一种联合检测乙型肝炎病毒前s1抗原和核心抗原的方法及诊断试剂盒的制作方法

专利名称：一种联合检测乙型肝炎病毒前s1抗原和核心抗原的方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒检测领域，更具体地涉及通过对乙型肝炎病毒相关的前S1抗原(HBV PreS1)与核心抗原(HBcAg)联合检测，诊断乙肝病毒感染的方法。本发明同时公开了乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原联合检测试剂盒(特别是酶联免疫法与化学发光法)。本发明还涉及前S1抗原的检测方法、病毒裂解方法以及相关的试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染是全世界最重要的公共卫生问题之一。
目前，HBV血清标志物(常规如HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb，HBcAb即俗称“两对半”检测)广泛作为现症HBV感染和既往HBV感染的常规检测标准。但是，高的变异率再加上HBV携带者的庞大基数导致常规的“两对半”检测的假阴性高发。并且，普通“两对半”检测无法从量上反映病毒复制性和传染性大小，常出现可怀疑难解释的结果，也无法从“两对半”指标直接确定检测个体并未感染HBV。
HBV DNA是HBV复制的直接指标，其斑点杂交检测(或PCR检测)是乙型肝炎患者和HBV携带者感染与传染性判断的金标准。PCR检测与斑点杂交检测均可作为HBV感染和传染性的直接指标，但是不适合大规模普查或常规使用。
在所有可能与HBV DNA高度相关的血清标志抗原(HBV PreS1、HBcAg、HBxAg、DNAP、HBV PreS2等)中HBcAg一直被认为是与HBVDNA直接相关的抗原，检测在HBcAg在复制型病毒定量和HBsAg阴性的HBV感染者与HB患者中特有诊断意义。但是鉴于检测HBcAg的种种困难，当前的已开发或已报道的HBcAg免疫学诊断试剂通常采取检测前对样品进行前处理(裂解病毒、破膜并灭活HBcAb)或采用迂回检测HBcAg-HBcAb免疫复合物的方式进行，前者操作复杂程序繁琐，不易被临床客户接受，亦不适合用于大规模献血员筛查及流行病学调查。后者则因为检测方式的特殊性，难以达到理想的特异性和灵敏度。而HBV PreS1与HBV DNA也有很好的相关性(D.Buffello，2000，96％；Kuijpers，1989，88％；Theilman，1986)。对与HBV PreS1抗原的诊断方法，当前的已开发或已报道的PreS1免疫学诊断试剂考虑到PreS1相对HBsAg绝对浓度低的多，常规双PreS1抗体夹心法较难达到理想的灵敏度，常采用检测整个LHBs(即通过LHBs上的HBsAg介导检测，用针对HBsAg的特异性抗体作为捕获抗体或报告抗体，再用针对PreS1的特异性抗体与之配对)，这种检测模式有效地放大了PreS1的检测灵敏度，但是将PreS1的检测完全依赖于HBsAg，不形成一个独立的检测系统，可能出现因为HBsAg突变而造成PreS1假阴性出现，不能准确反应突变病毒或不同亚型病毒感染的PreS1动态。
开发一种简单、准确而又高灵敏度的HBV现症感染的直接ELISA诊断试剂在HBV感染流行病控制，HB患者抗病毒疗效及病程预后方面都具有迫切的现实意义。
因此，本领域仍然缺乏有效检测乙肝病毒的方法。
发明概述本发明一个目的是希望建立简单、有效、无须样品前处理过程的HBcAg检测方法和高灵敏度的双Pres1抗体夹心法检测PreS1的方法，并通过联合检测HBcAg与PreS1模式弥补可能因单一HBcAg或PreS1突变或漏检造成假阴性的缺点，构建一种与HBV DNA高度相关的联合(HBcAg和PreS1)检测模式，并将这种模式应用于酶联免疫法，化学发光，时间分辨，胶体金法、酶联免疫渗滤法等定性或定量的免疫学诊断。
本发明涉及一种通过联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原建立的与核酸检测方法高度相关的免疫学诊断方法。
本发明涉及了联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的试剂盒及其制备方法。
具体地，本发明涉及了联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的酶联免疫试剂盒和化学发光试剂盒及其制备方法。
本发明的联合检测模式不仅有效的体现了联合检测两种抗原的互补优势，且联合检测结果形成的新指标——“核酸相关抗原”体现出与乙型肝炎病毒核酸指标高度的相关性。
此外，本发明首次公布了一种高灵敏度双前S1抗体夹心检测前S1抗原的方法，该方法不同于已公布的其他检测前S1抗原的方法。
在上述方法一个特别优选的实施方案中，本发明首次使用了一系列含不同剂量不同种类的表面活性剂的缓冲溶液用于裂解病毒，大大提高前S1抗原与核心抗原联合指标和前S1抗原单独指标的检测灵敏度。


图1显示了preS1区21-47AA片段三重串联的重组质粒pT-2147*3的构建过程。
图2显示表达和纯化的重组蛋白GST-2147*6的SDS-PAGE电泳结果。结果显示纯化后目的蛋白的纯度超过85％。泳道1蛋白marker；泳道2表达的pGEx-2147*6；泳道3纯化后的pGEX-2147*6。
图3显示化学发光检测与荧光定量PCR相关性。如实施例14所述，对各标本的病毒含量及发光强度分别取对数后进行线性相关性分析。
发明详述除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
本发明涉及一种通过联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原建立的与核酸检测方法高度相关的免疫学诊断方法。在本发明的一个具体实施方案中，通过单独检测前S1、核心抗原与联合检测前S1抗原/核心抗原(酶联免疫法)的比较，联合检测前S1抗原/核心抗原比单独检测前S1与核心抗原具有明显的优势。
本发明的又一实施方案中，将联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原(酶联免疫法)与常规乙型肝炎两对半检测进行比较，本检测方法对部分含有病毒的标本可以准确定性，而两对半检测对此类标本未能准确定性。
本发明的又一实施方案中，将此联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的检测方法应用于化学发光诊断中，联合检测乙肝病毒的前S1抗原/核心抗原的检测定量结果与病毒含量有较好的线性相关性。
本发明的又一实施方案中，本发明检测方法采用酶联免疫方法来实现。相应地，本发明提供了相关的酶联免疫试剂盒的制备方法和由此制备得到的试剂盒。
本发明的又一实施方案中，本发明检测方法采用化学发光方法来实现。相应地，本发明提供了相关的化学发光试剂盒的制备方法和由此制备得到的试剂盒。
下面对上述方面和其它方面进行更加详细的说明。
联合检测乙肝病毒的前S1抗原和核心抗原(简称联合检测)在一方面，本发明涉及一种在样品中检测乙型肝炎病毒或者检测乙型肝炎病毒感染的方法，包括联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原。
在此，为了本发明的目的，“联合检测”包括对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测分开进行或者合并进行，以及同时进行和以任何顺序先后进行，只要对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测两者的信号处理联合进行即可。
联合进行信号处理是指，在判断样品为乙型肝炎病毒或者乙型肝炎病毒感染阳性还是阴性时，将前S1抗原检测得到的信号和核心抗原检测得到的信号合并成为单一的一个指标来判断。例如，可将两个抗原检测得到的信号简单相加，与预定的值相比较来判断。或者，可以将两个抗原检测得到的信号通过适当处理或者运算(例如对其中一个信号进行加权或者两个都进行加权)，合并成新的单一指标，与预定的值相比较来判断。这样可以提高灵敏度和检出率等。这可能是由于避免例如由于单个抗原甲阴性等原因造成的漏检。但是本发明并不受这样的机理的限制。
因此，在信号处理之前的阶段，对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测可以是相互独立的，也就是说，它们可以发生在相同的或者不同的时间、相同的或者不同的试验中。例如，对前S1抗原的检测和对核心抗原的检测可以用相同的方法来进行，也可以用不同的方法来进行；例如一种抗原的检测采用如下方法中的一种来进行，而另一抗原的检测采用不同(或者相同)的方法来进行酶联免疫吸附法、免疫渗滤法、免疫层析法、化学发光法、时间分辨法。优选两种抗原采用相同的方法来进行检测。
例如，对前S1抗原的检测可以发生在核心抗原检测之前、之后、或者同时。
当两种抗原采用相同的方法来进行检测时，可以在相同或者不同的试验批次中、相同或者不同的反应容器(如反应孔)中、相同或者不同的固相载体上来进行。二者可以采用相同或者不同的信号产生体。
在一个优选实施方案中，同时、合并检测两种抗原。例如，在相同反应容器(如反应孔)中同时进行两种抗原的检测。这可以通过例如如下方法来实施在同一载体上固定捕获两种抗原的捕获抗体，利用同一病毒裂解物，在同一介质中同时进行两种抗原的捕获，非必需地在同一介质中同时进行第二抗体的结合和检测。或者，也可以通过例如如下方法来实施在不同载体上固定捕获两种抗原的捕获抗体，然后将两种载体混和，利用同一病毒裂解物，在同一介质中同时进行两种抗原的捕获，非必需地在同一介质中同时进行第二抗体的结合和检测。
在本发明所述方法的一个优选实施方案中，所述样品为来自待检个体的分离的生物学样品，优选所述样品为血清。
在另一个实施方案中，所述方法用于判断血清中乙型肝炎病毒核酸的存在与否。
在另一个实施方案中，所述乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的联合检测通过从如下方法中选择的一种或者几种方法来实现酶联免疫吸附法、免疫渗滤法、免疫层析法、化学发光法、时间分辨法；优选酶联免疫吸附法或化学发光法。
在另一个实施方案中，在相同反应容器(如反应孔)中在相同反应中同时检测前S1抗原与核心抗原。
在另一个实施方案中，采用双抗体夹心法检测前S1抗原与核心抗原。
在另一个优选的实施方案中，不需要对样品例如血清进行预处理。例如，不需要预先将病毒变性。
在一个具体实施方案中，乙型肝炎病毒的裂解和前S1抗原与核心抗原的捕获在相同反应容器(例如反应孔)中在相同介质中同时进行。在该实施方案中，优选地，使用本发明用于联合检测的裂解液作为所述介质。
在本发明所述的方法的一个具体实施方案中，本发明联合检测方法包括以下步骤a)提供可与乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV PreS1)特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体，以及可与乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)特异结合的第一抗HBc抗体和第二抗HBc抗体；b)将第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体(两者统称第一抗体)作为捕获抗体结合到相同固相载体上，形成第一抗体-载体结合物；优选地，所述载体为ELISA板；c)使待测样品与第一抗体-载体结合物接触，使得样品中的乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原，如果存在的话，被捕获，形成抗原-第一抗体-载体结合物；所述样品可以是经过预处理的或者没有经过预处理的；优选地，所述样品没有经过预先病毒裂解处理，待测样品与第一抗体-载体结合物接触在允许病毒裂解和抗原捕获的条件下进行；更优选待测样品与第一抗体-载体结合物接触在本发明所述的用于联合检测的裂解液中进行；d)使第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体(两者统称第二抗体)与步骤c)的产物(载体)接触，该接触在允许第二抗体与被捕获的抗原结合的条件下进行；e)检测被结合的第二抗体的量。
步骤c)所述的抗原-第一抗体-载体结合物包括乙型肝炎病毒前S1抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物和核心抗原-第一抗HBc抗体-载体结合物。
在步骤d)中，如果存在乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原的话，将形成第二抗体-抗原-第一抗体-载体结合物，包括第二抗HBV PreS1抗体-乙型肝炎病毒前S1抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物，和第二抗HBc抗体-核心抗原-第一抗HBc抗体-载体结合物第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，优选是不同的单克隆抗体。第一抗HBc抗体和第二抗HBc抗体可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，优选是不同的单克隆抗体。
步骤e)检测被结合的第二抗体的量可以通过例如如下方法来进行提供能与所述第二抗HBV PreS1抗体有效结合的第一信号产生体和能与所述第二抗HBc抗体有效结合的第二信号产生体，第一和第二信号产生体所产生的信号强度分别仅与第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体的量有关；将第一和第二信号产生体与第二抗体接触；检测由信号产生体产生的信号。第一信号产生体和第二信号产生体可以相同或者不同。在一个优选实施方案中，第一信号产生体和第二信号产生体相同，或者第一信号产生体和第二信号产生体产生的信号相同，可以用相同的方法检测；更优选地，检测第一和第二信号产生体产生的信号的总和作为判断结果的指标。
步骤e)检测被结合的第二抗体的量还可以通过例如如下方法来进行第二抗体直接标记有信号产生体，检测由信号产生体产生的信号。第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体可以标记相同的信号产生体，或者不同的信号产生体。在一个优选实施方案中，第二抗HBVPreS1抗体和第二抗HBc抗体标记的信号产生体相同，或者它们产生的信号相同，可以用相同的方法检测；更优选地，检测第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体标记的信号产生体产生的信号的总和作为判断结果的指标。
本发明的方法中，信号产生体可以任何能够被通过适当方法检测的物质，例如可以是酶、荧光素、化学发光物质、同位素、稀土元素。
在一个优选的实施方案中，使用抗乙型肝炎病毒前S1抗原和抗核心抗原的单克隆抗体进行免疫检测。
在一个优选的实施方案中，抗乙型肝炎病毒前S1抗原的单克隆抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5；优选地，使用7H11单抗作为第一抗HBV PreS1抗体而使用4D11-HRP作为第二抗HBVPreS1抗体配对检测HBV PreS1。
在一个优选的实施方案中，所述方法还包括步骤在待测样品与第一抗体-载体结合物接触之前，使用裂解液裂解样品中的病毒，其中所述裂解液优选是本发明用于联合检测的病毒裂解液。
在另一个实施方案中，在各个步骤之间(例如在步骤b)和c)、和/或c)和d)、和/或d)和e)之间)还可以含有洗涤、干燥等步骤。
本发明还涉及可用于联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原的病毒裂解液，其含有表面活性剂和适当的缓冲剂，所述表面活性剂选自Chaps，sulfobetain 8-18(SB8、SB10、SB12、SB14、SB16、SB18)，布里杰35，Tween系列和/或HP-β-CD，优选选自SB14、SB16、SB18、HP-β-CD、TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60、TWEEN80。
在上述病毒裂解液中，优选地，表面活性剂可以是以上表面活性剂中的一种或多种(2、3、4、5种)的组合，例如HP、TWEEN系列和SB系列中一种或者两种或者三种的组合。例如HP+TWEEN系列、TWEEN系列+SB系列、HP+SB系列或者HP+TWEEN系列+SB系列，优选HP+TWEEN40、HP+TWEEN40+SB14、HP+TWEEN40+SB16、HP+TWEEN40+SB18、HP+TWEEN40+SB18、HP+TWEEN20+SB14、HP+TWEEN60+SB14、HP+TWEEN80+SB14。优选地，表面活性剂可以是HP0.5％-4％；Tween系列0.1％-6％；SB14％1％-10％；SB160.5％-1％；SB180.5％-1％；更优选HP1％-2％；Tween系列0.5％-2％；SB142％-8％；SB161％；SB181％；如1％-2％HP+0.5％-1％Tween+1％-2％SB14。
优选地，表面活性剂选自表4所示lysis1-lysis24，更优选lysis1、lysis10、lysis11、lysis12、lysis13、lysis14、lysis15、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、lysis22、lysis23、和lysis24，更优选lysis10、lysis13、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、和lysis24，最优选lysis10、13、16、18中所述的表面活性剂。
优选地，缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液。缓冲剂可以是上述缓冲液中的一种或者几种(2、3、4、5种)的组合。缓冲剂优选柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液。缓冲剂的pH范围和浓度范围可以是磷酸盐缓冲液10-50mM pH值6.0-7.0优选20mM pH值7.4；柠檬酸盐缓冲液10-50mM pH值3.0-6.6优选10mM pH值6.6；Tris缓冲液10-50mM pH值7.0-9.0优选20mM pH值7.0；醋酸盐缓冲液10-50mM pH值3.8-6.0优选10mM pH值6.0。
非必需地，裂解液还可以含有一种或者多种(如1、2、3、4、5、6-10种)其它成分，例如还原剂(例如DTT、DTE、β-巯基乙醇)、螯合剂(例如EDTA)、渗透压调节物(例如盐，如NaCl；蔗糖)。例如裂解液还可以含有如下成分中的一种或者几种的组合β-巯基乙醇0.01％-1％优选0.1％-0.5％，更优选0.4％；DTT1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；DTE1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；EDTA5mM-20mM优选5mM；NaCl50mM-300mM更优选50-150mM，更优选100mM；蔗糖2％-20％优选5％-10％更优选10％。
优选地，裂解液选自表4所示的lysis1-lysis24，更优选地，裂解液选自lysis1、lysis10、lysis11、lysis12、lysis13、lysis14、lysis15、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、lysis22、lysis23、和lysis24，更优选lysis10、lysis13、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、和lysis24，最优选地，裂解液选自lysis10——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB14、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；lysis13——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB16、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；lysis16——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB18、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；和lysis18——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％HP、0.5％Tw40、0.4％Me、10％蔗糖。
本发明用于联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原的病毒裂解液还可以用于单独检测核心抗原，或者单独检测前S1抗原。因此，本发明还提供了用于检测核心抗原的上述病毒裂解液。本发明还提供了用于检测前S1抗原的上述病毒裂解液。本发明还提供了上述裂解液在检测核心抗原中的用途，以及上述裂解液在检测前S1抗原中的用途。
已经报道过的裂解液只在检测核心抗原时候使用，而且一般使用NP40用于破病毒包膜，但这些已知的裂解液不适合用于前S1抗原与核心抗原的联合检测，如CN1352392A。
本发明病毒裂解液的一个重要优点是，可以用作捕获病毒抗原的介质。本发明病毒裂解液具有充分裂解病毒但又足够温和以致不实质性地失活载体上包被的抗体的特点。本发明病毒裂解液的使用使得可以在裂解病毒的同时进行有效的抗原捕获。但是，本发明并不被该作用机理所限制。
因此，在一个特别优选的实施方案中，采用本发明的用于联合检测的病毒裂解液，在同一反应介质中同时进行病毒的裂解和抗原(前S1抗原与核心抗原)的捕获，而不需要在抗原捕获前预先将病毒裂解。这也是本发明的一个重要优点。
本发明还涉及一种用于联合检测的试剂盒，其包括用于根据本发明上述联合检测方法联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的试剂。
在一个具体实施方案中，本发明所述联合检测试剂盒中含有抗HBVPreS1抗体(优选包含两种不同的抗HBV PreS1抗体，特别是单克隆抗体)和抗HBc抗体(优选包含两种不同的抗HBc抗体，特别是单克隆抗体)，和/或本发明用于联合检测的病毒裂解液。
优选地，所述抗体中至少一种抗HBV PreS1抗体和至少一种抗HBc抗体是被信号产生体标记的，或者能与信号产生体有效结合。抗HBVPreS1抗体和抗HBc抗体标记的信号产生体或者结合的信号产生体可以相同或者不同，优选可以采用相同的检测方法检测。所述抗体优选是单克隆抗体。优选地抗HBV PreS1抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5，特别是7H11与4D11。
所述试剂盒中优选还含有适于检测所述抗原抗体反应的试剂(例如检测第二抗体的检测试剂)。
在一个优选实施方案中，本发明所述联合检测试剂盒中包含(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体；和/或(2)本发明用于联合检测的病毒裂解液；和(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBVPreS1抗体和第二抗HBc抗体；和(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了本发明联合检测的方法)。
在一个优选实施方案中，本发明所述试剂盒中固相载体是多孔反应板(例如ELISA板)，在多孔反应板的相同或者不同孔中固定有第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体。
本发明还涉及固相载体，其上固定有抗HBV PreS1抗体和抗HBc抗体。优选固相载体是多孔反应板(例如酶标板、化学发光板)，在多孔反应板的相同或者不同孔中固定有抗HBV PreS1抗体和抗HBc抗体。所述抗体优选是单克隆抗体，特别是本发明公开的具体抗体。
本发明还涉及联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的试剂在制备用于检查乙型肝炎病毒感染的试剂盒中的用途。优选地，所述试剂是本发明所描述的联合检测用试剂。本发明所描述的联合检测用试剂的例子有，抗HBV PreS1抗体(优选包含两种不同的抗HBV PreS1抗体，特别是单克隆抗体)和抗HBc抗体(优选包含两种不同的抗HBc抗体，特别是单克隆抗体)，和/或本发明用于联合检测的病毒裂解液。特别是，(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体；和/或(2)本发明用于联合检测的病毒裂解液；和(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体；和(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了本发明联合检测的方法)。
双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前S1抗原在另一方面，本发明涉及采用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法，其特征在于所用的两种抗体(捕获抗体和报告抗体)都是与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的抗HBV PreS1抗体。
在本发明方法中的一个优选实施方案中，不需要对样品进行预处理。
在另一个优选实施方案中，乙型肝炎病毒的裂解和前S1抗原的捕获在相同反应容器(例如反应孔)中在相同介质中同时进行。
在另一个优选实施方案中，使用本发明中所述用于检测前S1抗原的裂解液作为所述介质。
在一个具体实施方案中，本发明的方法包括a)提供可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(两种抗体可以相同或者不同，优选是不同的，特别是单克隆抗体)；
b)将第一抗HBV PreS1抗体作为捕获抗体结合到固相载体上，形成第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物；优选地，所述载体为ELISA板；c)使待测样品与第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物接触，使得样品中的乙型肝炎病毒前S1抗原，如果存在的话，被捕获，形成抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物；d)使第二抗HBV PreS1抗体与步骤c)的产物接触，该接触在允许第二抗HBV PreS1抗体与被捕获的抗原结合形成第二抗HBV PreS1抗体-抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物的条件下进行；e)检测被结合的第二抗HBV PreS1抗体的量。
在一个优选实施方案中，步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行提供能与所述第二抗HBV PreS1抗体有效结合的信号产生体，该信号产生体所产生的信号强度仅与第二抗HBV PreS1抗体的量有关；将信号产生体与第二抗体接触；检测由信号产生体产生的信号。
在另一个优选实施方案中，步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行第二抗体直接标记有信号产生体，检测由信号产生体产生的信号。
优选地，信号产生体是酶、荧光素、化学发光物质、同位素、稀土元素。
在一个实施方案中，所述乙型肝炎病毒前S1抗原的检测通过从如下方法中选择的一种或者几种方法来实现酶联免疫吸附法、免疫渗滤法、免疫层析法、化学发光法、时间分辨法；优选酶联免疫吸附法或化学发光法。
在另一个实施方案中，在本发明各个步骤之间(例如在步骤b)和c)、和/或c)和d)、和/或d)和e)之间)还可以含有洗涤、和/或干燥等步骤。
本发明还涉及可用于检测前S1抗原的病毒裂解液，其含有表面活性剂和适当的缓冲剂，所述表面活性剂选自Chaps，sulfobetain8-18，布里杰35，TritonX100，Tween系列和/或HP-β-CD，优选选自SB8、SB12、SB14、SB16、SB18、HP-β-CD、TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60、TWEEN80、BRJ35，更优选SB12、SB14、SB16、SB18、TWEEN80。
优选地，表面活性剂可以是以上表面活性剂中的一种或多种(2、3、4、5种)的组合，优选SB16+SB14、SB18+SB14。优选地，表面活性剂的浓度范围可以是SB14％1％-10％；SB160.5％-1％；SB180.5％-1％；更优选SB142％-8％；SB161％；SB181％；如1％SB14+0.5％SB16或1％SB14+0.5％SB18。
优选地，表面活性剂选自表2所示的A-P裂解液，更优选C-M裂解液和P裂解液，更优选E、F、G、H、J裂解液，最优选G裂解液、H裂解液，或者表6所示的ε裂解液、ζ裂解液、η裂解液、θ裂解液中所述的表面活性剂。
优选地，缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液。缓冲剂可以是上述缓冲液中的一种或者几种(2、3、4、5种)的组合。缓冲剂优选柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液。缓冲剂的pH范围和浓度范围可以是，磷酸盐缓冲液10-50mM pH值6.0-7.0优选20mM pH值7.4；柠檬酸盐缓冲液10-50mM pH值3.0-6.6优选10mM pH值6.6；Tris缓冲液10-50mM pH值7.0-9.0优选20mM pH值7.0；醋酸盐缓冲液10-50mM pH值3.8-6.0优选10mM pH值6.0。
非必需地，裂解液还可以含有一种或者多种(如1、2、3、4、5、6-10种)其它成分，例如还原剂(例如DTT、DTE、β-巯基乙醇)、螯合剂(例如EDTA)、渗透压调节物(例如盐，如NaCl；蔗糖)。例如裂解液还可以含有从如下组中选自的一种或者几种成分β-巯基乙醇0.01％-1％优选0.1％-0.5％，更优选0.2％；DTT1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；DTE1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；EDTA5mM-20mM优选5mM。
优选地，裂解液选自表2所示的A-P裂解液，更优选C-M裂解液和P裂解液，更优选E、F、G、H、J裂解液，最优选G裂解液、H裂解液；或者选自表6所示的ε裂解液、ζ裂解液、η裂解液、θ裂解液。
本发明还涉及用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂盒，其包括用于根据本发明所述的方法检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂。
在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒包含可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(两种抗体可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体)和/或本发明用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液。所述试剂盒中优选还含有适于检测所述抗原抗体反应的试剂(例如检测第二抗体的检测试剂)。优选地所述抗体中至少一种抗HBV PreS1抗体是被信号产生体标记的，或者能与信号产生体有效结合。所述抗体优选是单克隆抗体。优选地抗HBV PreS1抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5，特别是7H11与4D11。
在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体；和/或(2)本发明用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液；和(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBV PreS1抗体；和(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法)。
优选地，固相载体是多孔反应板(例如酶标板、化学发光板)，在多孔反应板的孔中固定有抗HBV PreS1抗体。
检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂在制备用于检查乙型肝炎病毒感染的试剂盒中的用途；优选地，所述试剂是本发明所描述的检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂。例如，所述试剂包括可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(两种抗体可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体)和/或本发明用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液，非必需的适于检测所述抗原抗体反应的试剂(例如检测第二抗体的检测试剂)；特别是(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体；和/或(2)本发明用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液；和(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBVPreS1抗体；和(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法)。
本发明还涉及裂解病毒的方法，包括在不实质上变性蛋白质(例如不实质上灭活抗体，例如前S1抗原或者核心抗原抗体)的温和条件下裂解病毒，优选采用本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液或者本发明联合检测的裂解液裂解病毒；所述病毒优选是乙型肝炎病毒。“实质上”是指至少70％、例如至少80％、至少90％、至少95％的事物发生。例如，“不实质上变性蛋白质”或者“不实质上灭活抗体”是指至少70％、例如至少80％、优选至少90％、或者至少95％的蛋白质或者抗体不被变性或者灭活。
本发明还涉及一种温和的病毒裂解液，其能够不实质上变性蛋白质(例如不实质上灭活抗体，例如前S1抗原或者核心抗原抗体)，并且裂解病毒。
本发明还涉及检测乙型肝炎病毒前S1抗原和/或核心抗原的方法，包括在不实质上变性蛋白质(例如不实质上灭活抗体，例如前S1抗原或者核心抗原抗体)的温和条件下裂解病毒，优选采用本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液或者本发明联合检测的裂解液裂解病毒；检测乙型肝炎病毒前S1抗原和/或核心抗原。可以采用已知的方法或者本发明公开的方法检测检测乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原。
特别是，本发明涉及一种检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法，包括在不实质上灭活抗前S1抗原抗体的温和条件下裂解病毒，优选采用本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液或者本发明联合检测的裂解液裂解病毒；检测乙型肝炎病毒前S1抗原。本发明还涉及检测乙型肝炎病毒核心抗原的方法，包括在不实质上灭活抗核心抗原抗体的温和条件下裂解病毒，优选采用本发明联合检测的裂解液或者实施例中检测核心抗原所用的裂解液裂解病毒；检测乙型肝炎病毒核心抗原。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种裂解样品中的病毒的方法，包括采用本发明的病毒裂解液裂解病毒。相应地，本发明还提供一种检测核心抗原的方法，该方法包括采用上述裂解液裂解样品中的病毒。然后可以采用已知的方法或者本发明公开的方法检测核心抗原。本发明还提供一种检测前S1抗原的方法，该方法包括采用上述裂解液裂解样品中的病毒。然后可以采用已知的方法或者本发明公开的方法检测前S1抗原。所述病毒优选是乙肝病毒。
在另一个具体实施方案中，本发明涉及裂解病毒的方法，包括采用本发明检测乙型肝炎病毒前S1抗原的裂解液裂解病毒；所述病毒优选是乙型肝炎病毒。本发明还提供一种检测前S1抗原的方法，该方法包括采用上述裂解液裂解样品中的病毒。然后可以采用已知的方法或者本发明公开的方法检测前S1抗原。
下面结合具体实施例与所附图表，对本发明进一步加以描述。所述实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂、试剂的浓度、温度和其他变量的值以及载体和宿主的选择只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。
实施例一.本发明涉及的HBV PreS1单克隆抗体的制备实施例1用作抗原的GST-2147*6抗原制备模板制备利用蛋白酶K-酚氯仿法，从内部保存的慢性乙肝患者血清标本(编号263)中提取HBV DNA。设计多条引物，PCR分段分离HBV基因，并克隆至pMD18-T载体(Takara NO.CK2401)进行测序。拼装出的全长HBV序列的GenBank登录号为AF233236，该HBV株基因组全长3068bp，为adw2亚型。其中克隆质粒pT-PreS包含全长的PreS1和PreS2基因。序列如下atgggaggttggtcttccaaacctcgacaaggcatggggacaaatctttctgttcccaatcctctgggattctttcccgatcaccagttggaccctgcgttcggagccaactcaaacaatccagattgggacttcaaccccaacaaggatcactggccagaggcaaatcaggtaggagcgggagcattcgggccagggttcaccccaccacacggcggtcttttggggtggagccctcaggctcagggcatattgacaacagtgccagcagcacctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaagacagcctactcccatctctccacctctaagagacagtcatcctcaggcc(PreS1)；atgcagtggaactccacaacattccaccaagctctgctagatcccagagtgaggggcctatattttcctgctggtggctccagttccggaacagtaaaccctgttccgactactgcctcacccatatcgtcaatcttctcgaggactggggaccctgcaccgaac(PreS2)。
质粒构建设计上游引物2147F1(ATG AGA TCT CCT CTG GGA TTC TTT CC)，下游引物2147R1(TTA GGA TCC ACC TCC ACC CGG ATT AAA GTC CCAATC TGG ATT GTT)以克隆质粒pT-PreS为模版，以PCR方法调出其中preS1区中的21-47AA段的基因序列，反向插入pMD-18T的质粒pT-2147*1作为出发质粒，首先得到21-47片段二重串联的质粒pT-2147*2。用类似的方法，在pT-2147*1和pT-2147*2的基础上，构建到21-47片段三重串联的重组质粒pT-2147*3(详细质粒构建过程参见图1)。接着pT-2147*3为出发质粒，获得PreS1(21-47)六重串联的重组质粒pT-2147*6。
将以上六重串联的重组质粒pT-2147*6用Bgl II、EcoR I双酶切处理，胶回收试剂盒(上海华瞬生物工程有限公司NO.W5212)回收目的片段2147*6。BamH I、EcoR I双酶切处理表达质粒pGEX-20T，乙醇沉淀法回收载体。用DNA连接酶将目的片段和pGEX-20T连接，经酶切鉴定后，得到GST-2147*6重组表达质粒。
多肽GST-2147*6的表达及纯化将构建的GST-2147*6重组质粒转化到表达菌株E.coli ER2566中进行表达。SDS-PAGE电泳分析表达结果。GST-2147*6以可溶形式存在。
用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析法对可溶性重组蛋白GST-2147*6进行纯化。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白的纯度超过85％。(见图2)实施例2杂交瘤细胞系3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2、16F5的产生小鼠免疫及脾细胞与杂交瘤的融合取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的5μg GST-2147*6重组抗原(总体积50μl)。15天后进行二次基础免疫，方法为取相同量的抗原用福氏不完全佐剂乳化，肌肉注射。30天后，尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原，并于加强免疫后72小时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于RPMI 1640培养基中)，细胞计数板细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，混合后离心，利用聚乙二醇(PEG1500)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。将细胞悬液与等体积的饲养细胞(Balb/c小鼠巨噬细胞及胸腺细胞)混合后，分置于96孔细胞培养板中(200μl/孔)于5％二氧化碳培养箱(ESPEC BNA-311)37℃培养。3天后，用HT培养基(黄嘌呤(hypoxanthn，H)1.361mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培养基至100mL。45～50℃条件下溶解后，过滤除菌。)半保留换液。7天后，用HBV PreS1 21-47合成肽包被板，利用如下述酶联免疫吸附法(ELISA)检测96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液。对于ELISA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。
ELISA检测法1.包被抗原HBV PreS1 21-47合成肽。
序列为PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP
2.包被缓冲液pH 9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液(20.02gNa2CO3，2.52g NaHCO3加去离子水至1升)。
3.包被液配制将HBV PreS1 21-47多肽溶解于包被缓冲液中，浓度为1μg/ml，4.包被在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，37℃包被2小时，然后转入2～8℃16小时。
5.封闭用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；甩去封闭液。干燥后装入铝箔袋2～8℃保存。
6.检测在样品孔中加入100μl细胞培养液上清，每块酶标板设1孔阳性对照(小鼠抗GST-2147*6多抗血清(如实施例2获得)，1∶100稀释使用)，另设1孔阴性对照(新鲜细胞培养液)，37℃温浴30分钟；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗5遍，拍干后加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)1∶1000稀释的辣根过氧化酶标记羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃温浴30分钟；用PBST(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤液洗5遍，拍干后加入A、B显色液(北京万泰生物药业有限公司提供)各50μl，37℃显色10分钟；加入50μl终止液(2M H2SO4)终止反应，并于酶标仪(TECAN公司，Sunrise)上检测各孔的A450值，通常以A450值高于阴性对照2倍以上者视为阳性。
单克隆抗体的获得及纯化1.单克隆抗体腹水获得取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射石蜡油，每只0.5ml。2～7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的培养基(1640HT)，调节细胞密度至2×105～2×106个/ml，每只小鼠注射0.5ml。7～10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm离心15分钟，吸取中间澄清部分的液体，0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。
2.单克隆抗体获得将处理好的腹水用0.02mol/L、pH 7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO4，19ml 0.2mol/L NaH2PO4，20ml 3mol/L NaCl，加水至100ml)对倍稀释，搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵(浓度达到50％饱和度)，2～8℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵，使硫酸铵浓度达到33％饱和度，2～8℃静置过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清。搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵，(浓度达到50％饱和度)，2～8℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析带中，放入50～100倍含pH7.4的0.02M PB缓冲液中2～8℃搅拌下脱盐12小时左右，期间更换3次以上透析液。此时单抗纯度可达80％左右。
3.单克隆抗体纯化将透析完成后的单抗用DE52柱(Whatman NO.4057050)在FPLC下纯化，收集穿透峰。此时单抗纯度可达90％以上。将纯化好的单抗于-20℃保存。
以上述方法筛选出了7株分泌抗HBV PreS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5)(未保藏)二.本发明涉及的HBV PreS1单克隆抗体初步鉴定实施例3筛选高亲和力HBV PreS1包被单抗与酶标单抗HBV PreS1酶标单抗制备采用改良过碘酸钠法。以标记20mg 3H5单抗为例准确称取HRP40mg，加入0.2M pH5.6醋酸盐缓冲液2ml，溶解后加入0.06M NaIO4溶液2ml，室温反应20分钟；加入0.16M乙二醇-10％NaCl溶液2ml，室温反应20分钟，将酶液装入透析袋中，对0.001M pH4.0醋酸盐缓冲液透析过夜；加入2M pH9.6碳酸盐缓冲溶液0.8ml，加入3H5单抗20mg，4℃搅拌反应2小时；加入新配制的NaBH4溶液(5mg/ml)0.4ml，4℃搅拌反应2小时；滴加饱和(NH4)2SO4溶液9.2ml，；4℃搅拌反应30分钟，4℃3500转离心20分钟；弃上清，将沉淀溶于2ml 0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液中，用0.02M pH7.4的磷酸盐缓冲液透析24小时，加2ml甘油，混匀后-20℃保存。
以上述方法分别对3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5单抗进行HRP标记。
酶标板制备1.包被液配制将HBV PreS1单克隆抗体用pH7.4的20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，终浓度为20mM，pH值为7.4)稀释，终浓度为5μg/ml。
2.包被在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时。
3.封闭用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；甩去封闭液。干燥后装入铝箔袋2～8℃保存。
以上述方法分别对3H5、7H11、2A7、6F1、13G2和16F5单抗进行包被。
实验方法1.标本HBV病毒阳性(PCR检测)临床血清标本，HBV病毒阴性临床血清标本。
2.加样
取已包被的酶标板一块，每孔加入50μl裂解液(含有1％TritonX100的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，终浓度为20mM，pH值为7.4)，每孔加入50μl对应标本，震荡混匀后，置于37℃温箱反应1小时。
3.加酶将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)1∶1000稀释的酶标记单抗(采用NaIO4氧化标记法对相应单克隆抗体进行HRP标记)，置于37℃温箱反应30分钟。
4.显色将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入A、B显色剂各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。
5.终止、读值在反应完的酶标板中每孔加入终止液(2M H2SO4)50μl，并于酶标仪上检测各孔的A450/630值。
以上述方法正交检测各包被单抗与酶标单抗配对，求P/N(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)值。见表1表1各单抗与酶标单抗P/N比统计

6.结果分析
通过上表可见，7H11单抗包被与4D11-HRP配对检测HBV PreS1为最佳配对。
三.本发明涉及的反应系统建立实施例4高灵敏度双前S1抗体夹心检测前S1抗原系统的建立酶标板制备1.包被液配制将HBV PreS1单克隆抗体7H11用pH7.4的20mMPB缓冲液稀释，终浓度为5μg/ml。
2.包被在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时。
3.封闭用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；甩去封闭液。干燥后装入铝箔袋2～8℃保存。
4.含不同表面活性剂的裂解液的配制表2A-P不同组分的裂解液的配制A裂解液2％Chaps+5mM EDTA+20mM PB7.4B裂解液2％Chaps+5mM EDTA+20mM PB7.4+0.2％MeC裂解液2％HP+0.2％Me+20mM PB7.4D裂解液2％SB8+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4E裂解液2％SB12+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4F裂解液2％SB14+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4G裂解液1％SB16+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4+0.5％SB14H裂解液1％SB18+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4+0.5％SB14I裂解液2％SB14+5mMEDTA+20mM PB7.4J裂解液2％Tw80+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4
K裂解液2％Tw60+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4L裂解液2％Tw40+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4M裂解液2％Tw20+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4N裂解液2％TX100+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4O裂解液2％BRJ35+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4P裂解液1％BRJ35+0.2％Me+5mM EDTA+20mM PB7.4注HPHP-β-CD，羟丙基倍他环糊精(Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin)；SB8sulfobetain8，3-(Octodecyldimethylammonic)propanesulfonate；SB10sulfobetain10，3-(Decyldimethylammonic)propanesulfonate；SB12sulfobetain12，3-(N，N-Dimethyldodecylammonio)-propanesulfonate；SB14sulfobetain14，3-(N，N-Dimethylmyristylammonio)-propanesulfonate；SB16sulfobetain16，3-(N，N-Dimethylpalmitylammonio)-propanesulfonate；SB18sulfobetain18，3-(N，N-Dimethylstearylammonio)-propanesulfonateChaps3-(3-(cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonateMeβ-巯基乙醇；Tw80Tween-80；Tw40Tween-40；Tw20Tween-20；TX100TritonX100；BRJ35布里杰35(聚环氧乙烯月桂酸酰醚35)；20mM PB7.4Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，终浓度为20mM，pH值为7.4实验方法1.标本HBV病毒阳性(PCR检测)临床血清标本，正常人血清标本。
2.加样取已包被的酶标板，每孔加入50μl不同配方裂解液，每孔加入50μl对应标本(不裂解对照为仅加50μl对应标本而不加任何裂解液。)震荡混匀后，置于37℃温箱反应1小时。
3.加酶将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)1∶1000稀释的4D11酶标记单抗，置于37℃温箱反应30分钟。
4.显色将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入A、B显色剂各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。
5.终止、读值在反应完的酶标板中每孔加入终止液(2M H2SO4)50μl，并于酶标仪上检测各孔的A450/630值。
6.阳性标本检测滴度的计算阳性标本检测滴度是指将阳性标本逐倍稀释直至不能被检出为阳性(阳性的判断以同一种裂解条件对应的阴性样本A450/630×2.1为Cutoff，大于或等于Cutoff判定为检出阳性，反之判定为检出阴性)，标本能被检出阳性的最大稀释倍数即为阳性标本的检测滴度。
实验结果
表3 A-P不同裂解液检测数据统计

在实验结果中可以看出，使用一系列含不同剂量不同种类的表面活性剂的缓冲溶液可以有效地裂解病毒，提高双前S1抗体检测前S1抗原的检测灵敏度，有效的成分包括Chaps，sulfobetain8-18，布里杰35，Tween系列，HP-β-CD，TritonX100等。
实施例5前S1抗原与核心抗原联合检测裂解系统的建立不同联合检测配方的裂解液的配制按表4配制24种不同组分的裂解液表4不同裂解液配方

酶标板制备1.包被液配制将7H11单克隆抗体、抗HBc单克隆抗体G8(厦门波生生物技术公司NO.050824)用pH7.4的20mMPB缓冲液稀释，终浓度分别为5μg/ml和4μg/ml。
2.包被在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时。
3.封闭用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；甩去封闭液。干燥后装入铝箔袋2～8℃保存。
实验方法7.标本HBV病毒阳性(PCR检测)临床血清标本，HBV病毒阴性临床血清标本。
8.加样取已包被的酶标板一块，每孔加入50μl不同配方裂解液，每孔加入50μl对应标本(每种裂解条件均检测相同的4份阳性血清和4份阴性血清)，震荡混匀后，置于37℃温箱反应1小时。
9.加酶将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)1∶1000稀释的4D11酶(HRP)标记单抗和酶(HRP)标抗HBc单抗CZ(厦门波生生物技术公司、NO.04042901)，置于37℃温箱反应30分钟。
10.显色将反应后的酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入A、B显色剂各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。
11.终止、读值在反应完的酶标板中每孔加入终止液(2M H2SO4)50μl，并于酶标仪上检测各孔的A450/630值。
以上述方法检测24种不同配方的裂解液，求P/N(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)值。见表5表5 12种裂解液检测数据统计

12.结果分析通过上表可见，lysis10，lysis13，lysis16，lysis18为最佳裂解液配方。
实施例6在传统的乙型肝炎病毒前S1抗原检测中加入裂解系统的作用分析传统的乙型肝炎病毒前S1抗原检测模式一般也是采用双抗体夹心法ELISA检测，但是使用anti-HBsAg(信号标记的anti-HBsAg)作为捕获抗体(报告抗体)而配对以信号标记的anti-PreS1(anti-PreS1)作为对应的报告抗体(捕获抗体)，借助HBsAg在乙型肝炎病毒颗粒上的高丰度来提高前S1抗原的检测灵敏度。
酶标板制备1.包被液配制将HBV PreS1单克隆抗体4D11用pH7.4的20mMPB缓冲液稀释，终浓度为5μg/ml；将购买的anti-HBsAg(厦门波生生物技术公司)用pH 7.4的20mMPB缓冲液稀释，终浓度为3μg/ml。
2.包被在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，2～8℃包被16～24小时；4D11单抗包被的酶标板标记为A板，anti-HBsAg单抗包被的酶标板标记为B板。
3.封闭包被完的A板和B板用PBST洗涤液(含0.1％Tween20的PBS溶液)洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；甩去封闭液。干燥后装入铝箔袋2～8℃保存。
4.含不同表面活性剂的裂解液的配制表6α-o不同组分的裂解液的配制α裂解液为2％Chaps+5mMEDTA+20mMPB7.4β裂解液为2％HP+20mMPB7.4γ裂解液为2％SB8+5mMEDTA+20mMPB7.4δ裂解液为2％SB12+5mMEDTA+20mMPB7.4ε裂解液为2％SB14+5mMEDTA+20mMPB7.4
ζ裂解液为1％SB16+5mMEDTA+20mMPB7.4+0.5％SB14η裂解液为1％SB18+5mMEDTA+20mMPB7.4+0.5％SB14θ裂解液为2％SB14+5mMEDTA+20mMPB7.4ι裂解液为2％Tw80+5mMEDTA+20mMPB7.4κ裂解液为2％Tw60+5mMEDTA+20mMPB7.4λ裂解液为2％Tw40+5mMEDTA+20mMPB7.4μ裂解液为2％Tw20+5mMEDTA+20mMPB7.4ν裂解液为2％TX100+5mMEDTA+20mMPB7.4ξ裂解液为2％BRJ35+5mMEDTA+20mMPB7.4o裂解液为1％BRJ35+5mMEDTA+20mMPB7.4注所用药品化学名见实施例4及实施例5实验方法5.标本HBV病毒阳性(PCR检测)临床血清标本，正常人血清标本。
6.加样取已包被的A板和B板，每孔加入50μl不同配方裂解液，每孔加入50μl对应标本(不裂解对照为仅加50μl对应标本而不加任何裂解液。)震荡混匀后，置于37℃温箱反应1小时。
7.加酶将反应后的A板和B板用PBST洗液洗涤5遍，A板每孔加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mMNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)HRP标记的anti-HBsAg(1∶10000)；B板每孔加入100μl用酶稀释液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)HRP标记的4D11(1∶1000)置于37℃温箱反应30分钟。
8.显色将反应后的A板和B板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入A、B显色剂各50μl，置于37℃温箱反应15分钟。
9.终止、读值在反应完的A板和B板中每孔加入终止液50μl，并于酶标仪上检测各孔的A450/630值。
10.阳性标本检测滴度的计算阳性标本检测滴度是指将阳性标本逐倍稀释直至不能被检出为阳性(阳性的判断以同一种裂解条件对应的阴性样本A450/630×2.1为Cutoff，大于或等于Cutoff判定为检出阳性，反之判定为检出阴性)，标本能被检出阳性的最大稀释倍数即为阳性标本的检测滴度。
实验结果表7α-o不同组分的裂解液检测数据统计

结果分析通过以上实验结果知ε裂解液、ζ裂解液、η裂解液、θ裂解液对传统的乙型肝炎病毒前S1抗原检测系统灵敏度提高有很大帮助四.本发明相关的诊断试剂盒实施例7用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV PreS1)的诊断试剂盒制备及其检测方法(酶联免疫法)。
试剂盒制备本发明包含的HBV PreS1单克隆抗体7H11、4D11(也可以使用其它抗前S1抗原抗体)的乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒的组成和制备如下1.酶标板制备如实施例3制备适合浓度的包被液，并包被于酶标板。
2.样品裂解液如实施例4中的F或G或H裂解液3.酶标试剂配制将HRP标记4D11配制成适合浓度(1∶1000)的酶标试剂，稀释液为含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液。
4.阴、阳性对照、显色剂A、B液、20×浓缩洗涤液、终止液(2MH2SO4)北京万泰生物药业有限公司提供。
试剂盒检测方法用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原(HBV PreS1)的诊断试剂盒的检测方法如下1.准备将试剂放置于室温(18～30℃)下平衡15～30分钟。
2.配液将50ml浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
3.编号将样品对应微孔按顺序编号。
4.裂解用移液器在对应孔加入50μl样品裂解液(如实施例4中F或G或H裂解液体)。
5.加样分别在相应孔中加入待测样品50μl，震荡混匀。
6.温育用封板膜封板后置37±1℃温育60分钟。
7.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液(1x)洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
8.加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
9.温育用封板膜封板后置37±1℃温育30分钟。
10.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液(1x)洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
11.显色每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置37±1℃避光显色15分钟。
12.终止每孔各加入终止液(2M H2SO4)50μl，轻轻震荡混匀。
13.测定设定酶标仪波长于450/630nm检测，测定各孔OD值。
14.结果判定临界值Cut Off(C.O.)＝0.105结果判定(S＝每孔的吸光度值)阴性结果(S/C.O.＜1)样本的吸光度值小于Cut Off值为阴性，代表该标本中未检出HBV PreS1抗原。
阳性结果(S/C.O.≥1)样本的吸光度值大于等于Cut Off值为阳性，代表该标本中检出HBV PreS1抗原。
实施例8用于检测乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的诊断试剂盒制备及其检测方法(酶联免疫法)。
试剂盒制备本发明包含的乙型肝炎病毒核心抗原诊断试剂盒的组成和制备如下1.酶标板制备抗HBc单克隆抗体G8(厦门波生生物技术公司NO.050824)用pH7.4的20mM PB缓冲液稀释，终浓度为4μg/ml。
2.样品裂解液如实施例5中的lysis10或lysis13或lysis16或lysis183.酶标试剂配制将购买的HRP标记抗-HBc单克隆抗体CZ(厦门波生生物技术公司、NO.04042901)配制成适合浓度(1∶1000稀释)的酶标试剂，稀释液为含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液。
阴、阳性对照、显色剂A、B液、20×浓缩洗涤液、终止液(2M H2SO4)。
试剂盒检测方法用于检测乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的诊断试剂盒的检测方法如下1.准备将试剂放置于室温(18～30℃)下平衡15～30分钟。
2.配液将50ml浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
3.编号将样品对应微孔按顺序编号。
4.裂解用移液器在对应孔加入50μl样品裂解(如实施例5中lysis10，lysis13，lysis16，lysis18)。
5.加样分别在相应孔中加入待测样品50μl，震荡混匀。
6.温育用封板膜封板后置37±1℃温育60分钟。
7.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
8.加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
9.温育用封板膜封板后置37±1℃温育30分钟。
10.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
11.显色每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置37±1℃避光显色15分钟。
12.终止每孔各加入终止液(2M H2SO4)50μl，轻轻震荡混匀。
13.测定设定酶标仪波长于450/630nm检测，测定各孔OD值。
14.结果判定临界值Cut Off(C.O.)＝0.105结果判定(S＝每孔的吸光度值)阴性结果(S/C.O.＜1)样本的吸光度值小于Cut Off值为阴性，代表该标本中未检出HBcAg。
阳性结果(S/C.O.≥1)样本的吸光度值大于等于Cut Off值为阳性，代表该标本中检出HBcAg。
实施例9联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备及其检测方法试剂盒制备本发明包含的联合检测乙型肝炎病毒前S1与核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的组成和制备如下1.酶标板制备如实施例4将7H11(也可使用其它抗前S1抗原抗体)与购买的抗-HBc单克隆抗体G8(厦门波生生物技术公司NO.050824))(也可使用其它抗-HBc抗体)用pH7.4的20mMPB缓冲液稀释至适合浓度(终浓度分别为5μg/ml和4μg/ml)联合包被于酶标板。
2.样品裂解液配制如实施例5中的lysis10或lysis13或lysis16或lysis183.酶标试剂配制如实施例4将4D11-HRP(也可使用其它抗前S1抗原抗体)与HRP标记的抗-HBc单克隆抗体CZ(厦门波生生物技术公司、NO.04042901))(也可使用其它抗-HBc抗体)配制成适合浓度(各1∶1000稀释)的酶标试剂，稀释液为含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液。
4.阴、阳性对照、显色剂A、B液、20×浓缩洗涤液、终止液(2MH2SO4)。
试剂盒检测方法联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(HBcAg)的诊断试剂盒的检测方法如下1.准备将试剂放置于室温(18～30℃)下平衡15～30分钟。
2.配液将50ml浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
3.编号将样品对应微孔按顺序编号。
4.稀释用移液器在对应孔加入50μl样品稀释液。
5.加样分别在相应孔中加入待测样品50μl，震荡混匀。
6.温育用封板膜封板后置37±1℃温育60分钟。
7.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
8.加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
9.温育用封板膜封板后置37±1℃温育30分钟。
10.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
11.显色每孔加入显色剂A、B液各50μl，轻轻震荡混匀，用封板膜封板后置37±1℃避光显色15分钟。
12.终止每孔各加入终止液(2M H2SO4)50μl，轻轻震荡混匀。
13.测定设定酶标仪波长于450/630nm检测，测定各孔OD值。
14.结果判定临界值Cut Off(C.O.)＝0.105结果判定(S＝每孔的吸光度值)阴性结果(S/C.O.＜1)样本的吸光度值小于Cut Off值为阴性，代表该标本中未检出HBV PreS1和HBcAg。
阳性结果(S/C.O.≥1)样本的吸光度值大于等于Cut Off值为阳性，代表该标本中检出HBV PreS1和(或)HBcAg。
五.本度明相关的诊断试剂盒应用及结果分析实施例10联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(核酸相关抗原)与乙型肝炎病毒核酸检测、及同类单独前S1抗原检测的平行比较试剂盒准备乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备如实施例7；乙型肝炎病毒核心抗原诊断试剂盒的制备(酶联免疫法)如实施例8；联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备如实施例9。商品化单独乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)分别购自上海复星长征医药科技有限公司(NO.3150480)及上海阿尔法生物技术公司。
乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测试剂，购自深圳匹基生物工程有限公司(NO.06010121)、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司(NO.#DA-B051)。
乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测试剂购自北京万泰生物药业有限公司(WB2196)、英科新创(厦门)科技有限公司(IPT21001、IPT21201、IPT21301、IPT21401、IPT21501)及上海实业科华生物技术(NO.267\265\266\263)有限公司。
检测标本2005年10月-2006年3月收集自厦门市中医院及泉州市第一人民医院的116份临床乙型肝炎病毒感染相关病人血清标本，-20℃冷冻保存。
检测项目对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测，采用三种不同厂家试剂(深圳匹基生物工程有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒核酸的定性判断以两家试剂检测结果相同为准。
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测，采用三种不同厂家试剂(北京万泰生物药业有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及上海实业科华生物技术有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的定性判断以两家试剂检测结果相同为准。
对每份血清标本进行同类商品化乙型肝炎病毒前S1抗原酶联免疫检测，采用两种不同厂家试剂(上海复星长征医药科技有限公司及上海阿尔法生物技术公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。
对每份血清标本进行进行本发明所公布的分别如实施6、实施7、实施8所公布的乙型肝炎病毒前S1抗原检测、乙型肝炎病毒核心抗原检测、联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(合称为核酸相关抗原)。检测程序和结果判断严格按照对应实施例说明进行。
检测结果完成所有待检测项目后统计结果，如表8。
表8116份临床乙肝血清统计结果

注“国产1”试剂上海阿尔法生物技术公司生产的乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)“国产2”试剂上海复星长征医药科技有限公司生产的乙型肝炎病毒前S1抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)“联检结果”试剂本发明公布的联合乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原检测试剂(合称为HBV combo ELISA)，如实施例8“PreS1”试剂本发明公布的乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂，如实施例6“Core”试剂本发明公布的乙型肝炎病毒核心抗原检测试剂，如实施例7灵敏度和与核酸符合率的计算方法灵敏度＝检出阳性总数/真阳性(核酸阳性)总数与核酸符合率＝(检测样本总数-两种检测结果不符总数)/检测样本总数结果分析从表2的统计结果可以看出，如实施例7的乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂相比于商品化前S1抗原检测试剂在灵敏度上有较大的优势，这是因为如实施例7的乙型肝炎病毒前S1抗原检测试剂不同于传统的商品化试剂，它采用双前S1抗体夹心法检测模式，而不再沿用传统的依靠检测整个LHBs(即通过LHBs上的HBsAg介导检测，用针对HBsAg的特异性抗体作为捕获抗体或报告抗体，再用针对PreS1的特异性抗体与之配对)，形成一个独立的前S1抗原检测试剂，不会因为LHBs上HBsAg的突变而导致病毒Dane颗粒上前S1抗原的漏检，且与乙型肝炎病毒核酸具有高度的相关性。
从表2中也可以看出在同样的检测条件下，无论灵敏度或与核酸符合率来看，联合检测PreS1、HBcAg均比单独检测PreS1和HBcAg具有较大的优势，联合检测HBcAg与PreS1模式弥补了可能因单一HBcAg或PreS1突变或漏检造成假阴性的缺点。在表9中例举的部分血清标本具体检测结果可以很直观地说明这一点。
表9联合检测优势标本数据统计

从以上的分析看出，要体现与乙型肝炎病毒核酸检测的高度相关性，单独检测前S1抗原是不够的，联合检测前S1抗原与核心抗原而形成的新指标则体现出了与乙型肝炎病毒核酸检测的高度相关性(本实施例11联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(核酸相关抗原)与乙型肝炎病毒“两对半”(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的比较分析试剂盒准备联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备如实施例9所述，也可以使用用类似方法制备的试剂盒。
乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测试剂，购自深圳匹基生物工程有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司。
乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测试剂购自北京万泰生物药业有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及上海实业科华生物技术有限公司。
检测标本2005年10月-2006年3月收集自厦门市中医院及泉州市第一人民医院的116份临床乙型肝炎病毒感染相关病人血清标本，及收集自厦门血站乙型肝炎病毒感染相关献血员血清标本，-20℃冷冻保存。
检测项目对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测，采用三种不同厂家试剂(深圳匹基生物工程有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒核酸的定性判断以两家试剂检测结果相同为准。
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测，采用三种不同厂家试剂(北京万泰生物药业有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及上海实业科华生物技术有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的定性判断以两家试剂检测结果相同为准。
筛选PCR确认乙型肝炎病毒核酸阳性、“两对半”HBsAg阴性及半非正常模式标本，进行本发明所公布的如实施例9的联合乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(合称为核酸相关抗原)检测。检测程序和结果判断严格按照实施例9说明进行。
检测结果及分析完成所有待检测项目后统计结果，如表10。
表10特殊标本PCR、两对半和前S1抗原与核心抗原联合检测结果统计

从上表中可以看出，在常规的乙肝”两对半”检测判断非病毒复制携带者(HBeAg阴性)或者非乙型感染病毒感染者(HBsAg阴性)的标本中，仍有不少标本含有大量病毒，通过前S1与核心抗原的联合检测可以很好的将这些标本检出，对于临床肝炎患者是否携带病毒可以有一个正确的判断和认识，从而可以更好确定治疗方案。尤其对于表面抗原(HBsAg)这一血站常规检测项目，通过前S1与核心抗原的联合检测，可以降低由于表面抗原变异或漏检而造成的乙型肝炎输血传播。
实施例12联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(核酸相关抗原)与常规单引物乙型肝炎病毒核酸定量PCR的比较分析试剂盒准备联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备如实施例9。
乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测试剂，购自深圳匹基生物工程有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司。
乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测试剂购自北京万泰生物药业有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及上海实业科华生物技术有限公司。
检测标本2005年12月收集自中国生物制品检定所的314份HBsAg阳性的乙型肝炎病毒感染血清标本，-20℃冷冻保存。
检测项目对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测，采用三种不同厂家试剂(深圳匹基生物工程有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及达安基因股份有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒核酸的阴性的定性性判断以三家试剂检测结果均阴性为定量PCR阴性。
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒“两对半”酶联免疫检测，采用三种不同厂家试剂(北京万泰生物药业有限公司、英科新创(厦门)科技有限公司及上海实业科华生物技术有限公司)进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照各试剂说明书进行。对于乙型肝炎病毒HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的定性判断以两家试剂检测结果相同为准。
筛选定量PCR确认乙型肝炎病毒核酸阴性、“两对半”HBsAg阳性，进行本发明所公布的如实施例5的联合乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(合称为核酸相关抗原)检测。检测程序和结果判断严格按照实施例5说明进行。并对这些标本进行分区套式PCR检测(方法参照Marie-Anne Petit et al.，JMV 2001)。
检测结果及分析完成所有待检测项目后统计结果，共计39份HBsAg阳性且定量PCR确认乙型肝炎病毒核酸阴性的血清标本。此39份标本中31份联合检测阳性，对此31份标本进行分区套式PCR检测后，确认其中9份为乙型肝炎病毒核酸阳性。
从以上结果来看由于常规血清PCR仅能检出复制的病毒，而不能检出原病毒，难以表达病毒非复制状态的存在，且常规的定量PCR检测试剂由于种种限制可能因为采用单一引物，不采用高灵敏度的套式PCR，可能存在一定程度的漏检。临床上常有乙型肝炎患者肝炎症状明显，但常规PCR检测为核酸阴性。
本公布的联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原模式可以在一定程度上弥补常规血清PCR的部分缺陷。
实施例13联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(核酸相关抗原)试剂的特异性分析试剂盒准备联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的诊断试剂盒(酶联免疫法)的制备如实施例9。
检测标本2005年10月-2006年3月，收集自厦门CDC、北京血站、绍兴血站的5976份健康献血员血清标本，-20℃冷冻保存。
检测项目对每份血清进行本发明所公布的如实施例9的联合乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(合称为HBV combo ELISA)检测。检测程序和结果判断严格按照实施例9说明进行。
结果与分析完成所有待检测项目后统计结果，统计结果如表11。

表11联合检测的特异性分析从以上结果来看，本发明所公布联合乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(合称为核酸相关抗原)检测试剂特异性良好。
实施例14联合检测乙型肝炎前S1抗原与核心抗原在化学发光中的应用化学发光试剂盒制备本发明包含的联合检测乙型肝炎病毒前S1与核心抗原诊断试剂盒(化学发光法)的组成和制备如下1.化学发光板制备如实施例3将7H11(也可以使用其它)与购买的抗-HBc单克隆抗体稀释G8(厦门波生生物技术公司NO.050824)(也可以使用其它抗前S1抗原和抗核心抗原的抗体)至适合浓度(终浓度分别为5μg/ml和4μg/ml)联合包被于化学发光板(厦门怡新美有限公司、NO.C0004)。
2.样品裂解液如实施例5中的lysis10或lysis13或lysis16或lysis18。
3.酶标试剂配制如实施例2将4D11-HRP与购买的HRP标记的抗-HBs单克隆抗体、HRP标记的抗-HBc单克隆抗体CZ(厦门波生生物技术公司、NO.04042901)(也可以使用其它抗前S1抗原和抗核心抗原的抗体)配制成适合浓度(1∶10000的酶标试剂，稀释液为含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液。
4.发光剂(PIERCE NO.1856155)、洗涤液(含1‰Tween20的PBS溶液)试剂盒检测方法联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原(HBcAg)的诊断试剂盒(化学发光法)的检测方法如下1.准备将试剂放置于室温(18～30℃)下平衡15～30分钟。
2.配液将50ml浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
3.编号将样品对应微孔按顺序编号。
4.裂解用移液器在对应孔加入50μl样品裂解液。
5.加样分别在相应孔中加入待测样品50μl，震荡混匀。
6.温育用封板膜封板后置37±1℃温育60分钟。
7.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
8.加酶分别在相应孔中加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
9.温育用封板膜封板后置37±1℃温育30分钟。
10.洗涤温育后将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗涤5遍，每次浸泡30～60秒。
11.发光每孔加入发光剂100μl，置于化学发光仪测定各孔发光强度。
结果分析取20份经荧光定量PCR测定含有不同病毒量的乙肝阳性标本，用化学发光法进行测定，结果如表12。由于荧光定量PCR定量及发光强度均接近对数分布，我们对各标本的病毒含量及发光强度分别取对数后进行线性相关性分析如图3所示。
表12化学发光检测与荧光定量PCR相关性

通过表12及图3可见，联合检测乙型肝炎病毒前S1与核心抗原方法与病毒含量有较高的相关性。可以实现利用联合乙型肝炎病毒前S1与核心抗原定量检测来估计样本的核酸载量。
权利要求
1.一种检测乙型肝炎病毒或者检测乙型肝炎病毒感染的方法，包括在样品中联合检测(包括分开检测和合并检测，以及同时检测和以任何顺序先后检测，优选同时、合并检测)乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原。
2.权利要求1所述方法，其中所述样品为来自待检个体的分离的生物学样品，优选所述样品为血清。
3.权利要求1或2所述方法，其中所述方法用于判断血清中乙型肝炎病毒核酸的存在与否。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的联合检测通过从如下方法中选择的一种或者几种方法来实现酶联免疫吸附法、免疫渗滤法、免疫层析法、化学发光法、时间分辨法；优选酶联免疫吸附法或化学发光法。
5.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中在相同反应容器(如反应孔)中在相同反应中同时检测前S1抗原与核心抗原。
6.权利要求1-5之任一项所述的方法，其中采用双抗体夹心法检测前S1抗原与核心抗原。
7.权利要求1-6之任一项所述的方法，其中不需要对样品进行预处理。
8.权利要求1-7之任一项所述的方法，其中乙型肝炎病毒的裂解和前S1抗原与核心抗原的捕获在相同反应容器(例如反应孔)中在相同介质中同时进行。
9.权利要求8的方法，其中使用权利要求17中所述的裂解液作为所述介质。
10.权利要求1-9之任一项所述的方法，其包括以下步骤a)提供可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体)，以及可与乙型肝炎病毒核心抗原特异结合的第一抗HBc抗体和第二抗HBc抗体(可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体)；b)将第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体作为捕获抗体结合到相同固相载体上，形成第一抗体-载体结合物；优选地，所述载体为ELISA板；c)使待测样品与第一抗体-载体结合物接触，使得样品中的乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原，如果存在的话，被捕获，形成抗原-第一抗体-载体结合物；所述样品可以是经过预处理的或者没有经过预处理的；优选地，所述样品没有经过预先病毒裂解处理，待测样品与第一抗体-载体结合物接触在允许病毒裂解和抗原捕获的条件下进行；更优选待测样品与第一抗体-载体结合物接触在权利要求17所述的裂解液中进行；d)使第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体与步骤c)的产物(载体)接触，该接触在允许第二抗体与被捕获的抗原结合形成第二抗体(第二抗HBV PreS1抗体/第二抗HBc抗体)-抗原(乙型肝炎病毒前S1抗原/核心抗原)-第一抗体(第一抗HBV PreS1抗体/第一抗HBc抗体)-载体结合物的条件下进行；e)检测被结合的第二抗体的量。
11.权利要求10的方法，其中步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行提供能与所述第二抗HBV PreS1抗体有效结合的第一信号产生体和能与所述第二抗HBc抗体有效结合的第二信号产生体，第一和第二信号产生体所产生的信号强度分别仅与第二抗HBVPreS1抗体和第二抗HBc抗体的量有关；将第一和第二信号产生体与第二抗体接触；检测由信号产生体产生的信号。
12.权利要求10的方法，其中步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行第二抗体直接标记有信号产生体，检测由信号产生体产生的信号。
13.权利要求11或者12的方法，其中信号产生体是酶、荧光素、化学发光物质、同位素、稀土元素。
14.权利要求1-13之任一项所述的方法，其中使用抗乙型肝炎病毒前S1抗原和抗核心抗原的单克隆抗体进行免疫检测。
15.权利要求14所述的方法，其中抗乙型肝炎病毒前S1抗原的单克隆抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5；优选地，使用7H11单抗作为第一抗HBV PreS1抗体而使用4D11-HRP作为第二抗HBV PreS1抗体配对检测HBV PreS1。
16.权利要求10的方法，还包括步骤在待测样品与第一抗体-载体结合物接触之前，使用裂解液裂解样品中的病毒，其中所述裂解液优选是权利要求17的病毒裂解液。
17.病毒裂解液(此病毒裂解液可用于联合检测)，其含有表面活性剂和适当的缓冲剂，所述表面活性剂选自Chaps，sulfobetain8-18(SB8、SB10、SB12、SB14、SB16、SB18)，布里杰35，Tween系列和/或HP-β-CD，优选选自SB14、SB16、SB18、HP-β-CD、TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60、TWEEN80；优选地，表面活性剂可以是以上表面活性剂中的一种或多种(2、3、4、5种)的组合，例如HP、TWEEN系列和SB系列中一种或者两种或者三种的组合，例如HP+TWEEN系列、TWEEN系列+SB系列、HP+SB系列或者HP+TWEEN系列+SB系列，优选HP+TWEEN40、HP+TWEEN40+SB14、HP+TWEEN40+SB16、HP+TWEEN40+SB18、HP+TWEEN40+SB18、HP+TWEEN20+SB14、HP+TWEEN60+SB14、HP+TWEEN80+SB14；优选地，表面活性剂可以是HP0.5％-4％；Tween系列0.1％-6％；SB14％1％-10％；SB160.5％-1％；SB180.5％-1％；更优选HP1％-2％；Tween系列0.5％-2％；SB142％-8％；SB161％；SB181％；如1％-2％HP+0.5％-1％Tween+1％-2％SB14；优选地，表面活性剂选自表4所示lysis1-lysis24，更优选lysis1、lysis10、lysis11、lysis12、lysis13、lysis14、lysis15、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、lysis22、lysis23、和lysis24，更优选lysis10、lysis13、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、和lysis24，最优选lysis10、13、16、18中所述的表面活性剂；优选地，缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液；缓冲剂可以是上述缓冲液中的一种或者几种(2、3、4、5种)的组合；缓冲剂优选柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液；缓冲剂的pH范围和浓度范围可以是磷酸盐缓冲液10-50mM pH值6.0-7.0优选20mM pH值7.4；柠檬酸盐缓冲液10-50mM pH值3.0-6.6优选10mM pH值6.6；Tris缓冲液10-50mM pH值7.0-9.0优选20mM pH值7.0；醋酸盐缓冲液10-50mM pH值3.8-6.0优选10mM pH值6.0；非必需地，裂解液还可以含有一种或者多种(如1、2、3、4、5、6-10种)其它成分，例如还原剂(例如DTT、DTE、β-巯基乙醇)、螯合剂(例如EDTA)、渗透压调节物(例如盐，如NaCl；蔗糖)，例如β-巯基乙醇0.01％-1％优选0.1％-0.5％，更优选0.4％；DTT1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；DTE1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；EDTA5mM-20mM优选5mM；NaCl50mM-300mM更优选50-150mM，更优选100mM；蔗糖2％-20％优选5％-10％更优选10％；优选地，裂解液选自表4所示的lysis1-lysis24，更优选地，裂解液选自lysis1、lysis10、lysis11、lysis12、lysis13、lysis14、lysis15、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、lysis22、lysis23、和lysis24，更优选lysis10、lysis13、lysis16、lysis17、lysis18、lysis19、lysis20、lysis21、和lysis24，最优选地，裂解液选自lysis10——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB14、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；lysis13——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB16、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；lysis16——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％SB18、5mM DTE、100mM NaCl、5mM EDTA；和lysis18——pH6.6的柠檬酸盐缓冲液、2％HP、0.5％Tw40、0.4％Me、10％蔗糖。
18.一种试剂盒，其包括用于根据权利要求1-13之任一项所述的方法联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的试剂。
19.权利要求18中所述试剂盒，其中含有抗HBV PreS1抗体(优选包含两种不同的抗HBV PreS1抗体)和抗HBc抗体(优选包含两种不同的抗HBc抗体)，和/或权利要求17的病毒裂解液；所述试剂盒中优选还含有适于检测所述抗原抗体反应的试剂(例如检测第二抗体的检测试剂)；优选地所述抗体中至少一种抗HBV PreS1抗体和至少一种抗HBc抗体是被信号产生体标记的，或者能与信号产生体有效结合，抗HBVPreS1抗体和抗HBc抗体标记的信号产生体或者结合的信号产生体可以相同或者不同，优选可以采用相同的检测方法检测；所述抗体优选是单克隆抗体；优选地抗HBV PreS1抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5，特别是7H11与4D11。
20.权利要求19中所述试剂盒，其中包含(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体；和/或(2)权利要求17的病毒裂解液；(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBV PreS1抗体和第二抗HBc抗体；(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了权利要求1-16任一项的方法)。
21.权利要求20中所述试剂盒，其中固相载体是多孔反应板，在多孔反应板的孔中固定有第一抗HBV PreS1抗体和第一抗HBc抗体。
22.固相载体，其上固定有抗HBV PreS1抗体和抗HBc抗体；优选固相载体是多孔反应板(例如酶标板、化学发光板)，在多孔反应板的孔中固定有抗HBV PreS1抗体和抗HBc抗体。
23.联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原与核心抗原的试剂在制备用于检查乙型肝炎病毒感染的试剂盒中的用途；优选地，所述试剂是权利要求18-22任一项中所描述的试剂。
24.采用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法，其特征在于所用的两种抗体(捕获抗体和报告抗体)都是与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的HBV PreS1抗体。
25.权利要求24的方法，其中不需要对样品进行预处理。
26.权利要求24-25任一项的方法，其中乙型肝炎病毒的裂解和前S1抗原的捕获在相同反应容器(反应孔)中在相同介质中同时进行。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中使用权利要求33中所述的裂解液作为所述介质。
28.权利要求24-27任一项的方法，其包括a)提供可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(两种抗体可以相同或者不同)；b)将第一抗HBV PreS1抗体作为捕获抗体结合到固相载体上，形成第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物；优选地，所述载体为ELISA板；c)使待测样品与第-抗HBV PreS1抗体-载体结合物接触，使得样品中的乙型肝炎病毒前S1抗原，如果存在的话，被捕获，形成抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物；d)使第二抗HBV PreS1抗体与步骤c)的产物接触，该接触在允许第二抗HBV PreS1抗体与被捕获的抗原结合形成第二抗HBV PreS1抗体-抗原-第一抗HBV PreS1抗体-载体结合物的条件下进行；e)检测被结合的第二抗HBV PreS1抗体的量。
29.权利要求28的方法，其中步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行提供能与所述第二抗HBV PreS1抗体有效结合的信号产生体，该信号产生体所产生的信号强度仅与第二抗HBVPreS1抗体的量有关；将信号产生体与第二抗体接触；检测由信号产生体产生的信号。
30.权利要求28的方法，其中步骤e)检测被结合的第二抗体的量通过如下方法来进行第二抗体直接标记有信号产生体，检测由信号产生体产生的信号。
31.权利要求24-30任一项的方法，其中信号产生体是酶、荧光素、化学发光物质、同位素、稀土元素。
32.权利要求24-31任一项所述的方法，其中所述乙型肝炎病毒前S1抗原的检测通过从如下方法中选择的一种或者几种方法来实现酶联免疫吸附法、免疫渗滤法、免疫层析法、化学发光法、时间分辨法；优选酶联免疫吸附法或化学发光法。
33.病毒裂解液(此病毒裂解液可用于检测前S1抗原)，其含有表面活性剂和适当的缓冲剂，所述表面活性剂选自Chaps，sulfobetain 8-18，布里杰35，TritonX100，Tween系列和/或HP-β-CD，优选选自SB8、SB12、SB14、SB16、SB18、HP-β-CD、TWEEN20、TWEEN40、TWEEN60、TWEEN80、BRJ35，更优选SB12、SB14、SB16、SB18、TWEEN80；优选地，表面活性剂可以是以上表面活性剂中的一种或多种(2、3、4、5种)的组合，优选SB16+SB14、SB18+SB14；优选地，表面活性剂的浓度范围可以是SB14％1％-10％；SB160.5％-1％；SB180.5％-1％；更优选SB142％-8％；SB161％；SB181％；如1％SB14+0.5％SB16或1％SB 14+0.5％SB18，2％SB14，1％SB16+0.5％SB14，1％SB18+0.5％SB14，2％SB14；优选地，表面活性剂选自表2所示的A-P裂解液，更优选C-M裂解液和P裂解液，更优选E、F、G、H、J裂解液，最优选G裂解液、H裂解液，或者表6所示的ε裂解液、ζ裂解液、η裂解液、θ裂解液中所述的表面活性剂；优选地，缓冲剂选自柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、氨基酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸盐缓冲液；缓冲剂可以是上述缓冲液中的一种或者几种(2、3、4、5种)的组合；缓冲剂优选柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液；缓冲剂的pH范围和浓度范围可以是，磷酸盐缓冲液10-50mM pH值6.0-7.0优选20mM pH值7.4；柠檬酸盐缓冲液10-50mM pH值3.0-6.6优选10mM pH值6.6；Tris缓冲液10-50mM pH值7.0-9.0优选20mM pH值7.0；醋酸盐缓冲液10-50mM pH值3.8-6.0优选10mM pH值6.0；非必需地，裂解液还可以含有一种或者多种(如1、2、3、4、5、6-10种)其它成分，例如还原剂(例如DTT、DTE、β-巯基乙醇)、螯合剂(例如EDTA)、渗透压调节物(例如盐，如NaCl；蔗糖)，例如β-巯基乙醇0.01％-1％优选0.1％-0.5％，更优选0.2％；DTT1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；DTE1-30mM优选5-10mM，更优选5mM；EDTA5mM-20mM优选5mM；)优选地，裂解液选自表2所示的A-P裂解液，更优选C-M裂解液和P裂解液，更优选E、F、G、H、J裂解液，最优选G裂解液、H裂解液；或者选自表6所示的ε裂解液、ζ裂解液、η裂解液、θ裂解液。
34.用于检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂盒，其包括用于根据权利要求24-32任一项所述的方法检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂。
35.权利要求34的试剂盒，其包含可与乙型肝炎病毒前S1抗原特异结合的第一抗HBV PreS1抗体和第二抗HBV PreS1抗体(两种抗体可以相同或者不同，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体)和/或权利要求33的裂解液；所述试剂盒中优选还含有适于检测所述抗原抗体反应的试剂(例如检测第二抗体的检测试剂)；优选地所述抗体中至少一种抗HBV PreS1抗体是被信号产生体标记的，或者能与信号产生体有效结合；所述抗体优选是单克隆抗体；优选地抗HBV PreS1抗体选自3H5、7H11、2A7、4D11、6F1、13G2和16F5，特别是7H11与4D11。
36.权利要求34-35任一项中所述试剂盒，其中包含(1)固相载体，所述固相载体上固定有第一抗HBV PreS1抗体；和/或(2)权利要求33的裂解液；(3)可有可无的被信号产生体标记的或者未被标记的第二抗HBV PreS1抗体；(4)可有可无的检测第二抗体的检测试剂；和(5)可有可无的缓冲液、洗涤液、使用说明书(优选使用说明书记载了权利要求24-32任一项的方法)。
37.权利要求34-36任一项中所述试剂盒，其中固相载体是多孔反应板(例如酶标板、化学发光板)，在多孔反应板的孔中固定有抗HBV PreS1抗体。
38.检测乙型肝炎病毒前S1抗原的试剂在制备用于检查乙型肝炎病毒感染的试剂盒中的用途；优选地，所述试剂是权利要求34-37任一项中所描述的试剂。
39.裂解病毒的方法，包括在不实质上变性蛋白质(例如不实质上灭活抗体，例如前S1抗原或者核心抗原抗体)的温和条件下裂解病毒，优选采用权利要求17或33的裂解液裂解病毒；所述病毒优选是乙型肝炎病毒。
40.检测乙型肝炎病毒前S1抗原或者核心抗原的方法，包括在不实质上变性蛋白质(例如不实质上灭活抗体，例如前S1抗原或者核心抗原抗体)的温和条件下裂解病毒，优选采用权利要求17或33的裂解液裂解病毒；检测乙型肝炎病毒前S1抗原或者核心抗原。
全文摘要
本发明公开了通过对乙型肝炎病毒相关的前S1抗原(HBV PreS1)与核心抗原(HBcAg)联合检测，诊断乙肝病毒感染的方法。本发明还公开了采用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒前S1抗原的方法。本发明还公开了用于上述检测的试剂盒和病毒裂解液以及它们的用途。
文档编号G01N33/577GK1869701SQ20061009051
公开日2006年11月29日 申请日期2006年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者葛胜祥, 袁权, 赵昱, 罗文新, 张军, 夏宁邵 申请人:厦门大学, 北京万泰生物药业有限公司