衣原体抗原的制作方法

专利名称：衣原体抗原的制作方法
衣原体抗原
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院提供的基金AI039558的政府支持下完成。政府对 本专利具有某些权利。
背景技术：
沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)是克隆和感染眼殖表面的一种细胞内细菌病 原体。沙眼衣原体的眼部感染引起沙眼，沙眼是导致结疤和失明的慢性滤泡性结膜炎。 世界卫生组织(WHO)估计全世界有3-5亿人被沙眼折磨(Resnikoffet al.，Bull.WH082 844-851，2004)，使它成为传染性可预防失明的最普遍的形式(Whitcher et al.，Bull. WHO 79 214-221，2001)。在发展中国家和工业化国家中(WHO，Global Prevalence and Incidence of SelectedCurable Sexually Transmitted Infections Overview and Estimates, WHO, Geneva, 2001)泌尿生殖器的感染是细菌性性传播疾病的主要原因(Division of STD Prevention, Sexually Transmitted DiseaseSurveillance 1997, Centers Dis.Cont.Prev.， Atlanta, 1998)。而且，性传播疾病是 HIV 传播(Plummer et al.，J.Infect.Dis.163 233-239，1991)，不育(Westrom et al.，Sex.Trans.Dis.19 185-192，1991)和人乳头状瘤 病毒诱导的宫颈瘤(Anttila etal.，J.Am.Med.Assoc.285 47-51，2001)的危险因素。
由于所有上述原因，沙眼衣原体感染的控制是一项重要的公共卫生目标。发明内容
本发明的特征是沙眼衣原体抗原，和该抗原的治疗用途。本发明的抗原可以用 于治疗或预防受试者中的沙眼感染。
第一个方面，本发明提供了一种包含与SEQ ID NO: 1基本上相同的序列的分离 的CT144多肽，或其片段，与在相同的检测中无免疫原性肽(non-immunogenic peptide) (例如在相同的检测中引起IFN-Y的最低可测量值的肽)引发的干扰素、产生水平相 比，它引起T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、、 50、60、70、80、90、100、200或500倍的增加。理想的CT144片段具有至少7个氨基 酸和/或引发CD4+T细胞应答。
本发明的一个优选的实施例是分离的CT144多肽的片段，它(1)包括CT144 多肽的氨基酸序列67-86 (AQGKLIVTNPKSDISFGGRV ； SEQ ID NO 2)或氨基酸序列 77-96 (KSDISFGGRVNLADNTVNYS ； SEQ ID NO 3)，(2)在 SEQID No 2 或 3 的 N-和/或C-端具有至少一个侧翼氨基酸，(3)长度小于观0、270、260, 250、240, 230、 220、 210、 200、 190、 180、 170、 160、 150、 140、 130、 120、 110、 100、 90、 80、70、60、50、40、35、30、25、或20个氨基酸，且与在相同的检测中无免疫原 性肽引发的干扰素Y产生水平相比，引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、 7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明的相关实施例是CT144多肽的分离的片段，它⑴包括SEQ ID NO: 2或3的序列；(2)在SEQ ID NO : 2或3序列的N_和/或C-端具有至少一个侧翼氨基酸； ⑶长度小于280个氨基酸；(4)包含在SEQ ID NO 2或3的序列中的一个或多个，优 选地1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个保守的氨基酸取代；和(5)与在相同的检测 中无免疫原性肽引发的干扰素、产生的水平相比，引发T淋巴细胞群干扰素、产生至 少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增 加。
一个优选的实施例是具有SEQ ID NO 2或3序列的CT144多肽的分离的片段， 与在相同的检测中无免疫原性的肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群 干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、或500倍增加。
本发明进一步的实施例是具有SEQ ID NO 2或3序列的CT144多肽的分离的片 段，其在该多肽的N-和/或C-端去除1、2、3、4、5或6个氨基酸，与在相同的检测中 无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、 4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明另一个实施例是CT144多肽的分离的片段，(1)包含SEQIDNO: 2或3 的序列，(2)包含一个或多个，优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个保守的氨基 酸取代，且(3)与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素γ产生水平相比，它引发T 淋巴细胞群干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、 90、100、200、或 500 倍增加。
本发明进一步提供一种CT242多肽(SEQ ID No: 4)的分离的片段，它 (1)包含CTM2多肽的氨基酸109-117 (YQILNQSNL ； SEQID NO 幻或氨基酸 112-120 (LNQSNLKRM ； SEQ ID NO 6) ； (2)少于 170、160、150、140、130、120、 110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、或 10 个氨基酸；且(3)与在 相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500倍增加。理想的CT242片段具有至少7个氨基酸和/或引发CD8+T细胞应答。
本发明一个优选的实施例是CT242多肽的分离的片段(1)包含SEQ ID NO 5或6的序列；(2)在SEQ ID NO : 5或6序列的N_和/或C-端具有至少一个侧翼氨 基酸；(3)长度小于170个氨基酸；且(4)与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素 Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、 30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明的相关实施例是CT242多肽的分离的片段，它⑴包含SEQ ID NO: 5或 6的序列；(2)在SEQ ID NO : 5或6序列的N_和/或C-端具有至少一个侧翼氨基酸； ⑶长度小于170个氨基酸；(4)包含在SEQ ID NO : 7、8、或9的序列中1个或多个， 优选地1、2、3、4、或5个保守的氨基酸取代；且(4)与在相同的检测中无免疫原性肽 引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、 7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
一个优选的实施例是具有SEQ ID NO 5或6序列的CT242多肽的分离的片段， 与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、或500倍增加。
本发明进一步的实施例是具有SEQ ID NO 5或6序列的CT242多肽的分离的片 段，该片段是在该多肽的N-和/或C-端去除1个或2个氨基酸，与在相同的检测中无 免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、 4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明另一个实施例是CT242多肽的分离的片段，(1)具有SEQIDNO: 5或6 的序列，( 包含一个或多个，优选地1、2、3、4、或5个保守的氨基酸取代，与在相同 的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产 生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明进一步提供CT812多肽6EQIDN0: 7)的分离的片段，它(1)包含 CT812 多肽的氨基酸 103-111 (FSVTNPVVF ； SEQ ID NO 8)，(2)少于 770、760、750、740、730、720、710、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、 80、 70、60、50、 40、 30、.25、20、15、或10个氨基酸，且(3)与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发 T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、200、或500倍增加。理想地，CT812片段具有至少7个氨基酸和/或引 发CD8+T细胞应答。
本发明一个优选的实施例是CT812多肽的分离的片段(1)包含SEQ ID NO: 8的序列；(2)在SEQ ID NO 8序列的N_和/或C_端具有至少一个侧翼氨基酸；(3) 长度小于770个氨基酸；且(4)与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水 平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明一个相关的实施例是CT812多肽的分离的片段，它⑴包含SEQ ID NO 8的序列；(2)在SEQ ID NO 8序列的N_和/或C-端具有至少一个侧翼氨基酸；(3) 长度小于770个氨基酸；(4)包含在SEQ ID NO : 8的序列中一个或多个，优选地1、2、 3、4、或5个保守的氨基酸取代；且(5)与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素 Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、 30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
一个优选的实施例是具有SEQ ID NO 8的序列的CT812多肽的分离的片段 与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群 干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、或500倍增加。
本发明进一步的实施例是具有SEQ ID NO 8的序列的CT812多肽的分离的片 段，该片段是在该多肽的N-和/或C-端去除1或2个氨基酸，与在相同的检测中无免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、 5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明另一个实施例是具有SEQ ID NO 8的序列的CT812多肽的分离的片段， 包含1个或多个，优选地1、2、3、4、或5个保守的氨基酸取代，与在相同的检测中无 免疫原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，它引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、 4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
本发明另一方面是一个分离的融合蛋白，包含(1)本发明任何一个上述CT144 多肽或片段的序列，和(2)融合伴侣。
本发明进一步提供一个融合蛋白，包含(1)本发明任何一个上述CT242多肽或 片段的序列，和O)融合伴侣。
本发明进一步的特征是一个分离的融合蛋白，具有(1)本发明任何一个上述 CT812多肽或片段的序列，和(2)融合伴侣。
本发明进一步提供包含任何一个上述本发明的多肽、片段、和融合蛋白以及药 学上可接受的载体的药物组合物。
本发明另外提供包含任何一个上述本发明的多肽、片段、和融合蛋白和药学上 可接受的载体的疫苗。另外，本发明提供包含编码任何一个上述本发明的多肽、片段、 和融合蛋白以及药学上可接受的载体的多核苷酸序列的DNA疫苗。
在所有上述方面的优选实施例中，本发明的多肽、多肽片段、融合蛋白、和疫 苗(例如蛋白和DNA疫苗)当给予哺乳动物时引发免疫应答。理想地，当给予人时，本 发明的多肽、多肽片段、融合蛋白和疫苗引发免疫应答。
本发明进一步提供一种通过给予对其有需要的受试者(例如具有或处于感染衣 原体的危险中的受试者)治疗有效量的任何一个上述本发明的多肽、片段、融合蛋白、 疫苗(例如，蛋白疫苗或DNA疫苗)以治疗或预防细菌感染，优选地衣原体感染的方 法。本方法的理想的实施例中，本发明的多肽、片段、融合蛋白、或疫苗(例如蛋白疫 苗或DNA疫苗)能够在受试者中产生免疫应答和/或在药学上可接受的载体中给予。
定义
"CT144多肽”是指与SEQ ID NO 1的氨基酸序列基本上相同的多肽。理想 地，CT144多肽与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少80%、85%, 90%, 95%, 99%, 或甚至100%序列相同。理想地，与在相同的检测中用无免疫原性肽(例如在相同的检测 中引发IFN-Y最低可测量值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，CT144多 肽引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
“CT144多肽片段”或“CT144片段”是指具有少于280个氨基酸的CT144多肽 的片段。理想地，与在相同的检测中用无免疫原性肽(例如在相同的检测中引发IFN-Y 最低可测量值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，CT144片段引发T淋巴 细胞群干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、200、或500倍增加。理想地，该片段具有少于270、260, 250、240, 230、220、 210、 200、 190、 180、 170、 160、 150、 140、 130、 120、 110、 100、 90、 80、 70、 60、 50、40、35、30、25、或20个氨基酸，且理想地，是免疫原性的。理想地，CT144片段包含SEQ ID NO: 2或3的序列，且具有少于280个氨基酸。优选的CT144片段长度是 7-279 个氨基酸(例如长度 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 50、100、或150个氨基酸)。CT144片段可以包含在SEQIDNO 2或3的序列中一个 或多个保守的氨基酸取代。另外的理想CT144片段包含SEQIDNO: 2或3的序列，或包 含在SEQ ID NO 2或3的序列中一个或多个保守的氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO 2或3的序列的N-和/或C-端具有至少一个侧翼氨基酸。另外地优选的CT144片段包 含SEQID NO 2或3序列的7个或更多连续的氨基酸。
“CT242多肽”是指与SEQ IDNO 4氨基酸序列基本上相同的多肽。理想地， CT242多肽与SEQ IDNO 4氨基酸序列具有至少80%、85%, 90%, 95%, 99%,或甚 至100%的序列相同。理想地，与在相同的检测中用无免疫原性肽(例如在相同的检测中 引发IFN-Y最低可测量值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，CT242多 肽引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
"CT242多肽片段”或“CT242片段”是指具有少于170个氨基酸的CT242多 肽片段。理想地，与在相同的检测中用无免疫原性肽(例如在相同的检测中引发IFN-Y 最低可测量值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，CT242片段引发T淋巴 细胞群干扰素 Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、200、或500倍增加。理想地，该片段长度小于160、150、140、130、120、110、 100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、或 10 个氨基酸，且理想地，是免疫 原性的。优选的CT242片段长度是7-169个氨基酸(例如长度7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、或 150 个氨基酸)。理想地，CT242 片段 包含SEQ ID NO: 5或6的序列，且具有少于170个氨基酸。CT242片段可以包含在SEQ ID NO 5或6的序列中一个或多个保守的氨基酸取代。另外地理想的CT242片段包含 SEQ IDNO 5或6的序列，或包含在SEQ IDNO 5或6的序列中一个或多个保守的氨 基酸取代，和/或在SEQ ID NO 5或6序列的N_和/或C-端上包含至少一个侧翼氨 基酸。另外地优选的CT242片段包含SEQ ID NO 5或6的序列的7个或更多的连续的 氨基酸。
"CT812多肽”是指与SEQ ID NO 7氨基酸序列基本上相同的多肽。理想地， CT812多肽与SEQ ID NO 7氨基酸序列具有至少80%、85%, 90%, 95%, 99%,或 甚至100%的相同。理想地，与在相同的检测中用无免疫原性肽(例如在相同的检测中 引发IFN-Y最低可测量值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，CT812多 肽引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至少3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、或 500 倍增加。
“CT812多肽片段”或“CT812片段”是指具有少于770个氨基酸的CT812 多肽片段。优选的CT812片段是长度7-769个氨基酸(例如长度为7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、或 150 个氨基酸)。理想地，与在相 同的检测中用无免疫原性肽处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平(例如在相同的检测中 引发IFN-Y最低可测量值的肽)相比，CT812片段引发T淋巴细胞群干扰素Y产生至 少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加。理想地，该片段少于760、750、740、730、,720、710、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、 80、 70、 60、50、40、30、25、20、15、或10个氨基酸，且理想地，是免疫原性的。理想地，CT812片 段包含SEQ ID NO 8的序列，且具有少于770个氨基酸。CT812片段可以包含在SEQ ID NO 8的序列中一个或多个保守的氨基酸取代。另外地理想的CT812片段包含SEQ ID NO 8的序列，或包含在SEQ ID NO 8的序列中一个或多个保守的氨基酸取代，和 /或在SEQ ID NO 8的序列的N-和/或C-端上包含至少一个侧翼氨基酸。另外地优 选的CT812片段包含SEQ ID NO 8序列的7个或更多的连续的氨基酸。
“基本上相同”是指与参照的氨基酸序列具有至少50%，理想地60%、70%, 75%,或80%，更理想地85%、90%,或95%、且最理想地99%氨基酸序列相同的多 肽。比较序列的长度一般至少10个氨基酸，理想地，至少15个连续氨基酸，更理想地 至少20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、或350个连续氨基酸，和最理想 地全长氨基酸序列。
用序列分析软件在默认设置下可以测量序列一致性(例如，kquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 UniversityAvenue, Madison, WI 53705)。该软件通过对各种取代、缺失、和其它修饰设定相似度以匹配相似的序列。
也可以用Clustal W(1.4)程序(由德国的欧洲分子生物实验室的Julie D.Thompson 和Toby Gibson以及英国剑桥大学的欧洲生物信息学院(European Bioinformatics Institute, Cambridge)的DesmondHiggins创建)比较多个序列，通过将配对比较模式设定为“慢”，该配对比较参数包括10.0的空格罚分(open gap penalty)和0.1的空格扩展罚分 (extend gap penalty),以及设定相似度矩阵为“模块替换矩阵(blosum) ”。另夕卜，多重 比较参数可以包括10.0的空格罚分，0.1的空格扩展罚分，和设定相似度矩阵为“模块替 换矩阵(blosum)”，延迟差异Oielaydivergent)达40%，且空格距离达到8。
如本文中使用的“保守的氨基酸取代”是指在氨基酸序列中将一个氨基酸置换 为与它们侧链的化学性质相关的氨基酸家族中的另一个氨基酸。基因编码的氨基酸可以 分为4个家族酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性 (丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和无电 荷极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨 酸、色氨酸、和酪氨酸有时归为芳香族氨基酸类。以类似的方式，氨基酸也可以分成如 下的组酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；脂肪族(甘氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸选择 性地分别归为脂肪族-羟基组中；芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；酰胺(天冬酰 胺、谷氨酰胺)；和含硫的(半胱氨酸、甲硫氨酸)。
氨基酸序列中的改变是否导致功能的相似性可以使用如本文中描述的检测方法 这样的标准方法通过评估改变的肽的以类似于野生型蛋白的方式发挥功能的能力而测定。例如沙眼衣原体特异性的CD4+或CD8+细胞可以用于测定特异性的沙眼衣原体多肽 或其片段是否免疫原性的。本发明理想的实施例包括在SEQ ID NO: 2、3、5、6、或8 的氨基酸序列中至少一个保守的氨基酸取代；且更理想地在SEQ ID NO: 2或3的序列中 有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个保守的氨基酸取代；且在SEQ ID NO 5、6、 或8的序列中有1、2、3、4、或5个保守的氨基酸取代。
“侧翼氨基酸”是指紧邻特别指定序列的N-或C-端的多肽序列中的氨基酸。 理想地，侧翼氨基酸存在于SEQ ID NO 2、3、5、6、或8的氨基酸序列的N_和/或 C-端。对于SEQ ID NO: 2或3的序列，侧翼氨基酸可以包含1个或多个在SEQ ID NO 1的序列中存在的天然相邻的氨基酸。对于SEQ ID NO: 5或6的序列，侧翼氨基 酸可以包含1个或多个在SEQ ID NO 4的序列中存在的天然相邻的氨基酸。对于SEQ ID NO 8的序列，侧翼氨基酸可以包含1个或多个在SEQ ID NO 7的序列中存在的天 然相邻的氨基酸。
本文中使用的“融合蛋白”是指一种多肽，该多肽包含(1)CT144多肽的片段、 CTM2多肽的片段、或CT812多肽的片段；和⑵融合伴侣。
本文中使用的“融合伴侣”是指可以与本发明的CT144多肽片段、CT242多 肽片段、或CT812多肽片段融合的异源序列。理想地，融合伴侣向CT144多肽片段、 CT242多肽片段、或CT812多肽片段提供了新的功能或活性。本文中描述了融合伴侣的 实例，且包含融合伴侣的实例包括检测标记、DNA结合域、基因活化域、稳定域、或有 助于该蛋白的生产或纯化的序列。
本文中使用的“免疫应答”是指应答于抗原或传染源，生物体的免疫系统的活 化。在脊椎动物中，这可以包括但不限于下述的一种或多种初始B细胞成熟成为记忆 B细胞、浆细胞(效应B细胞)产生抗体；细胞介导的免疫的诱导；CD4+T细胞的激活 和释放细胞因子；CD8+T细胞的激活和释放细胞因子；吞噬细胞(例如巨噬细胞、嗜中 性粒细胞、嗜酸粒细胞)的细胞因子聚集和激活；和/或补体的激活。
“免疫原性”是指能够在受试者中诱导免疫应答的任何物质。
“无抗原性”是指在实施例中在所述的T淋巴细胞检测中与其它测试的肽相比 引发干扰素Y产生最低水平的任何肽。无抗原性肽可以是人的肽或沙眼衣原体的肽。
“药学上可接受的盐”是指在制药工业中使用的任何无毒酸加成盐或金属复合 物。酸加成盐的实例包括例如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血 酸、琥珀酸、安息香酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三 氟乙酸等有机酸；例如鞣酸、羧甲基纤维素等聚合酸；和例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷 酸等无机酸。金属复合物包括锌、铁等等。
“药学上可接受的载体”是指用于溶解试剂和向受试者输送试剂的任何溶液。 理想的药学上可接受的载体是盐。在理想的实施例中，药学上可接受的载体包括佐剂。 示例的佐剂在本文中描述。其它生理上可接受的载体和它们的配方对于本领域技术人员 是已知的并例如在 Remington，s Pharmaceutical Sciences, (19th edition), ed.A.Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.中描述的。
“分离的”是指与天然伴随它的成分分离的蛋白(或其片段)。一般地，当至少 60%重量不包含与它天然相关的蛋白和天然出现的有机分子时该多肽基本上是分离的。该定义也扩展到与它的侧翼氨基酸(例如对于氨基酸序列，分离的是指不包含在多肽中 与该序列天然相关的侧翼氨基酸的序列)分离的多肽。优选地，该多肽至少75%，更优 选地至少90%，且最优选地至少99%重量是分离的。通过标准的技术例如通过从天然来 源提取(例如从用沙眼衣原体感染的细胞纯化)，通过编码CT144，CT242,或CT812多 肽片段的重组核酸的表达，或通过化学合成该多肽可以得到分离的多肽。用任何适宜的 方法例如通过柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析可以测定纯度。
“治疗有效量”是指在受试者中要求产生一种或多种如下效果的免疫原性的化 合物(例如多肽、片段、融合蛋白、或疫苗)的量免疫应答、衣原体感染程度降低(例 如，降低至少5%、10%, 20%或30%;更理想地40%、50%, 60%,或70%，且最理 想地80%或90%)；或对新的衣原体感染抵抗力增加(例如至少增加5%、10%, 20%, 30%, 40%,或50%;更理想地60%、70%, 80%,或90 % ；或最理想地100%、 200%,或 300% )。


图1是CT144多肽的完整氨基酸序列(SEQ ID NO 1) NP_219647)。
图1是CT242多肽的完整氨基酸序列6EQ ID NO 4) NP_219747)。
图3-1至图3-2是CT812多肽的完整氨基酸序列6EQ ID NO 号 NP_220332)。
具体实施方式
以前试图开发衣原体疫苗没有成功(Cotter etal.，Infect.Immun.63 4704-4714， 1995) (Paletal., Vaccine 17 459-465, 1999) (Pal etal., Infect.Immun.65 3361-3369, 1997) (Su et al., Vaccine 13 1023-1032, 1995) (Taylor et al.，Invest.Ophthalmol.Vis. Sci.29 1847-1853，1988) (Zhang et al.，J.Infect.Dis.176 1035-1040，1997)。亚基疫 苗有能够控制许多重要人类病原体的潜力，因此它对传统的疫苗接种策略具有很大的抵 抗。
沙眼衣原体是人病原体，尽管它对人类社会是很大的负担，对抗它的保护性疫 苗还没有开发出来。在美国它是性传播疾病的最常见的细菌原因。沙眼衣原体引起的女 性生殖道内的慢性炎症可以导致严重的病理例如盆腔炎和异位妊娠。沙眼衣原体也是世 界范围内可预防性失明的最常见的原因，估计目前有1-1.5百万人由该病导致失明。
用传统的疫苗学的方法不能产生抗沙眼衣原体病原体的成功疫苗，因为用杀死 的细菌免疫导致与疾病相关的病理学严重性的增加且控制该细菌的基因系统的缺失阻止 了减毒的沙眼衣原体毒株的开发。其中使用沙眼衣原体特异性蛋白引起免疫应答的亚基 疫苗具有克服这些障碍得到成功的疫苗的潜力，其是通过引发对保护性抗原的应答同时 避免与整个生物体免疫相关的病理应答。为了制备成功的沙眼衣原体亚基疫苗，必须识 别引起保护性免疫应答的沙眼衣原体蛋白质组中的蛋白。本文中我们报道了识别在沙眼 衣原体感染期间引起CD8+和CD4+T细胞应答的新的沙眼衣原体蛋白。(Genebank 编号 (Genebank 编号 7) (Genebank 编
利用沙眼衣原体特异性CD4+或CD8+T细胞，和沙眼衣原体血清变型(serovar) D 的基因组序列表达文库在检测中识别本发明的免疫原性的衣原体肽。该检测详细描述和 它的组成在下文中提供。
本发明的特征是CT144、CT242,和CT812多肽、多肽片段、和融合蛋白。本 发明进一步的特征是组合物、疫苗(例如DNA疫苗)、和包含CT144、CT242、或CT812 多肽、多肽片段、或融合蛋白(或编码本发明多肽，多肽片段，或融合蛋白的多核苷酸 序列)的试剂盒。
将侧翼氨基酸加入特异蛋白序列的氨基或羧基端的方法在本领域中是共知的。 加入的侧翼氨基酸可以是在天然出现的多肽的全长序列(例如对于CT144片段，邻近序 列在SEQ ID NO 1序列中；对于CT242片段，邻近序列在SEQ ID NO 4序列中；且 对于CT812片段，邻近序列在SEQ ID NO 7序列中)中存在的天然邻近(邻接)的序 列，或可以包含任何其它氨基酸序列。
另外，本发明也提供一种融合蛋白，包含⑴本发明的任何CT144、CT242、或 CT812多肽或多肽片段，和O)融合伴侣。融合伴侣是可以为本发明的片段提供另外的 功能或活性的异源蛋白序列。例如，融合伴侣可以被直接或间接检测(例如绿荧光蛋白 (GFP)、红血球凝聚素、或碱性磷酸酶)，提供DNA结合域(例如GAL4或LexA)，提供 基因活化域(例如GAL4或VP16)，稳定该多肽，或促进其生产或纯化(例如His6、myc 标签、链亲和素、^[INFEKL抗原决定簇6EQ IDNO 9)、或分泌信号)。
融合伴侣也可以包含提供免疫刺激物功能的序列，实例包括白细胞介素-2(Fan etal.，Acta Biochim.Biophys.Sin.38 683-690, 2006),免疫球蛋白(例如 IgG，IgM, IgE,或 IgA)，Toll 样受体-5 鞭毛蛋白(Huleatt et al.，Vaccine 8 763-775，2007)， 猿免疫缺陷病毒Tat (Chen etal.，Vaccine 24 708-715，2006)，或C族链球菌的纤维蛋 白原-白蛋白-IgG 受体 Mchulze et al.，Vaccine 23 1408-1413，2005)。另夕卜，可以 加入融合伴侣序列以增加溶解度或增加半衰期，例如亲水性氨基酸残基(Murby etal.， Eur.J.Biochem.230 38-44, 1995)，糖基化的序列 Sinclair and Elliott，J.Pharm.Sci.94 1626-1635, 2005)，或人绒毛膜促性腺激素或促血小板生成素的羧基末端(Lee et al.， Biochem.Biophys.Res.Comm.339 380-385，2006)。加入这些侧翼序列的方法在本领域 中是已知的并进一步在本文中描述。
另外，向多肽序列中引入保守的氨基酸取代的方法在本领域中也是已知的。 SEQ ID NO 2、3、5、6、和8的序列中的氨基酸可以用具有相似化学特征的其它氨基酸 取代。例如，一个保守的取代是用一个酸性氨基酸取代另一个(例如天冬氨酸取代谷氨 酸，或相反)。另一个实施例是用一个碱性氨基酸取代另一个(赖氨酸取代组氨酸，或相 反)。
从多肽序列的氨基和/或羧基末端除去氨基酸的方法在本领域中也是已知的。 理想地从SEQ ID NO: 2、3、5、6、或8的蛋白片段的氨基和/或羧基末端除去氨基酸。
用如以下实施例中所述的标准方法可以检测本文公开的特异性的多肽、多肽片 段、或融合蛋白的免疫原性。
CT144、CT242,和CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白的表达
通过在适宜的表达载体中用编码多肽片段或融合蛋白的多核苷酸分子转化适宜的宿主细胞，可以生产本发明的CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白。
在分子生物学领域中的技术人员会理解多种的任何表达系统可以用于提供本 文中公开的CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白。使用的确切的 宿主细胞对于本发明不是关键的。该CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段， 或融合蛋白可以在原核宿主(例如大肠杆菌)中或在真核宿主(例如啤酒酵母，昆虫 细胞例如Sf21细胞这样，或哺乳动物细胞例如NIH 3T3，HeLa或优选地COS细胞这 样)中生产。这样的细胞可以从广泛的来源得到(例如位于马纳萨斯的美国典型培养 物保藏中心(the AmericanType Culture Collection, Manassas, VA))。转化或转染的 方法和表达载体的选择将依赖于选择的宿主系统。例如在Kucherlapati et al. (CRC Crit. Rev.Biochem.16 349-379, 1982)中禾Π 在 DNA Transfer toCultured Cells (eds.，Ravid and Freshney, Wiley-Liss, 1998)中描述转化和转染的方法；且可以从例如Vectors Expression Systems Essential Techniques (ed.，Jones, Wiley & Sons Ltd.， 1998)中提供的 那些中选择表达载体。
—旦表达重组的多肽、多肽片段、或融合蛋白可以使用例如亲和层析来分离 它。在一个实施例中，针对CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白 产生的抗体可以连接到柱子上并用于分离重组的多肽、多肽片段、或融合蛋白。亲和层 析之前含有多肽、多肽片段、或融合蛋白的细胞的裂解和分离可以用标准方法完成(参 见例如 Methods in Enzymology， volume 182, eds.， Abelson, Simon, and Deutscher, Elsevier, 1990)。
一旦分离，如果需要，重组的CT144、CT242,和CT812多肽，多肽片段或融合 蛋白可以进一步纯化，例如通过高效液相色谱(参见例如Fisher，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology, eds., Work and Burdon, Elsevier, 1980 ；禾口 Scopes， ProteinPurification Principles and Practice, Third Edition, ed., Cantor, Springer,1994)。
也可以通过化学合成生产CT144、CT242,和CT812多肽，多肽片段，或融合 蛋白(例如，通过 Solid Phase Peptide Synthesis，2nded.，1984，The Pierce Chemical Co., Rockford, IL ；禾口 Solid-PhaseSynthesis A Practical Guide, ed., Kates and Albericio, Marcel DekkerInc., 2000 中所述方法)。
为了生产表达本文中所述多肽的稳定细胞系，PCR扩增的编码任何本发明的 CT144、CT242,或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白的核酸可以克隆进哺乳动物表达 载体的衍生物的限制性位点。例如，pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad, CA)的衍生物KA含 有编码流感病毒红血球凝聚素(HA)的DNA片段。可替代地，可以使用编码例如c-myc 或聚组氨酸标签这样的其它标签的载体衍生物。
疫苗的生产
本发明也提供包含本发明的CT144、CT242,或CT812多肽，多肽片段，或融合 蛋白的疫苗组合物。本发明也提供包含编码本发明的CT144、CT242,或CT812多肽， 多肽片段，或融合蛋白的多核苷酸序列的DNA疫苗。与在相同的检测中用无抗原性肽 (例如在相同的检测中引起IFN-Y最低可检测数值的肽)处理的T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，优选的用于疫苗组合物的多肽、多肽片段、或融合蛋白引起T淋巴细胞群 干扰素-Y 产生至少 3、4、5、6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、或500倍增加。同样地，用于DNA疫苗的优选的多核苷酸序列包含编码与在相同 的检测中用无抗原性肽(例如在相同的检测中引起IFN-Y最低可检测数值的肽)处理的 T淋巴细胞干扰素Y产生水平相比，引起T淋巴细胞群干扰素-Y产生至少3、4、5、 6、7、8、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、或 500 倍增加的本发明的 CT144、CTM2、或CT812多肽，多肽片段或融合蛋白的多核苷酸序列。本发明进一步 包括在受试者特别是人中诱导免疫应答的方法，该方法包括为了诱导免疫应答以预防或 保护受试者免受感染，理想地是细菌感染，且最理想地是沙眼衣原体感染的目的，在适 宜的载体中用本文公开的CT144、CT242,或CT812多肽，多肽片段或融合蛋白，或包含 编码本文公开的CT144、CT242,或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白的多核苷酸序列 的DNA疫苗接种受试者。免疫组合物(例如DNA疫苗)的给予可以在已经经历感染的 受试者中治疗性使用或为了预防感染预防性使用。另外，上述疫苗也可以给予受试者以 产生多克隆抗体(用标准方法从血清中纯化或分离)，它可以用于被动免疫受试者。这些 多克隆抗体也可以用作免疫化学试剂。
制备包含免疫原性多肽的疫苗对于本领域技术人员是已知的。本发明的 CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白可以当作抗原用于接种。为了 在受试者中诱导包括产生抗体，或特别地CD4+和/或CD8+T细胞应答的免疫应答，本 文中所述的以蛋白为基础的疫苗和编码本发明的多肽、多肽片段、或融合蛋白的DNA疫 苗可以给予受试者。
以蛋白为基础的疫苗通常在生理上可接受的稀释载体例如水、磷酸缓冲盐溶 液(PBS)、醋酸缓冲盐溶液(ABS)、Ringer' s溶液等等中从纯化的重组的本发明的 CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白制备从而形成含水组合物。稀 释载体也可以包括油质物质例如角鲨烷，或如下讨论的角鲨烯。
疫苗抗原通常与药学上可接受的载体结合，该载体包括不包含产生对接受载体 的受试者有害的抗体的任何载体。适宜的载体一般含有缓慢代谢的大量的大分子，例 如，蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂聚集体、和失活 的病毒颗粒。这样的载体对于本领域技术人员是熟知的。这些载体也可以作为佐剂起作用。
本发明的CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白可以与药学上 可接受的并与免疫原性的多肽、多肽片段、或融合蛋白相容的赋形剂混合。适宜的赋形 剂是例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等等及其组合。另外，如果需要，疫苗可以包含 少量的增强该组合物免疫原性效果的辅助物质例如润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。
有利地以蛋白为基础的疫苗也包含佐剂。本发明疫苗适宜的佐剂包括能够增强 B细胞和/或T细胞对本发明的免疫原性多肽或片段的应答(例如CD4+和/或CD8+T细 胞应答)的那些佐剂。本领域中佐剂是熟知的(参见，例如Vaccine Design-The Subunit andAdjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds.Powell and Newman, Plenum Press, New York and London)。
与本发明的免疫原使用的优选的佐剂包括铝或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。理想的佐剂是氢氧化铝胶体例如Alhydrogel 。对于氢氧化铝胶体(明矾)，免疫原 性多肽片段或融合蛋白与佐剂混合从而使每剂量含有50-800 μ g的铝，且优选地含有 400-600 μ g0
与本发明的免疫原性的多肽、多肽片段、或融合蛋白使用的另一种佐剂是乳 剂。乳剂可以是水包油乳剂或油包水乳剂。除了免疫原性多肽、多肽片段、或融合蛋 白，已知这样的乳液包含角鲨烯、角鲨烷等等的油相和分散剂。非离子型分散剂是优选 的且这样的物质包括山梨聚糖的单和二-C12-C24-脂肪酸酯和例如山梨聚糖单硬脂酸酯， 山梨聚糖单油酸酯和二缩甘露醇单油酸酯这样的二缩甘露醇。包含免疫原的乳液作为乳 液给予。
理想地，这样的乳液是包含角鲨烯和二缩甘露醇单油酸(AriaCelTMA)，可选择 地包含角鲨烷的油包水乳液，用免疫原性的多肽片段或融合蛋白在水相中乳化。这样的 乳化剂已知的实例包括 Montanide ISA-720 和 Montanide ISA-703 (Seppic, Castres, France),它们每一种被认为包含角鲨烯和角鲨烷，在每一种中角鲨烯占主导，但是在 Montanide ISA-703中含量较少。理想地，使用Montanide ISA-720，且使用油对水 7 3 (w/w)的比例。另外的优选的水包油乳液佐剂包括WO 95/17210和EP 0399842中 揭示的那些，通过引用结合于此。
本文中也考虑使用小分子的佐剂。本文中有用的一类小分子佐剂是美国专利 No: 4,539,205 ； 4,643,992 ； 5,011,828 ；和 5,093,318 中所述的 7-取代-8-氧代-或 8-硫 代-鸟苷衍生物；通过引用结合于此。这些物质中，7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾) 是特别优选的。洛索立宾显示在诱导免疫原特异性应答方面特别有效。
另外的有用的佐剂包括从Corixa Corp.可以得到的单磷酰脂A (MPL)(参见 美国专利 No.4,987,237)，从 Coley PharmaceuticalGroup 可以得到的 CPG，从 Aquila Biopharmaceuticals, Inc.可以得到的 QS21，从 SmithKline Beecham 可以得到的 SBAS2， 美国专利No.4,767,842中所谓的胞壁酰基二肽类似物(muramyl dipeptideanalogues)，和从 Chiron Corp.可以得到的MF59(参见美国专利NOS 5,709,879和6,086,901)。进一步的 佐剂包括从南美树QuillajaSaponariaMolina的树皮得到的活性的皂角苷组分(例如Quil A)。Quil A的衍生物，例如QS21(Quil A的HPLC纯化的组分衍生物)，且它的生产 的方法在美国专利No.5,057,M0中公开。除了 QMl (称作QA21)，也公开了例如QA17 这样的其它组分。
3-脱-氧-酰化的单磷酰脂A是共知的由Ribi Immunochem生产的佐剂。在 2%角鲨烯/吐温 80乳液中，该佐剂包含从细菌中提取的3个组分单磷酰脂(MPL) A，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)。通过GB 2122204B中教授的方 法可以制备该佐剂。一个优选的3-脱-氧-酰化的单磷酰脂A的形式是包含直径小于 0.2 μ m的小粒径乳液的形式(EP 0689454 Bi)。
胞壁二肽佐剂包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP ；美国 专利No.4,606,918)，N-乙酰-去甲-胞壁酰_L_丙氨酰_D_异谷氨酰胺(CGP 11637，称 作去甲-MDP)，和N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’， 2’ - 二棕榈酰in-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP) 1983A，称作MTP-PE。
理想的佐剂混合物包括3D-MPL和QS21 (EP0671948 Bi)，包含3D-MPL和QS21 (WO 95/17210, PCT/EP98/05714)水包油乳剂，与其它载体(EP 0689454 B1) —起 配制的3D-MPL，在包含胆固醇的脂质体中配制的QS21 (WO 96/33739)或免疫刺激物寡 核苷酸(WO 96/02555)的组合。可替代的佐剂包括WO 99/52549中所述的那些，和聚 氧乙烯醚的无微粒悬浮液(英国专利申请No.9807805.8)。以佐剂的量使用佐剂，佐剂的量可以根据佐剂，哺乳动物，和免疫原性的 CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白改变。一般的量每次免疫可以 在约1 P g_约lmg间变化。本领域技术人员知道适宜的浓度或量可以很容易地确定。本发明也提供了包含编码本发明的多肽、多肽片段、和融合蛋白的多核苷酸序 列的DNA疫苗。制备包含编码本发明的CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段， 或融合蛋白的多核苷酸序列的DNA疫苗的方法在本领域是已知的。例如编码本发明的 CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白的多核苷酸序列可以置于以病毒 为基础的载体中，它将编码CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，或融合蛋白的 多核苷酸序列(例如DNA或RNA)转移到细胞中，从而使编码的多肽、多肽片段、或融 合蛋白在细胞中表达。可以用于递送编码CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段， 或融合蛋白的多核苷酸序列的不同的以病毒为基础的载体包括腺病毒载体，腺相关病毒 衍生载体，逆转录病毒载体，以莫洛尼氏鼠白血病病毒为基础的载体，以脾坏死病毒为 基础的载体，以弗里德鼠白血病病毒为基础的载体，以慢病毒为基础的载体(Lois etal.， Science, 295 868-872，2002)，以乳多空病毒为基础的载体(例如SV40病毒载体)， 以疱疹病毒为基础的载体，包含或显示水疱性口炎病毒G-糖蛋白钉(spike)的病毒载 体，以塞姆利基森林病毒为基础的载体，以嗜肝DNA病毒为基础的载体，和以杆状病毒 为基础的载体。另外，示例的DNA疫苗载体(非限制性的)可以在“GeneTnmsferand Expression in Mammalian Cells, ” Savvas C.Makrides (Ed.)，Elsevier Science Ltd, 2003 中 发现。DNA疫苗可以与一种或多种可接受的稀释剂载体、药学上可接受的载体、佐剂、 赋形剂、润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂(本文中提供的实施例)和/或一种或多种核酸 递送试剂(例如聚合物，脂，肽基，可降解的颗粒，微乳液，VPLs，弱化的细菌或病毒 载体)组合使用任何给予途径或体外加载途径提供给受试者。一般地通过例如皮下或肌肉注射的方式，肠胃外地给予疫苗。一般地，疫苗 制备成液体溶液或悬浮液的可注射形式。适宜于注射的固体形式也可以制备成乳液， 或与免疫原性的多肽、多肽片段、或融合蛋白封装在脂质体中。适宜于其它给予方式 的另外的配方包括栓剂，且在一些情况下，是口服配方或通过鼻腔喷雾。对于栓剂， 典型的粘合剂和载体可以包括例如聚烷撑乙二醇或甘油三酸酯；这样的栓剂可以从包含 0.5%-10%,优选地1-2%范围的活性成分的混合物生成。口服配方包括这些正常使用的 赋形剂例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。疫苗组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配方或粉剂的形式且 包含产生免疫性有效量的所公开的CT144、CT242、和CT812多肽，多肽片段，融合蛋 白，或DNA疫苗。在典型的组合物中，产生免疫性有效量的免疫原性的多肽、多肽片 段、融合蛋白、或DNA疫苗是每剂量约lyg-10mg，且更理想地，每剂量约5iig-5mg。一般地疫苗被配制成用于肠道外给予。示例的免疫通过皮下(SC)，肌肉(IM)， 静脉(IV)，腹膜内(IP),或皮内(ID)实现。
本文中所述的免疫原性的CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片段，和融合 蛋白可以以中性或盐的形式配制导疫苗中。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽， 多肽片段，或融合蛋白的自由氨基基团形成)并与例如盐酸或磷酸这样的无机酸或例如 乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸等等这样的有机酸形成。与自由的羧基形成的盐也可以从 例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙，或氢氧化铁这样的无机碱和例如异丙 胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等等这样的有机碱衍生。以与剂量配方相容的方式，并以治疗有效的和产生免疫的剂量给予疫苗。给予 的量依赖于待治疗的受试者，受试者的免疫系统对接受免疫应答的能力，和需要保护的 程度(例如预防治疗或对带有衣原体的病人的治疗)。需要给予的CT144、CT242、和 CT812多肽，多肽片段，融合蛋白，或DNA疫苗精确的量依赖于操作人员的判断并对每 个受试者是不同的。然而，适宜的剂量范围是每个受试者几百微克活性成分的数量级。 初始给予和加强注射的适宜方案也是变化的，但典型地，最初给予后随后间隔地(数周 或数月)注射或另外给予。药物组合物除了疫苗，本发明也提供包含本发明的CT144、CT242、或CT812多肽，多肽片 段，或融合蛋白的药物组合物。这些组合物可以整合进药学上可接受的载体、介质、或 稀释剂中。在一个实施例中，该药物学组合物包括药学上可接受的赋形剂。如本领域共知 的根据本说明书所述本发明的化合物可以通过任何适宜的方法给予，例如依赖于它们的 目的用途。例如如果本发明的多肽、多肽片段、或融合蛋白将口服给予，它们可以是片 剂、胶囊、粒剂、粉剂或糖浆的形式。可替代地，本发明的配方可以例如注射(静脉、 肌肉、或皮下)，滴注制剂或栓剂这样的肠胃外给予。为了通过眼粘膜途径使用，本发明 的化合物可以制成滴眼剂或眼膏。基于配制的方便性、生物学相容性、和受试者容易地 给予该组合物的能力，一般优选水溶液用于眼部给药，例如通过在眼中慢慢灌入一或两 滴溶液的方法。然而，该组合物也可以是悬浮液、粘性或半粘性凝胶、或其它类型固体 或半固体组合物。用常规的方法可以制备上述配方，且如果需要该化合物可以与任何常规的添加 剂例如赋形剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，矫味剂，增溶剂，悬浮助剂，乳化剂，或涂 层剂混合。受试的化合物可以适宜于口服、鼻饲、局部给予(包括口腔和舌下)、直肠给 予、阴道给予、气雾剂给予和/或肠胃外给予。该或制剂可以合适地以单位剂量形式存 在且可以通过药剂学领域共知的任何方法制备。可以与载体物质结合产生单次量的试剂 的量根据待治疗的受试者和给药的特别的模式而变化。适宜于肠胃外给予的本发明的药物组合物包括与一种或多种药学上可接受无菌 等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液、或乳液，或即用前可以再制成可以包含抗氧 化剂、缓冲液、抑菌剂、使配方与目的受试者的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂的 无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末结合的一种或多种补充剂的组分。治疗细菌感染的方法本文中所述的多肽片段、融合蛋白、药物学组合物、和疫苗可以用于各种疾病的治疗包括受试者中细菌感染，最优选地沙眼衣原体感染。本领域技术人员会理解本发 明所述的任何组合物的剂量将根据例如受试者的症状、年龄、和体重，要治疗或预防的 感染的性质和严重程度，施药途径，和补充剂的形式改变。可以以任何适宜的剂量例如 以单剂量或分剂量给予任何受试的配方。本发明化合物，单独或与本发明任何其它化合 物一起，或与任何认为对待治疗的特定的感染有用的化合物联合使用的剂量可以通过本 领域技术人员已知的技术容易地测定。本发明也提供多于一种受试化合物的混合物，以 及其它治疗试剂。本发明的几种化合物，或可替代地其它治疗试剂的组合使用相对任何单独的成 分可以减少所需剂量，因为不同成分的作用的开始和持续时间可以互补。在这样的组合 治疗中，不同的活性试剂可以一起或分别给予，且在一天中可以同时地或在不同时间给予。用本发明可以治疗或预防的不同的细菌感染包括肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体 和沙眼衣原体。治疗抗体和T细胞去除可替代地，对衣原体的而不是感染本身的免疫应答是形成伴随感染的症状(包 括受试者中的不育和盆腔炎疾病)的原因。在这种情况下，在感染的受试者中限制CD4+ 或CD8+T细胞亚群的免疫应答可能是理想的。因此特异性识别靶向本发明的多肽，多肽 片段，或融合蛋白的T细胞克隆的抗体在治疗或预防与衣原体感染相关的不良后果方面 可能是有用的。T细胞的特异性群的选择性去除的方法如Weinberg et al. (Nature Med.2 183-189，1966)中所述。下面的实施例是用于说明本发明的，不应该理解为限制。实施例1测定沙眼衣原体多肽、多肽片段、或融合蛋白是否免疫原性的方法可以筛选包含编码沙眼衣原体多肽、多肽片段、或融合蛋白的多核苷酸的细胞 或病毒库以确定哪个由该多核苷酸编码的多肽、多肽片段、或融合蛋白是免疫原性的。 这通过将该库的每个成员与能够吞噬沙眼衣原体库的细胞的第二个细胞(例如巨噬细胞 或抗原呈递细胞)接触，并在第二个细胞的表面上展示该库表达多肽的部分来实现(参见 例如U.S.Patent 6,008,415)。然后，第二个细胞与之前用沙眼衣原体感染的生物体的沙眼 衣原体特异性T细胞(例如沙眼衣原体特异性CD4+或CD8+T细胞)接触。与沙眼衣原 体特异性T细胞接触前第二个细胞也可以固定(例如用多聚甲醛)。能够结合沙眼衣原 体蛋白呈递部分的沙眼衣原体特异性T细胞将导致细胞因子的分泌。用本领域已知的方 法例如使用ELISA检测方法可以检测细胞因子的分泌(例如IFN-Y、IL-2、或TNF的分 泌)。特别地，将鼠H2b骨髓来源的巨噬细胞(BMM)在96孔板中以IX 105细胞/孔 的密度接种。14-16小时后，解冻一份冰冻的沙眼衣原体库。从BMM吸走培养基并用 库中的一个等分试样和60 y L的新鲜RP-10培养基取代。在37°C 1小时后，用PBS冲洗 BMM，加入100iiLRP-10培养基，并在37°C下将细胞再孵育1小时。然后用多聚甲 醛固定BMM15分钟并用PBS充分清洗。发现BMM固定大大降低了 T细胞分泌的IFN-Y 的背景水平。在200 y L RP-10培养基中向每个孔加入T细胞(沙眼衣原体特异性CD4+或CD8+鼠T细胞；1X105)。在37°C下孵育孔板18-24小时并通过使用IFN-YELISA 检测方法(Endogen)测定每个孔的上清中IFN_ Y的量。识别抗原性肽的另一种方法是将多肽、多肽片段、或融合蛋白脉冲到巨噬细胞 上并筛选它们激活沙眼衣原体特异性CD4+或CD8+鼠T细胞的能力(如上所述)。在这 样的检测中使用的肽可以用本领域已知的方法合成。能够激活沙眼衣原体特异性CD4+或 CD8+鼠T细胞的多肽、多肽片段、或融合蛋白被认为是免疫原性的。沙眼衣原体特异性CD8+鼠T细胞使用本领域已知的方法可以得到用于识别免疫原性的沙眼衣原体多肽、多肽片 段、和融合蛋白的激活的CD8+鼠T细胞池。一般地，在筛选病源生物体的抗原时，从 之前用病源生物感染的哺乳动物制备CD8+T细胞。该制备包含对源于病源体的抗原特异 的CD8+T细胞。如下从小鼠收集沙眼衣原体特异性CD8+T细胞。C57BL/6小鼠腹膜内注射107 的产生感染单位的沙眼衣原体。14天后无痛处死小鼠并取脾。该脾通过70 y m的筛子 破碎产生脾细胞单细胞溶液。用连接到MACS 磁珠的抗CD8抗体和本领域标准的分离 方法从脾细胞分离CD8+T细胞(参见例如可以从MiltenyiBiotecInc.，Auburn, CA得到 MACS 技术)。分离的CD8+细胞加入到18小时之前在24孔板中用沙眼衣原体感染的 同样的单体型(H2b)的巨噬细胞上。加入辐照的天然小鼠(C57BL/6)的脾细胞作为含有 IL-2培养基中的饲养细胞。孵育细胞10天，期间用感染的巨噬细胞刺激沙眼衣原体特异 性CD8+T细胞并复制。在第10天，使用用沙眼衣原体感染的(18小时之前)巨噬细胞 和辐照的脾细胞再次刺激CD8+T细胞。重复该过程直到产生足够量的CD8+T细胞用于筛 选该库。CD8+T细胞也可以从人受试者克隆，如例如Hassell et al. (Immunology 79 513-519，1993)所描述的。沙眼衣原体特异性鼠CD4+T细胞用本领域已知的方法可以得到用于识别免疫原性的沙眼衣原体多肽、多肽片 段、和融合蛋白的激活的CD4+鼠T细胞。用沙眼衣原体血清变型L2感染后21天分离 小鼠脾细胞，并用辐照的(2,000rad)的骨髓来源的树突细胞、UV_失活的沙眼衣原体血 清变型L2、和天然同源脾细胞，在含有a-甲基甘露糖苷和5% ConA刺激的大鼠脾细 胞上清的RP-10 (RPMI培养基1640添加10%胎牛血清，L-谷氨酰胺，HEPES，50 u M 2_ 3 -巯基乙醇，50单位/ml青霉素，和50 u g/ml链霉素)中培养。通过使用Dynabeads Mouse CD8 (Invitrogen, Carlsbad, CA)从培养基去除CD8+T细胞。用沙眼衣原体脉冲的 骨髓来源的树突细胞每7天重复刺激CD4+T细胞。一旦沙眼衣原体特异性CD4+细胞系 建立起来，通过有限的稀释分离CD4+T细胞克隆。CD4+T细胞也可以从人受试者克隆，如例如Hassell et al. (Immunology 79 513-519，1993)中所述的。结果使用上述技术，CT144的氨基酸67-86 (SEQ ID NO 2)和氨基酸77_96 (SEQ ID NO 3)被认为是CD4+鼠T细胞抗原决定簇；且CT242的氨基酸109-117 (SEQ ID NO 5)和氨基酸 112-120 (SEQ IDNO 6)和 CT812 的氨基酸 103-111 (SEQ ID NO 8)被认为是CD8+鼠T细胞抗原决定簇(表1)，因为与在同样的检测中用无抗原性肽(例如，在 相同的检测中引起IFN-Y最低可检测值的肽)处理的T淋巴细胞相比，它们引起T淋巴 细胞IFN- Y产生至少40倍增加。其中本实施例中用小鼠T细胞识别的所述的CD4+和 CD8+抗原，考虑到这个发现并使用本文中描述的技术，本领域技术人员也可以识别相应 的CD4+和CD8+人T细胞抗原。表1产生的IFN-Y抗原肽ng倍’
权利要求
1.一种包含与SEQ ID NO : 1基本上相同的氨基酸序列的分离的CT144多肽，或其 片段，其中，与在相同的检测中无抗原性肽引发的干扰素Y产生水平相比，所述多肽或 片段引发的T-淋巴细胞群干扰素Y产生至少增加40倍。
2.根据权利要求1所述的多肽或片段，其中，当给予哺乳动物时，所述多肽或片段引 发免疫应答。
3.根据权利要求1所述的多肽或片段，其中，所述片段引发CD4+T-细胞应答。
4.根据权利要求1所述的片段，其中，所述片段包含SEQIDNO : 2或3的序列，和 至少一个侧翼氨基酸。
5.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段的长度小于200个氨基酸。
6.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段的长度小于150个氨基酸。
7.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段的长度小于100个氨基酸。
8.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段的长度小于50个氨基酸。
9.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段的长度小于30个氨基酸。
10.根据权利要求1所述的片段，其中，所述片段由SEQID NO: 2或3的序列组成。
11.根据权利要求10所述的片段，其中，所述片段在N-和/或C-端去除1、2、3、 4、5、或6个氨基酸。
12.根据权利要求4所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 2或3的序列中 的1个或多个保守的氨基酸取代。
13.根据权利要求12所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 2或3的序列 中的1个保守的氨基酸取代。
14.根据权利要求12所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 2或3的序列 中的2个保守的氨基酸取代。
15.根据权利要求12所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 2或3的序列 中的3个保守的氨基酸取代。
16.根据权利要求12所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 2或3的序列 中的4个保守的氨基酸取代。
17.根据权利要求10所述的片段，其中，所述片段包含1个或多个保守的氨基酸取代。
18.根据权利要求17所述的片段，其中，所述片段包含1个保守的氨基酸取代。
19.根据权利要求17所述的片段，其中，所述片段包含2个保守的氨基酸取代。
20.根据权利要求17所述的片段，其中，所述片段包含3个保守的氨基酸取代。
21.根据权利要求17所述的片段，其中，所述片段包含4个保守的氨基酸取代。
22.—种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求1所述的多肽或片段。
23.—种疫苗，包含a)权利要求1所述的多肽或片段，和b)药学上可接受的载体。
24.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗有 效量的权利要求1所述的多肽或片段。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多肽或片段在药学上可接受的载体中。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述多肽或片段在所述受试者中能够产生免疫应答。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣原 体的危险中。
29.—种分离的CT242多肽的片段，其中，所述片段包含SEQIDNO : 5或6的序列， 且长度小于170个氨基酸，并且其中，与在相同的检测中无抗原性肽引发的干扰素Y产 生水平相比，所述多肽或片段引发的T-淋巴细胞群干扰素Y产生至少增加40倍。
30.根据权利要求29所述的片段，其中，当给予哺乳动物时，所述片段引发免疫应答。
31.根据权利要求29所述的片段，其中，所述片段引发CD8+T-细胞应答。
32.根据权利要求29所述的片段，其中，所述片段包含SEQIDNO : 5或6的序列， 和至少一个侧翼氨基酸。
33.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段的长度小于150个氨基酸。
34.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段的长度小于100个氨基酸。
35.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段的长度小于50个氨基酸。
36.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段的长度小于30个氨基酸。
37.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段的长度小于15个氨基酸。
38.根据权利要求29所述的片段，其中，所述片段由SEQID NO: 5或6的序列组成。
39.根据权利要求38所述的片段，其中，所述片段在N-和/或C-端去除1或2个氨基酸。
40.根据权利要求32所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 5或6的序列 中的1个或多个保守的氨基酸取代。
41.根据权利要求40所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 5或6的序列 中的1个保守的氨基酸取代。
42.根据权利要求40所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 5或6的序列 中的2个保守的氨基酸取代。
43.根据权利要求40所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 5或6的序列 中的3个保守的氨基酸取代。
44.根据权利要求38所述的片段，其中，所述片段包含1个或多个保守的氨基酸取代。
45.根据权利要求44所述的片段，其中，所述片段包含1个保守的氨基酸取代。
46.根据权利要求44所述的片段，其中，所述片段包含2个保守的氨基酸取代。
47.根据权利要求44所述的片段，其中，所述片段包含3个保守的氨基酸取代。
48.一种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求29所述的片段。
49.一种疫苗，包含a)权利要求29所述的片段，和b)药学上可接受的载体。
50.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗有 效量的权利要求29所述的片段。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述片段在药学上可接受的载体中。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述片段在所述受试者中能够产生免疫应答。
53.根据权利要求50所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣原 体的危险中。
55.—种分离的CT812多肽的片段，其中，所述片段包含SEQIDNO : 8的序列，且 长度小于770个氨基酸，并且其中，与在相同的检测中无抗原性肽引发的干扰素Y产生 水平相比，所述多肽或片段引发的T-淋巴细胞群干扰素Y产生至少增加40倍。
56.根据权利要求55所述的片段，其中，当给予哺乳动物时，所述片段引发免疫应答。
57.根据权利要求55所述的片段，其中，所述片段引发CD8+T-细胞应答。
58.根据权利要求55所述的片段，其中，所述片段包含SEQIDNO : 8的序列，和至少一个侧翼氨基酸。
59.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于600个氨基酸。
60.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于400个氨基酸。
61.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于200个氨基酸。
62.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于100个氨基酸。
63.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于50个氨基酸。
64.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于30个氨基酸。
65.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段的长度小于15个氨基酸。
66.根据权利要求55所述的片段，其中，所述片段由SEQIDNO: 8的序列组成。
67.根据权利要求66所述的片段，其中，所述片段在N-和/或C-端去除1个或2个 氨基酸。
68.根据权利要求58所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 8的序列中的 1个或多个保守的氨基酸取代。
69.根据权利要求68所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 8的序列中的 1个保守的氨基酸取代。
70.根据权利要求68所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 8的序列中的 2个保守的氨基酸取代。
71.根据权利要求68所述的片段，其中，所述片段包含在SEQIDNO : 8的序列中的 3个保守的氨基酸取代。
72.根据权利要求66所述的片段，其中，所述片段包含1个或多个保守的氨基酸取代。
73.根据权利要求72所述的片段，其中，所述片段包含1个保守的氨基酸取代。
74.根据权利要求72所述的片段，其中，所述片段包含2个保守的氨基酸取代。
75.根据权利要求72所述的片段，其中，所述片段包含3个保守的氨基酸取代。
76.—种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求55所述的片段。
77.—种疫苗，包含a)权利要求55所述的片段，和b)药学上可接受的载体。
78.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗有 效量的权利要求55所述的片段。
79.根据权利要求78所述的方法，其中，所述片段在药学上可接受的载体中。
80.根据权利要求78所述的方法，其中，所述片段在所述受试者中能够产生免疫应答。
81.根据权利要求78所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
82.根据权利要求81所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣原 体的危险中。
83.—种分离的融合蛋白，包含a)权利要求1所述的多肽或片段；和b)融合伴侣。
84.根据权利要求83所述的融合蛋白，其中，所述片段包含SEQIDNO: 2或3的序 列，和至少一个侧翼氨基酸。
85.根据权利要求83所述的融合蛋白，其中，所述片段由SEQIDNO: 2或3的序列 组成。
86.—种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求83所述的融合蛋白。
87.—种疫苗，包含a)权利要求83所述的融合蛋白，和b)药学上可接受的载体。
88.—种分离的融合蛋白，包含a)权利要求29所述的片段，和b)融合伴侣。
89.根据权利要求88所述的融合蛋白，其中，所述片段包含SEQIDNO: 5或6的序 列，和至少一个侧翼氨基酸。
90.根据权利要求88所述的融合蛋白，其中，所述片段由SEQIDNO : 5或6的序列 组成。
91.一种药物组合物，包含权利要求88所述的融合蛋白和药学上可接受的载体。
92.—种疫苗，包含a)权利要求88所述的融合蛋白，和b)药学上可接受的载体。
93.—种分离的融合蛋白，包含a)权利要求55所述的片段；和b)融合伴侣。
94.根据权利要求93所述的融合蛋白，其中，所述片段包含SEQIDNO: 8的序列，和至少一个侧翼氨基酸。
95.根据权利要求93所述的融合蛋白，其中，所述片段由SEQIDNO : 8的序列组成。
96.—种药物组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求93所述的融合蛋白。
97.—种疫苗，包含a)权利要求93所述的融合蛋白，和b)药学上可接受的载体。
98.一种DNA疫苗，包含编码权利要求1所述的多肽或片段的多核苷酸序列。
99.一种DNA疫苗，包含编码权利要求83所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
100.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗 有效量的权利要求98或99所述的DNA疫苗。
101.根据权利要求100所述的方法，其中，所述DNA疫苗在药学上可接受的载体中。
102.根据权利要求100所述的方法，其中，所述DNA疫苗在所述受试者中能够产生免疫应答。
103.根据权利要求100所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
104.根据权利要求103所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣 原体的危险中。
105.一种DNA疫苗，包含编码权利要求29所述的片段的多核苷酸序列。
106.一种DNA疫苗，包含编码权利要求88所述融合蛋白的多核苷酸序列。
107.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗 有效量的权利要求105或106所述的DNA疫苗。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述DNA疫苗在药学上可接受的载体中。
109.根据权利要求107所述的方法，其中，所述DNA疫苗在所述受试者中能够产生免疫应答。
110.根据权利要求107所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
111.根据权利要求110所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣 原体的危险中。
112.—种DNA疫苗，包含编码权利要求55所述片段的多核苷酸序列。
113.—种DNA疫苗，包含编码权利要求93所述的融合蛋白的多核苷酸序列。
114.一种治疗或预防细菌感染的方法，所述方法包括给予对其有需要的受试者治疗 有效量的权利要求112或113所述的DNA疫苗。
115.根据权利要求114所述的方法，其中，所述DNA疫苗在药学上可接受的载体中。
116.根据权利要求114所述的方法，其中，所述DNA疫苗能够在所述受试者中产生免疫应答。
117.根据权利要求114所述的方法，其中，所述细菌感染是衣原体感染。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述受试者已经感染衣原体或处于感染衣原体的危险中。
全文摘要
本发明提供了衣原体抗原(例如多肽、多肽片段和融合蛋白)。也提供了用于治疗或预防受试者中细菌感染例如衣原体疾病的疫苗和药物组合物。
文档编号C07K14/00GK102027003SQ200880110106
公开日2011年4月20日 申请日期2008年8月1日 优先权日2007年8月3日
发明者托德·吉拉恩, 纳迪亚·R·罗恩, 达雷恩·E·希金斯, 迈克尔·N·斯塔恩巴赫 申请人:哈佛大学校长及研究员协会