.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :7中所表示的 核酸序列。
22.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :9中所表示的 核酸序列。
23.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDN0:11中所表示的 核酸序列。
24.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :13中所表示的 核酸序列。
25.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :15中所表示的 核酸序列。
26.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :17中所表示的 核酸序列。
27.如权利要求17所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO :19中所表示的 核酸序列。
28.一种多肽，其由权利要求17-27中任一项所述的核酸编码。
29.一种多肽，其包含选自由以下所组成的组的氨基酸序列SEQ IDN0:6、8、10、12、 14、16、18、20、25、26、27、28、29 或 30。
30.如权利要求29所述的多肽，其中所述多肽具有激动剂活性。
31.如权利要求29所述的多肽，其中所述多肽具有拮抗剂活性。
32.—种同型二聚体，所述同型二聚体由两个多肽组成，其中所述多肽中的每一个含有i)含有粒细胞集落刺激因子或其受体结合结构域的第一部分，所述第一部分通过肽连 接分子任选地连接于 )含有粒细胞集落刺激因子受体的细胞因子同源结合结构域或其部分的第二部分。
33.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :6ο
34.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :8ο
35.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含 SEQ ID NO :10ο
36.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :12ο
37.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :14ο
38.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :16ο
39.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :18ο
40.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :20ο
41.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含SEQ ID Ν0:25或由其组成。
42.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :26ο
43.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :27ο
44.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :28ο
45.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :29ο
46.如权利要求32所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽 包含 SEQ ID NO :30ο
47.一种载体，其包含如权利要求1或17-27中任一项所述的核酸分子。
48.一种细胞，其采用如权利要求1或17-27中任一项所述的核酸分子或如权利要求 47所述的载体进行转染或转化。
49.如权利要求48所述的分离的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
50.如权利要求48所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求2-16或28-31中任一项所述的 多肽，包含赋形剂或载体。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述药物组合物与另外的治疗剂组合。
53.一种治疗患有将受益于施用粒细胞集落刺激因子多肽的病况的人类受治疗者的方 法，所述方法包括施用有效量的如权利要求2-16或28-31中任一项所述的至少一种多肽。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述多肽是静脉内施用。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述多肽是皮下施用。
56.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述多肽以两天的间隔施用。
57.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述多肽以每周的间隔施用。
58.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述多肽以每两周的间隔施用。
59.如权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述多肽以每月的间隔施用。
60.如权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述病况是中性粒细胞减少症。
61.一种刺激人类受治疗者中造血祖细胞的增殖和/或分化的方法，所述方法包括施 用有效量的如权利要求2-16或28-31中任一项所述的至少一种多肽。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述方法是体内方法。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述方法是体外方法。
64.如权利要求61或62所述的方法，其中在刺激造血祖细胞之后，从所述人类受治疗 者收集骨髓，并用于造血祖细胞移植。
65.如权利要求64所述的方法，其中将所述收集的骨髓施用于需要骨髓移植的人类受 治疗者。
66.如权利要求2-16或28-31中任一项所述的多肽用于制备治疗中性粒细胞减少症的 药物的用途。
67.有效量的如权利要求2-16或28-31中任一项所述的多肽在制备刺激人类受治疗者 造血祖细胞增殖和/或分化的药物中的用途。
68.一种单克隆抗体，其与如权利要求2-16或28-46中任一项所述的多肽或二聚体结合。
69.如权利要求68所述的单克隆抗体，其中所述抗体是与多肽或二聚体结合，但不具 体地特异性结合粒细胞集落刺激因子或粒细胞集落刺激因子受体的抗体。
70.一种用于制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，所述方法包 括如下步骤i)采用含有根据本发明的至少一种多肽或其片段的免疫原来免疫具有免疫活性的哺 乳动物； )将被免疫的具有免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交 瘤细胞；iii)根据对(i)中的多肽的结合活性，筛选由步骤(ii)中的杂交瘤细胞产生的单克隆 抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞以便增殖和/或分泌所述单克隆抗体；并且 ν)从培养上清液中回收所述单克隆抗体。
71.一种杂交瘤细胞系，其通过权利要求70所述的方法获得或可获得。
72.—种检测生物样品中的根据本发明的多肽的诊断测试，所述诊断测试包括i)提供待测试的分离的样品；ii)将所述样品与结合权利要求2-16或28-46中任一项所述的多肽或二聚体的配体接 触；并且iii)检测在所述样品中所述配体的结合。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述配体是抗体。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了粒细胞集落刺激因子融合多肽；编码所述多肽的核酸分子，以及使用所述蛋白的治疗方法。
文档编号C07K14/535GK101827857SQ200880110315
公开日2010年9月8日 申请日期2008年7月31日 优先权日2007年8月3日
发明者乔恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·罗斯 申请人:埃斯特瑞恩有限公司