Vhsv抗原和抗体的制备方法以及vhsv的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及VHSV检测领域，具体而言，涉及VHSV抗原和抗体的制备方法以及VHSV 的检测方法。
【背景技术】
[0002] 病毒性出血性败血症（VHS)为世界动物卫生组织（0IE)公布的鱼类必报疫病，发 布诊断标准（《水生动物疫病诊断手册》）已多次改版，该病在我国《进境动物检疫疫病名 录》中被列为二类传染病。目前国内外，VHS的诊断方法主要有以下几种：病毒分离、免疫荧 光（IFAT)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、透射电镜和RT-PCR等。标准的VHS监测方法（监测 鱼群带毒情况）基本是直接检测，例如用细胞培养分离VHSV，再通过基于抗体的方法（IFAT 或ELISA)或基于核酸的方法（RT-PCR)来鉴定。虽然在《水生动物疫病诊断手册》中推荐 使用ELISA等免疫学鉴定方法，但目前市场上，特别是国内市场上，仍没有商品化的免疫学 诊断试剂。
[0003] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种VHSV抗原的制备方法，该制备方法采用超速离 心后特定浓度蔗糖超速离心，获得了高浓度VHSV抗原，为制备特异性强和效价高的高免血 清奠定了基础。
[0005] 本发明的第二目的在于提供一种VHSV抗体的制备方法，该方法采用程序化免疫 程序，获得高效价的抗血清，可获得效价为1:16000的VHSV多抗。
[0006] 本发明的第三目的在于提供一种VHSV的检测方法，该检测方法采用免疫荧光的 方法，特异性强，灵敏度高。
[0007] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0008] -种VHSV抗原的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (a)、将VHSV接种于BF-2细胞，至CPE达到80%以上，收集细胞；
[0010] (b)、将细胞放置于-80°C±2°C，反复冻融3-4次，离心得到上清液；
[0011](C)、将所述上清液超速离心，得到VHSV沉淀，所述VHSV沉淀用TNE缓冲液重悬；
[0012] (d)、用24% -26%的蔗糖超速离心，得到的VHSV沉淀再用TNE缓冲液重悬，得到 浓度为4. 7mg/ml以上的纯化病毒。
[0013] 本发明提供的VHSV抗原的制备方法，将VHSV接种于BF-2细胞，至CPE(致细胞病 变效应）达到80%以上再进行提取VHSV，通过超速离心和特定浓度的蔗糖超速离心，获得 高浓度VHSV抗原，浓度达4. 7mg/ml以上，为制备特异性强和效价高的高免血清奠定了基 础。
[0014] 其中，TNE缓冲液成分为：50mMTris-HCl，150mMNaCl,ImMNa2EDTA，pH7. 5。
[0015]经多次试验发现，特定生长状态的细胞更易于被VHSV侵染，并使VHSV易于扩繁， 优选地，在步骤（a)中，BF-2细胞接种至含有MEM培养基的培养瓶中，25°C±2°C培养至培 养瓶内细胞长满78% -83%时接种所述VHSV。
[0016] 优选地，在步骤（a)中，所述BF-2细胞接种VHSV后吸附55-65min，然后加入含 1.8% -2. 2%血清的MEM培养基，放置在15°C±2°C培养箱中培养，至CPE达到80%以上。 该生长状态的细胞，VHSV含量多，生长活力强，更易于制备高浓度的VHSV。
[0017] 进一步地，在步骤（c)中，所述超速离心为：4°C±2°C，30,OOOrpm离心55_65min;
[0018] 在步骤（d)中，所述超速离心为：4°C±2°C，33,OOOrpm离心85_95min。
[0019] 通过低温和特定转速的超速离心，获得更多量的VHSV;通过特定蔗糖浓度的超速 离心，以获得纯度更高、更多量的VHSV。最终制得的VHSV浓度为4. 7-4. 9mg/ml。
[0020] 本发明还提供了一种VHSV抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0021] 选择模式动物，前三次皮下注射权利要求1-4任一项制得的VHSV抗原与等量弗氏 不完全佐剂的混合物，每次所述VHSV抗原的注射量为195-205yg;
[0022] 后两次腹腔注射，注射权利要求1-4任一项制得的VHSV抗原，每次注射 195-205yg；
[0023] 其中，前三次每隔12-16天免疫一次，且第三次免疫10d后，耳静脉采血，分离血 清，检测血清内抗VHSV效价，当效价达到1:8000时，再进行后两次免疫，后两次免疫的时间 间隔为12-16天；
[0024] 末次免疫后两周采血分离血清即得VHSV多抗。
[0025] 本发明提供的VHSV抗体的制备方法，该方法采用特定的程序化免疫程序，并选用 本发明制得的高浓度VHSV抗原进行免疫，获得高效价的抗血清，获得的VHSV多抗效价为 1:16000 以上。
[0026] 优选地，所述模式动物为白兔、小鼠、山羊、绵羊中的任一种，但并不限于这些种类 的模式动物。
[0027] 优选地，所述模式动物为白兔，所述白兔为成年雄性健康新西兰大耳白兔。该模式 动物易于饲养，免疫操作更方便，且免疫后易于收集足够多的血样，以制得更多的VHSV多 抗。
[0028] 本发明还提供了一种VHSV的检测方法，包括以下步骤：
[0029](a)、制备待检测样本的上清液；
[0030] (b)、将所述上清液添加到BF-2细胞或CHSE-214细胞的单层细胞上，培养至少24 小时后，对细胞预处理，然后加入权利要求5-6任一项制备的VHSV多抗，孵育；
[0031] (c)、洗板后，加入FITC荧光二抗，孵育后洗板，然后进行荧光检测即可。
[0032] 本发明提供的VHSV的检测方法，采用免疫荧光的方法，先添加本发明制备的VHSV 多抗，然后添加带有荧光的且能与本发明提供的VHSV多抗特异性结合的二抗，该检测方法 特异性强，灵敏度高。
[0033] 优选地，在步骤（a)中，所述上清液通过以下方法制备：
[0034] 取同一养殖池里面的待检测的鱼3-5条，取内脏，匀浆，离心，得到所述上清液。
[0035] 由于生长在某一环境中的鱼发病后所感染的病毒具有同一性，因此，为了制备足 够的上清液，取待检测的3-5条鱼，取内脏，内脏包括脑、脾、肾和心脏，然后进行匀浆，以 7500rpm离心10_15min即可得待检测样本的上清液。
[0036] 为了使待检测样本的上清液中的VHSV侵染到细胞中，进行足够的扩繁，且细胞未 完全裂解掉，以便于检测，优选地，在步骤（a)中，培养的时间为1-6天。
[0037] 优选地，在步骤（b)中，所述上清液分别以1:1-100进行稀释后添加，所述上清液 与所述单层细胞的培养液的体积比为1:4-6。也就是说，上清液可以以原液添加，即上清液 以1:1进行稀释；也可以稀释成一定的浓度进行添加，如可以以1: 5、1:10、1:50、1:100等等 进行稀释。为了检测更为全面，一般选择3个稀释浓度同时进行试验检测。
[0038] 若侵染的VHSV数量多，则VHSV扩繁速度较快，检测的细胞培养时间可适当的缩 短。
[0039] 优选地，在步骤（b)中，对细胞预处理具体为：
[0040] 吸出液体，用pH为7. 0-7. 2的0. 008-0. 15MPBS溶液洗一次，然后再 用-18°C~-20°C的28% -32 %丙酮和68% -75 %乙醇混合液洗涤2-3次；
[0041] 添加与吸出的液体等体积的78% -82%丙酮，固定15-20min;
[0042] 吸出丙酮，干燥30-60min。
[0043] 通过该预处理后的细胞，易于与VHSV多抗结合。
[0044]优选地，在步骤（b)中，在步骤（b)中，所述VHSV多抗的工作浓度为4-6yg/ml，所 述VHSV多抗与所述上清液的体积比为1:4-6。加入VHSV多抗后，将培养板放入黑色湿盒中 或用锡箱纸包好放入湿盒中，37°C孵育25-35min。
[0045] 优选地，在步骤（c)中，所述FITC荧光二抗的工作浓度为0.8-2yg/ml，所述 FITC荧光二抗与所述VHSV多抗的体积比为0. 9-1. 1: 1。加入FITC荧光二抗后，37°C孵育 25-35min〇
[0046] 通过添加特定量的VHSV多抗以及FITC荧光二抗以增加灵敏度和检测的准确度。
[0047] 其中，若VHSV多抗为兔抗VHSV多抗，FITC荧光二抗可选用羊抗兔FITC;若VHSV 抗体为抗VHSV单抗，FITC荧光二抗可选用羊抗鼠FITC荧光二抗，这些FITC荧光二抗通过 市售购买即可，如可购自南京巴傲德生物公司。
[0048] 本发明通过引进国外技术再创新，建立了VHSV抗血清制备方法，并利用研制的抗 血清，完善了VHSV免疫荧光检测方法，为国内开展VHS免疫学诊断提供了程序化的抗血清 制备及免疫荧光检测方法。
[0049] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0050] (1)本发明提供一种VHSV抗原的制备方法，将VHSV接种于BF-2细胞，至CPE(致 细胞病变效应）达到80%以上再进行提取VHSV，通过超速离心和特定浓度的蔗糖超速离 心，获得高浓度VHSV抗原，浓度达4. 7mg/ml以上，为制备特异性强和效价高的高免血清奠 定了基础。
[0051] (2)本发明提供的VHSV抗体的制备方法，采用特定的程序化免疫程序，并选用 本发明制得的高浓度VHSV抗原进行免疫，获得高效价的抗血清，获得的VHSV多抗效价为 1:16000 以上。
[0052] (3)本发明提供的VHSV的检测方法，采用免疫荧光的方法，先添加本发明制备的 VHSV多抗，然后添加带有荧光的且能与本发明提供的VHSV多抗特异性结合的二抗，该检测 方法特异性强，灵敏度高。
【附图说明】
[0053] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0054] 图1为本