抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及口蹄疫O型病毒的单克隆抗体、分泌抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体与其它抗体的组合与应用，该应用体现在通过对口蹄疫O型病毒的抗原和抗体检测，实现疫苗生产过程中对原料、中间产品和成品的监控，以及口蹄疫O型疫苗免疫后血清抗体水平的监控。
背景技术：
：口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。近十几年以来，全世界口蹄疫的流行态势发生了一些新的变化。一方面未消灭口蹄疫的国家和地区，口蹄疫继续流行，而另一方面已控制和消灭口蹄疫的国家和地区，也出现口蹄疫的发生和流行。从FAO/OIE口蹄疫参考实验室报告的资料来看，在1990～2002年之间，口蹄疫在世界范围内的流行还是非常严重的，7个型的口蹄疫均有流行，其中以O、A、和Asia1型的流行较为严重。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员。感染FMDV的细胞培养液，电镜下观察，有四种粒子。最大粒子为完整病毒，直径23±2nm，沉降系数为146S，具有感染性，呈圆形或六角形，正二十面体对称，分子量6.9×106Da，无囊膜，在氯化艳中的浮密度为1.43g/ml。病毒由中央的核糖核酸核芯和周围的蛋白壳体所组成，成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余70％为蛋白质。第二种为不含有RNA的空衣壳，直径21nm，沉降系数为75S，没有感染性，有型特异性和免疫原性；第三种为衣壳蛋白亚单位，其直径为7nm，沉降系数为12S～14S，无RNA，无感染性，有抗原性；第四种为病毒感染相关抗原(Virusinfection-associatedantigen，VIA抗原)，沉降系数为4.5S，为病毒的非结构蛋白(病毒RNA聚合酶)，能诱发动物产生群特异抗体，无型特异性，在琼脂扩散试验中对各型口蹄疫病毒的抗体都呈现反应，可以应用VIA抗原检测各型口蹄疫病毒感染动物的血清抗体。目前，口蹄疫病毒在全世界主要有7个血清型，以及65个以上亚型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用多价疫苗来降低患口蹄疫的风险。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。口蹄疫O型包含多种毒株：O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93等。目前，口蹄疫灭活疫苗是预防该病发生的主要有效手段，主要通过将口蹄疫病毒体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。为保证免疫效果，很多疫苗生产商将口蹄疫多种毒株混合在一起制成多价或多组分疫苗，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫三价疫苗中包含口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)、口蹄疫A型(Re-A/WH/09)和口蹄疫亚洲1型(JSL/06)三种毒株。FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。准确、特异、快速地检测口蹄疫病毒抗原的水平在疫苗生产监控等方面具有重要意义。实际工作中，疫苗生产商常采用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫抗原进行定量检测，但是该法操作复杂、时间长、投入大，不便于推广。除此之外，也有人采用PCR分子检测方法检测口蹄疫病毒，PCR是一个高灵敏的方法，但特异性存在不足，且不适合生产定量。单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克隆抗体，目前在很多检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但仅限于在对单一特定病毒(如专利文献CN105296434A针对O/Mya98/BY/2010病毒，专利文献CN105348386A针对O/GX/09-7病毒)检测中应用，尚不足以应用到对多种口蹄疫O型病毒的检测，获得针对多种口蹄疫O型病毒特异性以及应用性好的单克隆抗体或组合及能够将其应用于口蹄疫O型病毒的检测仍是研究人员的努力目标。猪、牛注射口蹄疫疫苗后，通常需要检测其血清中抗体效价水平来判断是否具有足够的保护性。目前市场上可见的检测抗体水平的产品有中国农业科学院兰州兽医研究所生产的液相阻断ELISA试剂盒、韩国金诺竞争法ELISA试剂盒、美国IDEXX公司生产的ELISA试剂盒等，这些试剂盒都采用ELISA法检测抗体水平，常常需要2个小时以上的时间。其中，兰州兽医研究所生产的ELISA试剂盒中采用的是兔、豚鼠多克隆抗体。众所周知，多克隆抗体针对多个抗原位点，并且多克隆抗体的批次差异大。而单克隆抗体针对单一的抗原位点，且在制备过程中重复性更好。胶体金免疫纸层析是一种基于抗原抗体的快速检测方法，可以在10-20分钟内完成检测，不需要大型的仪器设备，非常适合于现场检测。从操作易用性方面，优于ELISA产品。另外，它可通过目测进行定性检测，也可配套小型的仪器实现定量检测或半定量检测，如北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100免疫层析分析记录仪等。如能以单克隆抗体胶体金法实现口蹄疫疫苗抗原检测以及疫苗免疫后抗体水平的快速测量，在现场、野外或小规模的养殖场会有很大的用途和意义。技术实现要素：为实现对口蹄疫O型病毒抗原和抗体的检测，本发明提出以下几方面内容：本发明的一个目的是提供口蹄疫O型病毒(O/Mya98/BY/2010)的非特异性单克隆抗体4H9anti。所述非特异性单克隆抗体4H9anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：13由122个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：14由104个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：15的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：13的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：16的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：14的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：15由366个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：16由312个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列的蛋白质。含有基因4H9anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明。分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H9也属于本发明，4H9已于2016年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12673。本发明的第二个目的是提供用于检测口蹄疫O型病毒抗原的单克隆抗体组合。本发明提供的用于检测口蹄疫O型病毒抗原的单克隆抗体组合，包括口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti。所述特异性单克隆抗体6D6anti其重链可变区具有序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：1由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：2由99个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体6D6anti的基因(6D6anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：3的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：1的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：4的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：2的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：3由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：4由297个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列的蛋白质。所述非特异性单克隆抗体2H10anti的重链可变区具有序列表中SEQIDNo：5的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中SEQIDNo：6的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：6的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒非特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：5由117个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：6由104个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体2H10anti的基因(2H10anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：7的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：5的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：7限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：8的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：6的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：8限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：7由351个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：5的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：8由312个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：6的氨基酸残基序列的蛋白质。所述特异性单克隆抗体1F2anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：9的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：9的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽，轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：10的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：10的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：9由113个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：10由98个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体1F2anti的基因(1F2anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：11的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：9的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：11限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：12的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：10的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：11由339个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：9的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：12由294个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：10的氨基酸残基序列的蛋白质。所述非特异性单克隆抗体4H9anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：13由122个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：14由104个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：15的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：13的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：16的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：14的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：15由366个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：16由312个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列的蛋白质。抗体组合的方式包括：在双抗夹心ELISA检测中，用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti作为包被抗体，以非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti作为酶标抗体。含有基因6D6anti、1F2anti、2H10anti和/或4H9anti的表达载体、转基因细胞系或宿主菌均属于本发明。本发明涉及的口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti，是以口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒为免疫原免疫小鼠(Musmusculus)首先获得杂交瘤细胞株6D6和2H10，再由所述细胞株持续、稳定分泌得到。其中能分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体的细胞株6D6，已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.11196；分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H10，已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.11195。本发明涉及的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性单克隆抗体1F2anti和非特异性单克隆抗体4H9anti，是以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠(Musmusculus)首先获得杂交瘤细胞株1F2和4H9，再由所述细胞株持续、稳定分泌得到。其中能分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性单克隆抗体的细胞株1F2，已于2015年06月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.10896；分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H9，已于2016年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNo.12673。获得杂交瘤细胞株6D6或2H10的方法，可包括以下步骤：1)用口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒作为免疫原免疫动物；2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株6D6或2H10。获得单克隆抗体6D6anti或2H10anti的方法，是在上述步骤的基础上增加以下步骤：4)从杂交瘤细胞株6D6或2H10的培养液或接种杂交瘤细胞株6D6或2H10的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。在上述获得杂交瘤细胞株6D6或2H10、单克隆抗体6D6anti或2H10anti的方法中：步骤1)中的口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000μg/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。步骤2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。步骤3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。步骤4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒单克隆抗体6D6anti或2H10anti的杂交瘤细胞株6D6或2H10，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体6D6anti或2H10anti。获得杂交瘤细胞株1F2或4H9的方法，可包括以下步骤：(1)用口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原免疫动物；(2)分离免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤；(3)筛选杂交瘤细胞，得到杂交瘤细胞株1F2或4H9。获得单克隆抗体1F2anti或4H9anti的方法，是在上述步骤的基础上增加以下步骤：(4)从杂交瘤细胞株1F2或4H9的培养液或接种杂交瘤细胞株1F2或4H9的动物的腹水液中分离并纯化出单克隆抗体。在上述获得杂交瘤细胞株1F2或4H9、单克隆抗体1F2anti或4H9anti的方法中：步骤(1)中的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒可为活病毒或灭活病毒，优选为灭活病毒，浓度为10-1000μg/mL；用于制备单克隆抗体的免疫动物可为小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、驴、马等哺乳动物，优选为小鼠。步骤(2)中当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，可分离动物的脾细胞并制备成单细胞悬液。必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，并在适当的融合剂(如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤细胞(优选为小鼠骨髓瘤细胞SP2/0)融合以形成杂交瘤。步骤(3)中可以在选择性培养基(如HAT培养基)中培养以筛选融合的杂交瘤细胞，并进一步可使用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定所需的阳性抗性细胞株。步骤(4)中可于体外(如在组织培养瓶或多孔纤维反应器中)或体内(小鼠腹水)培养分泌口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒单克隆抗体1F2anti或4H9anti的杂交瘤细胞株1F2或4H9，并从细胞培养液或小鼠腹水液中收集和纯化出单克隆抗体1F2anti或4H9anti。本发明第三个目的在于提供所述单克隆抗体组合在口蹄疫O型病毒抗原的ELISA检测中的应用。该应用是用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti作为包被抗体，以非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti作为酶标抗体的双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法，检测包括以下步骤：1)用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被微孔板，洗板；2)封闭经包被的微孔板，洗板；3)加待测样品，洗板；4)加辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti，洗板；5)加底物显色；6)终止反应；7)测定OD450值。检测口蹄疫O型病毒抗原的ELISA试剂盒，包括抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体组合，即口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti。进一步，该试剂盒中包括用6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板和用2H10anti和4H9anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。所述用6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mMpH7.2-7.6PBS将6D6anti和1F2anti混合物(6D6anti和1F2anti的质量比为1:1)稀释成0.5-10μg/mL，加入微孔板中，110μl/孔，置于2-8℃过夜，拍干后，加入含1％BSA的10mMpH7.2-7.6PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜，拍干、干燥后真空装入铝箔袋中备用。所述酶标抗体可用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)等标记酶标记抗体2H10anti和4H9anti的混合物(2H10anti和4H9anti的质量比为1:1)，然后用酶标记抗体稀释液(配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5gProclin，3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，酶稳定剂5g，Tween-200.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。)稀释成工作液，工作液的浓度为0.1-1.0μg/mL。所述试剂盒还可进一步包括显色液A液、显色液B液和终止液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液，所述终止液为H2SO4溶液。此外，为方便检测，所述试剂盒还可进一步包括：样品稀释液，如含1％BSA的pH7.2-7.610mMPBS缓冲溶液；洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂。为便于观测结果，所述试剂盒还可进一步包括标准口蹄疫O型病毒阳性对照和标准口蹄疫O型病毒阴性对照，可用样品稀释液作为阴性对照使用。上述检测口蹄疫O型病毒抗原的ELISA试剂盒在口蹄疫疫苗生产过程中的应用也属于本发明，该应用是用所述ELISA试剂盒检测样品中口蹄疫O型病毒抗原浓度，样品包括口蹄疫O型病毒疫苗生产原料、灭活液、浓缩液，或含有口蹄疫O型病毒的多价疫苗(即对口蹄疫多价疫苗中O型病毒毒株的含量检测)。本发明第四个目的是提供一种检测口蹄疫O型病毒抗原的金标纸层析试纸、检测卡或试纸盒。用于检测口蹄疫O型病毒抗原的金标纸层析试纸由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；其中：用单克隆抗体2H10anti和4H9anti包被检测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的单克隆抗体6D6anti和1F2anti。或者，用单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被检测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的单克隆抗体2H10anti和4H9anti。优先的是第一种组合模式。具体的，该抗原检测金标纸层析试纸中，用抗体总浓度为1-5mg/mL的所述非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti包被检测线(T线)，用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白包被质控线(C线)；结合物释放垫上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti。具体的，口蹄疫O型病毒抗原检测金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：1)包被硝酸纤维素膜用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体2H10anti和4H9anti的混合物包被检测线(T线)；用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)，具体操作：用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体2H10anti和4H9anti的混合物(2H10anti和4H9anti的质量比为1:1)、羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3-1.0cm，通常选择0.5cm，37℃干燥6-24小时后备用；2)结合物释放垫的制备2.1用胶体金标记单克隆抗体6D6anti和1F2anti，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入155mL纯化水，煮沸，加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸，再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟，冷却后保存于2-8℃，取1毫升胶体金溶液于离心管中，加入15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min，加入10μl总抗体浓度为1-5mg/ml单克隆抗体6D6anti和1F2anti的混合物(6D6anti和1F2anti的质量比为1:1)，混匀后静置30min，加入10μl20％BSA溶液，平衡5min，加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min，用离心机10000rpm离心10min，去上清液，加入100μl金标复溶液(配方：含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100和0.1％SDS的硼酸缓冲液。)，复溶后备用。2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上包被有胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti混合物，将复溶后的胶体金标记物按1:4稀释后以8μl/cm的速度喷膜，37℃下干燥6-24小时，备用。3)制备抗原检测金标纸层析试纸在PVC背板上先粘贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫，在靠近测试线一端粘贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测口蹄疫O型病毒金标纸层析试纸，然后可按所需大小进行切割，得到用于检测口蹄疫O型病毒抗原金标纸层析测试条，加干燥剂后密封保存。可将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成抗原检测卡，并组装成抗原检测试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。配合免疫层析记录分析仪可实现定量/半定量检测。上述检测口蹄疫O型病毒抗原的金标纸层析试纸、检测卡或试纸盒在口蹄疫疫苗生产过程中的应用也属于本发明，该应用是用所述试纸或试纸盒检测样品中口蹄疫O型病毒抗原浓度，样品包括口蹄疫O型病毒疫苗生产原料、灭活液、浓缩液，或含有口蹄疫O型病毒的多价疫苗(即对口蹄疫多价疫苗中O型病毒毒株的含量检测)。本发明第五个目的是提供一种检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸、检测卡或试纸盒。用于检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸由样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)。原则上，可采用下面两种模式中的任何一种检测待测样品中的抗体水平：1)以口蹄疫O型单克隆抗体4H9anti作为包被抗体包被硝酸纤维素膜，以口蹄疫抗原标记胶体金，此时与待测样品中的抗体形成竞争法检测模式；或者2)以口蹄疫O型抗原作为包被抗原包被硝酸纤维素膜，以口蹄疫O型单克隆抗体4H9anti标记胶体金，此时同样会与待测样品中的抗体形成竞争法检测模式。其中，口蹄疫O型抗原可以采用O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93中的一种或几种组合，推荐采用O/JMS/2000毒株，或者O/GX/09-7株与O/Mya98/BY/2010毒株按质量等比例的混合物。上述两种检测模式中，优选的是第一种模式，用优选方式检测待测样品中的抗体水平的具体过程为：1、包被硝酸纤维素膜用浓度为1-5mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白(IgG，购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)；用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体4H9anti包被检测线(T线)；用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体4H9anti和羊抗兔免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜上，形成相互分离的检测线和质控线，检测线和质控线间距为0.3—0.8cm，通常选择0.5cm。37℃干燥6-24小时后备用。2、结合物释放垫的制备2.1用胶体金标记口蹄疫O型抗原，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入400mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液3.5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液6mL，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入5-15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl浓度为100-1000μg/ml的抗原(例如为O/GX/09-7与O/Mya98/BY/2010混合毒株)，混匀后静置30min。加入10μl20％酪蛋白溶液，平衡5min。加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min；10000rpm，离心10min，弃上清。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、0.5％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。按照同样程序制备兔IgG胶体金标记物。2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上喷有胶体金标记的口蹄疫O型抗原和兔IgG，将复溶后的两种胶体金标记物先按照1:2-1:8分别稀释后，再按照体积比1:1混匀，最后按照6μl/cm的速度喷膜，37℃下放置6-24小时干燥，备用。3、制备抗体检测胶体金试纸在PVC背板上先粘贴硝酸纤维素膜，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫，在靠近检测线一端粘贴结合物释放垫和样品垫，得到用于检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸，然后可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。如将上述步骤制备的试纸条装入塑料卡中，制成抗体检测卡，并组装成抗体检测试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有加样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。配合免疫层析分析记录仪可实现定量检测口蹄疫O型抗体。以上所述检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸、检测卡或试纸盒在检测含有口蹄疫O型病毒疫苗免疫后抗体水平中的应用也属于本发明。该应用是采用竞争法原理检测标本中的口蹄疫O型病毒抗体水平，检测过程包括：将待检样品滴在样品口位置，观测检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带，可以通过与临界值质控血清颜色深浅比较来判断阴、阳性，或通过仪器检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫O型抗体效价水平。如上所述，本发明使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒作为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株6D6和2H10，以及由细胞株6D6分泌得到的特异性单克隆抗体6D6anti、由细胞株2H10分泌得到的非特异性单克隆抗体2H10anti；还使用可以诱发机体产生免疫反应的口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒作为免疫原，采用常规杂交瘤技术经过细胞融合并筛选得到能持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F2和4H9，以及由细胞株1F2分泌得到的特异性单克隆抗体1F2anti、由细胞株4H9分泌得到的非特异性单克隆抗体4H9anti。单克隆抗体6D6anti能够特异性地识别口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒，与口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)、口蹄疫O型(O/JMS/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)、亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)、A型(AF72)病毒无交叉反应，单克隆抗体2H10anti能够非特异性地识别上述O型病毒；单克隆抗体1F2anti能够特异性地识别口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)、口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/JMS/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)病毒，与口蹄疫O型(O/GX/09-7)、亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)、A型(AF72)病毒无交叉反应，单克隆抗体4H9anti能够非特异性地识别上述口蹄疫O型病毒。本发明第一方面提出以6D6anti和1F2anti作为包被抗体组合、以2H10anti和4H9anti作为标记抗体组合用于检测口蹄疫O型常见病毒抗原，结果显示：能够特异性地识别口蹄疫O型(O/GX/09-7)、口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)、口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)、口蹄疫O型(O/JMS/2000)、口蹄疫O型(OZK/93)等病毒，而不识别亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)、A型(AF72)病毒，具有对口蹄疫O型病毒的高特异性、高灵敏度的优点。实验证明，本发明的单克隆抗体组合及其相关产品如口蹄疫O型抗原检测ELISA试剂盒、口蹄疫O型抗原检测金标纸层析试纸，可用以准确检测样品中口蹄疫O型病毒抗原的水平，而不与口蹄疫亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)、A型(AF72)病毒以及口蹄疫病毒宿主细胞蛋白和培养基发生交叉反应；应用本发明提供的4H9anti与O型抗原组成竞争法检测口蹄疫O型抗体，实验显示与中国农业科学院兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA法结果比较，符合率高，操作简单、快速。本发明适用于对上述常见口蹄疫O型病毒抗原及抗体的检测，不仅可用于疫苗生产过程中对样品中病毒抗原的定量检测以监控生产原料、中间物和疫苗成品，也可用于口蹄疫多价疫苗中O型病毒毒株的含量检测，且不受多价疫苗中口蹄疫其它类型(如A型、亚洲1型)毒株的干扰，应用在口蹄疫病毒疫苗生产过程中对O病毒含量的检测以及包含口蹄疫O型病毒疫苗免疫后抗体水平的检测，在疫苗生产、疫苗免疫效果评价中发挥作用。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明图1A为抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti纯度8％的SDS-PAGE电泳检测结果(M表示蛋白Marker；6D6为6D6anti；2H10为2H10anti)；图1B为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性单克隆抗体1F2anti和非特异性单克隆抗体4H9anti纯度8％的SDS-PAGE电泳检测结果(M表示蛋白Marker；BSA表示牛血清白蛋白；1F2表示1F2anti；4H9为4H9anti)；图2A为抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti构象型表位的WesternBlot检测结果(其中M为蛋白Marker，泳道1为6D6anti，泳道2为2H10anti，泳道3为阳性对照)；图2B为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性单克隆抗体1F2anti和非特异性单克隆抗体4H9anti构象型表位的WesternBlot检测结果(其中M为蛋白Marker，泳道1、2和5为阳性对照；泳道3、4为1F2anti；泳道6为4H9anti)；图3A为抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和非特异性单克隆抗体2H10anti的亚型鉴定结果；图3B为抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的特异性单克隆抗体1F2anti和非特异性单克隆抗体4H9anti的亚型鉴定结果；图4A为以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒抗原的标准曲线；图4B为以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)病毒抗原的标准曲线；图4C为以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型(O/JMS/2000)病毒抗原的标准曲线；图4D为以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型(OZK/93)病毒抗原的标准曲线；图4E为以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒抗原的标准曲线；图5A为胶体金纸层析试纸条正面结构图；图5B为胶体金试纸条组装示意图；图6A为用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti制备的金标纸层析试纸检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒抗原的灵敏度检测结果；图6B为用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti制备的金标纸层析试纸检测口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒抗原的灵敏度检测结果；图6C为用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti制备的金标纸层析试纸检测含有口蹄疫O型病毒的疫苗的结果(A、B、C表示三个品牌的口蹄疫疫苗，均含有口蹄疫O型病毒)；图7为用非特异性单克隆抗体4H9anti制备的金标纸层析试纸检测口蹄疫O型病毒抗体的标准曲线。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1、获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞本实施例以口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。具体方法也请参见已公开专利文献CN105348386A。杂交瘤细胞株的获得包括以下步骤：1、动物免疫1)基础免疫：以口蹄疫(O/GX/09-7)病毒(由金宇保灵生物药品有限公司提供)作为免疫原(抗原)，采用蔗糖密度梯度离心法测定，纯度≥85％，浓度10-1000μg/mL。必要时，可用超滤管浓缩病毒抗原以提高病毒含量，浓缩后抗原与福氏完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只BalB/c小鼠(8-12周龄，雌性，SPF级动物培养，购自军事医学科学院实验动物中心)每次注射量为150μg。2)加强免疫：将浓缩后抗原与福氏不完全佐剂(购于Sigma公司)等体积混合并充分乳化，多点皮下注射乳化液，每只BalB/c小鼠每次注射量为200μg。在进行细胞融合前3天，腹腔注射含200μg抗原的生理盐水溶液，以进一步增强免疫效果。2、杂交瘤细胞的制备和筛选用常规方法收集小鼠的脾细胞，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞按10:1的比例在500g/LPEG4000(融合剂，购于Sigma公司)的诱导下进行融合。用HAT(购自生兴生物技术(南京)有限公司)选择性培养液培养，培养条件为5％二氧化碳、37℃。融合后10-15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的杂交瘤细胞株，间接ELISA法的操作步骤为：用110μL浓度为4μg/mL的口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒包板，拍干后，用1％BSA(购于Sigma公司)封闭液封闭，以免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG(购自美国ABCAM公司)100μL，最后测定450nmOD值，以OD450值大于阴性对照2倍为阳性判断依据。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆，具体操作是：1)取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。2)用HT培养液将细胞稀释成200个/mL、40个/mL、20个/mL和的悬液。3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养板，每孔0.05mL，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。4)5％CO2饱和湿度，37℃培养。5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。6)克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3-1/2时，通过间接ELISA法测培养液上清抗体，选择阳性克隆，并传4-6代就可以建成克隆株。3、杂交瘤细胞的获得重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到4株针对口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为2H10、6D6、3E7、3A11。4、杂交瘤细胞所得单抗的效价检测1)细胞培养液上清效价测定：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞培养上清的效价，结果如表1所示，效价为：1:10-1:100，表明待测上清中均存在目标抗体，其中细胞株3E7分泌的单克隆抗体(命名为3E7anti)效价略低。表1杂交瘤细胞培养上清的效价2)小鼠腹水效价测定：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价，结果如表2所示，效价为：1:1000-1:1000000，表明在腹水中均可以检测到目标抗体，其中3E7中略低，其余三种效价均在1：8000以上，具有应用价值。表2杂交瘤细胞培养上清的效价细胞株2H10细胞株6D6细胞株3E7细胞株3A11小鼠腹水效价1:327681:163841:10241:81923)小鼠腹水抗体特异性验证：用间接ELISA法(方法见步骤2)检测上述杂交瘤细胞制备的腹水的特异性，即分别采用口蹄疫不同的毒株包被微孔板，将腹水用pH7.410mMPBS稀释100倍后检测。结果如表3所示，其中细胞株6D6分泌的单克隆抗体(命名为6D6anti)和细胞株3E7分泌的单克隆抗体(命名为3E7anti)为特异性抗体，而细胞株2H10分泌的单克隆抗体(命名为2H10anti)和细胞株3A11分泌的单克隆抗体(命名为3A11anti)两种为非特异性抗体。相比较而言，3E7anti和3A11anti抗体效价较低，故选择6D6anti和2H10anti用于实验和后期检测试剂的开发。表3杂交瘤细胞培养上清的特异性检测5、杂交瘤细胞的传代培养将以上选中的6D6或2H10杂交瘤细胞在含有10％胎牛血清的RPM1640(含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中继续进行培养、传代，培养到第10代后，杂交瘤细胞株仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:50以上，表明获得了能够稳定传代，并可以持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞。6、保存杂交瘤细胞获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须保存一部分杂交瘤细胞，这是因为在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性；另外，在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。保存方法包括以下步骤：1)去掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入含有10％胎牛血清的RPM1640培养基，使细胞悬浮。2)1000r/min离心10min，去上清。细胞沉淀用细胞冻存液(二甲基亚砜：胎牛血清：RPM1640＝1：2：7)复溶制成悬液，浓度5.0×105细胞/mL。3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。具体地：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100mL，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用pH7.410mMPBS稀释至0.4％。制备单细胞悬液，并作适当稀释。将细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度0.04％)。在3分钟内，镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。计算活细胞率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％。4)将细胞无菌分装至1.8mL细胞冻存管(购自浙江拱东医疗科技有限公司)，每瓶0.5mL-1.0mL，拧紧瓶盖。5)细胞冻存：4℃放置2小时，然后-20℃再放置2小时，之后液氮罐气态部分(-70℃)放置2小时，最后转入液氮长期保存。按以上方法以口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为6D6和2H10。其中，能产生特异性单克隆抗体的细胞株6D6已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11196；产生非特异性单克隆抗体的细胞株2H10已于2015年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11195。实施例2、获得持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞本实施例以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株的获得、效价检测方法均与实施例1相同。得到5株针对口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并根据克隆产生位置分别编号为1F2、2B4、5C3、4H9、7F5。细胞培养液上清效价测定结果如表4所示，效价为：1:10-1:120，表明培养上清中均含有目标抗体，其中2B4抗体效价略低。表4杂交瘤细胞培养上清的效价小鼠腹水效价测定结果如表5所示，效价为：1:1000-1:1000000，表明小鼠腹水中均产生了目标抗体，抗体效价除2B4外其余4种均满足需要。表5杂交瘤细胞腹水的效价细胞株1F2细胞株2B4细胞株5C3细胞株4H9细胞株7F5小鼠腹水效价1:327681:10241:81921:655361:65536小鼠腹水抗体特异性验证结果如表6所示，其中特异性抗体为1F2和2B4克隆(不与O/GX/09-7、AF72、Re-A/WH/09、JSL/06反应)，另外三种为非特异性抗体(与表6中的每种病毒均反应)。由于2B4克隆抗体效价较低，故选择1F2抗体和4H9抗体用于ELISA试剂盒和胶体金检测试剂的开发和制备，其中细胞株1F2分泌的单克隆抗体命名为1F2anti，细胞株4H9分泌的单克隆抗体命名为4H9anti。表6杂交瘤细胞培养上清的特异性检测按以上方法以口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒为免疫原免疫小鼠获得的持续、稳定分泌抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为1F2和4H9。其中，能产生特异性单克隆抗体的细胞株1F2已于2015年06月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10896；分泌抗口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H9，已于2016年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12673。实施例3、大量制备抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体一、单克隆抗体的大量制备及纯化1、采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单抗：选择成年BalB/c小鼠，腹腔接种降植烷(免疫抑制剂，可引起炎症反应)，每只小鼠0.5mL。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞6D6或2H10，每只小鼠2×106-3×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。2、抗体纯化：将腹水离心(10000r/min30分钟)，除去细胞成分和其它的沉淀物，收集上清。将上清用15-30倍体积的pH7.2-7.610mMPBS(配方：NaH2PO4·2H2O0.296g，Na2HPO4·12H2O2.9g，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.6)稀释，用ProteinA亲和层析柱(GE公司，货号为29-0491-04)进行亲和纯化，上柱液为pH7.2-7.620mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为pH3.5100mM的柠檬酸缓冲液(配方：一水合柠檬酸21g加入1000mL去离子水中，用5MNaOH或4MHCl调整pH值至3.5)，得到抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体，命名为6D6anti或2H10anti。二、抗体鉴定1、抗体纯度鉴定对抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体6D6anti或2H10anti进行还原性8％SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图1A(泳道M为蛋白分子量标准(kDa)，泳道6D6为单克隆抗体6D6anti，泳道2H10为单克隆抗体2H10anti)所示，单克隆抗体6D6anti和2H10anti的纯度在85％以上，表明纯化抗体的纯度可以满足实际需要。2、抗体构象型表位验证常规WesternBlot检测方法检测抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体6D6anti和2H10anti所针对的表位是构象型(表示表示该抗体针对的抗原位点为空间结构)还是线性(表示表示该抗体针对的抗原位点为线性结构)，方法为：使用150μg灭活口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒进行还原性8％SDS-PAGE电泳，湿转法转至PVDF膜上，使用纯化的单克隆抗体6D6anti和2H10anti进行WesternBlot杂交检测。结果如图2A所示，其中M为蛋白分子量标准(kDa)，泳道1为单克隆抗体6D6anti，泳道2为单克隆抗体2H10anti，泳道3为阳性对照(具体为在单克隆抗体制备过程中产生免疫小鼠的阳性尾血，属于多克隆抗体，见实施例1)，根据本次实验结果显示单克隆抗体6D6anti和2H10anti为构象型表位，提示该抗体对可能只与天然状态的抗原反应，如抗原发生裂解、蛋白变性可能不反应。在疫苗质量控制上有应用意义。2、抗体类及亚类鉴定使用北京五康新兴科技有限公司生产的胶体金亚型鉴定测试卡检测、鉴定杂交瘤细胞6D6和2H10分泌的抗口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒的单克隆抗体6D6anti和2H10anti的抗体亚型。结果如图3A(从上至下分别为6D6anti和2H10anti)所示，两种抗体均为IgG型，其中单克隆抗体6D6anti为IgG1；单克隆抗体2H10anti为IgG2a。三、单克隆抗体6D6anti和2H10anti的可变区序列测定提取杂交瘤细胞6D6和2H10的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR扩增片段插入到T载体内进行DNA序列测定。DNA序列测定结果：编码单克隆抗体6D6anti的基因(6D6anti)，其重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：3所示，其轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：4所示；编码单克隆抗体2H10anti的基因(2H10anti)，其重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：7所示，其轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：8所示。将获得的DNA序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。6D6anti的重链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：1所示，轻链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：2所示；2H10anti的重链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：5所示，轻链可变区的氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：6所示。上述序列在NCBI数据库进行比对后未显示有相同序列。实施例4、大量制备抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体一、单克隆抗体的大量制备及纯化1、采用动物体内诱生单克隆抗体法大量制备单抗：选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷(免疫抑制剂，可引起炎症反应)，每只小鼠0.5mL。7-10天后腹腔接种第16代杂交瘤细胞1F2或4H9，每只小鼠2×106-3×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。2、抗体纯化：将腹水离心(10000r/min30分钟)，除去细胞成分和其它的沉淀物，收集上清。将上清用15-30倍体积的pH7.2-7.610mMPBS(配方：NaH2PO4·2H2O0.296g，Na2HPO4·12H2O2.9g，双蒸水定溶至1000mL，测定pH值为7.2-7.6)稀释，用ProteinA亲和层析柱(GE公司，货号为29-0491-04)进行亲和纯化，上柱液为pH7.2-7.620mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为pH3.5100mM的柠檬酸缓冲液(配方：一水合柠檬酸21g加入1000mL去离子水中，用5MNaOH或4MHCl调整pH值至3.5)，分别得到用杂交瘤细胞1F2或4H9的抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体，对应命名为1F2anti或4H9anti。二、抗体鉴定1、抗体纯度鉴定对抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti或4H9anti进行还原性8％SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图1B(泳道M为蛋白分子量标准(kDa)，泳道1F2为单克隆抗体1F2anti，泳道4H9为单克隆抗体4H9anti)所示，单克隆抗体1F2anti和4H9anti的纯度在85％以上，表明纯化抗体的纯度可以满足实际需要。2、抗体构象型表位验证常规WesternBlot检测方法检测抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti和4H9anti所针对的表位是构象型(表示表示该抗体针对的抗原位点为空间结构)还是线性(表示表示该抗体针对的抗原位点为线性结构)，方法为：使用150μg灭活口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒进行还原性8％SDS-PAGE电泳，湿转法转至PVDF膜上，使用纯化的单克隆抗体1F2anti和4H9anti进行WesternBlot杂交检测。结果如图2B所示，其中M为蛋白分子量标准(kDa)，泳道3和4为单克隆抗体1F2anti，泳道1、2和5为阳性对照(具体为在单克隆抗体制备过程中产生免疫小鼠的阳性尾血，属于多克隆抗体，见实施例1)，泳道6为4H9anti。从该图看出，单克隆抗体1F2anti和4H9anti为构象型表位。2、抗体类及亚类鉴定使用北京五康新兴科技有限公司生产的胶体金亚型鉴定测试卡检测、鉴定杂交瘤细胞1F2和4H9分泌的抗口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒的单克隆抗体1F2anti和4H9anti的抗体亚型。结果如图3B(从上至下分别为1F2anti和4H9anti)所示，两种抗体均为IgG型，单克隆抗体1F2anti和单克隆抗体4H9anti均为IgG1。三、单克隆抗体1F2anti和4H9anti的可变区序列测定提取杂交瘤细胞1F2和4H9的mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR扩增片段插入到T载体内进行DNA序列测定。DNA序列测定结果：编码单克隆抗体1F2anti的基因(1F2anti)，其重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：11所示，其轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：12所示；编码单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti)，其重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：15所示，其轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQIDNo：16所示。将获得的DNA序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。1F2anti的重链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：9所示，轻链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：10所示；4H9anti的重链可变区氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：13所示，轻链可变区的氨基酸残基序列如序列表中的SEQIDNo：14所示。上述序列在NCBI数据库进行比对后未显示有相同序列。实施例5、用单克隆抗体6D6anti和1F2anti、2H10anti和4H9anti及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型病毒抗原本实施例提供了所述单克隆抗体组合在口蹄疫O型病毒的ELISA检测中的应用，是用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti作为包被抗体，以非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti作为酶标抗体的双抗夹心ELISA检测，包括以下步骤：1)用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被微孔板，洗板；2)封闭经包被的微孔板，洗板；3)加待测样品，洗板；4)加辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti，洗板；5)加底物显色；6)终止反应；7)测定OD450值。一、以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体检测不同浓度的常见口蹄疫O型病毒(O/Mya98/BY/2010、O/Mya98/XJ/2010、O/JMS/2000、OZK/93、O/GX/09-7)抗原以特异性6D6anti和1F2anti为包被抗体，以非特异性2H10anti和4H9anti为标记抗体，采用下述方法可以实现特异性检测目标抗原。检测包括以下步骤：1)将单克隆抗体6D6anti和1F2anti按质量比1:1混合，用pH7.2-7.610mMPBS缓冲溶液稀释成总抗体浓度4μg/mL(0.5-10μg/mL均可)，向微孔板的每孔加110μL，4℃下包被过夜；2)倾去包被液，拍干，然后在每孔中加入300μL1％BSA(在pH7.2-7.610mMPBS缓冲溶液中)，放入4℃封闭过夜后，拍干、干燥，保存；3)采用过碘酸钠法和辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体2H10anti和4H9anti的等质量混合物，得到2H10/4H9anti-HRP，用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释成工作液备用。HRP酶标记方法具体为：称取3mgHRP溶解于1mL蒸馏水中。于上液中加入0.12mL新配的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mMpH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加30μl0.2MpH9.5碳酸盐缓冲液，使透析后的HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入溶解在1mL0.01M碳酸盐缓冲液中的4mg的2H10anti和4H9anti等质量混合物，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.12mL新配的5mg/mLNaBH4溶液，混匀，再置4℃2小时。将上述溶液装入透析袋中，对0.01MpH7.2PBS透析，4℃过夜。取出后加入等体积优质甘油，分装，-20℃保存，即为2H10/4H9anti-HRP。用酶标记抗体稀释液按照一定比例稀释即为酶标记抗体工作液。酶标记抗体稀释液的配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5gProclin，3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，酶稳定剂5g(购自上海西宝生物科技有限公司)，Tween-200.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。4)向微孔板中分别加入口蹄疫O型病毒(O/Mya98/BY/2010)、O型病毒(O/Mya98/XJ/2010)、O型病毒(O/JMS/2000)、O型病毒(OZK/93)、O型病毒(O/GX/09-7)梯度稀释液100μL/孔，各组病毒浓度均为10个稀释度，依次为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、2.0ng/ml，并设立阴性对照(样品稀释液)两孔，37℃温育1小时；5)用PBST洗液(配方：Na2HPO4·12H2O58g，NaH2PO4·2H2O5.92g，NaCl170g，Tween-205.0mL，Proclin3000.6mL，用双蒸水定溶至1000mL，调整pH值为7.2-7.6；使用前用双蒸水稀释20倍)洗板5次后，再加入2H10/4H9anti-HRP标记物(1:1000-1:8000稀释)100μL/孔，37℃温育0.5小时；6)用PBST洗板5次后加入显色液A(配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定溶至1000mL。)、显色液B(配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定溶至1000mL。)各50μL/孔进行显色，37℃避光温育15min；7)加入终止液(配方为：1000mL双蒸水中含有98％的硫酸27.8mL)，50μL/孔，震荡混匀，读数OD450。检测结果如表7所示，可以看出6D6anti和1F2anti(包被)-2H10anti和4H9anti(标记)配对可以检测出表7中的多种O型病毒毒株，避免了对口蹄疫O型毒株的漏检。表明这种抗体组合检测口蹄疫O型病毒抗原具有较好的广谱性，优于之前专利申请CN105348386A中提到的抗体组合方式。表7以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型病毒抗原二、以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型常见病毒，以确定检测方法的灵敏度。检测方法参照本实施例第一部分。检测方法的灵敏度判断标准：≥阴性对照平均值的2倍的最低浓度值。根据表7结果显示，以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体对于口蹄疫O型不同的毒株具有不同的检测灵敏度，且其标准曲线范围也略有不同，具体灵敏度和标准曲线范围如表8所示。口蹄疫不同毒株的标准曲线如图4A、图4B、图4C、图4D、图4E所示(横坐标表示以10为底的浓度的对数，纵坐标表示以10为底的OD值的对数)。虽然该抗体组合对口蹄疫O型不同的毒株检测灵敏度和标准曲线范围不同，但是最低检测值均在31.3ng/ml以下，显示该抗体组合具有较好的灵敏度，能够实现高灵敏度的检测。表8以6D6anti和1F2anti为包被抗体以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型不同毒株的灵敏度和标准曲线范围口蹄疫O型毒株灵敏度(ng/ml)标准曲线范围(ng/ml)O/Mya98/BY/2010＜15.615.6～500O/Mya98/XJ/2010＜15.615.6～500O/JMS/2000＜7.87.8～500OZK/93＜31.331.3～500O/GX/09-7＜3.93.9～62.5三、以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型病毒抗原的特异性验证以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型病毒抗原，为确认该方法的特异性，用口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)、A型病毒(AF72)、亚洲1型(JSL/06)病毒、宿主细胞(BHK)蛋白(由金宇保灵生物药品有限公司提供)、宿主细胞培养基(由金宇保灵生物药品有限公司提供)等为特异性对照样品，以O/GX/09-7和O/Mya98/BY/2010为阳性对照。其中，各病毒、蛋白均用样品稀释液稀释成1000ng/mL(样品稀释液配方：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，硫酸庆大霉素2支(8万单位/支)，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。过滤除菌，2-8℃保存)，检测方法同本实施例第一部分。结果：以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体检测，口蹄疫亚洲1型(JSL/06)病毒、口蹄疫A型病毒(Re-A/WH/09)、口蹄疫A型(AF72)病毒、宿主细胞蛋白、宿主细胞培养基检测结果呈阴性(OD值≤阴性对照平均值的2倍)，无交叉反应，而口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒和口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒检测结果呈强阳性(OD值≥阴性对照的2倍)，说明以单克隆抗体以6D6anti和1F2anti为包被抗体、以2H10anti和4H9anti为标记抗体，采用ELISA双抗体夹心两步法能够特异性地识别口蹄疫O型病毒，与亚洲1型(JSL/06)、A型(Re-A/WH/09)、A型(AF72)病毒、宿主细胞蛋白、宿主细胞培养基等无任何交叉反应。详细数据见表9。表9以6D6anti和1F2anti为包被抗体以2H10anti和4H9anti为标记抗体及ELISA双抗体夹心两步法检测口蹄疫O型病毒抗原的特异性结果实施例6、检测口蹄疫O型病毒抗原的ELISA试剂盒本实施例提供一种检测口蹄疫O型病毒抗原的ELISA试剂盒，简称ELISA抗原检测试剂盒，包括抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体组合，即口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和4H9anti。具体的，ELISA抗原检测试剂盒中包括用6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板和用2H10anti和4H9anti作为酶标抗体的酶标记抗体工作液。以单克隆抗体6D6anti和1F2anti作为包被抗体，以2H10anti和4H9anti为标记抗体，用ELISA双抗体夹心法检测口蹄疫O型病毒抗原的试剂盒包括以下试剂：1)预包被微孔板：预先用特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti作为包被抗体包被的微孔板指的是用10mMpH7.2-7.6PBS将6D6anti和1F2anti的混合物(6D6anti和1F2anti的质量比为1:1)稀释成总抗体浓度4μg/mL(0.5-10μg/mL均可)，加入微孔板中，110μl/孔，置于2-8℃过夜，拍干后，加入含1％BSA的10mMpH7.2-7.6PBS，300μl/孔，置于2-8℃过夜，拍干、干燥后真空装入铝箔袋中，每个试剂盒一块96孔的预包被微孔板(微孔板购自厦门怡佳美实验器材有限公司)。2)酶标记抗体工作液：预先用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酯酶(ALP)标记的2H10anti和4H9anti混合物(2H10anti和4H9anti的质量比为1:1)，并用酶标记抗体稀释液稀释成合适浓度作为工作液，通常为0.1-1.0μg/mL，每个试剂盒10.0mL。酶标记抗体稀释液配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，酶稳定剂5g(购自上海西宝生物科技有限公司)，Tween-200.25mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。3)样品稀释液：用于标准品和待测样品的稀释，其配方为：Na2HPO4·12H2O2.9g，NaH2PO4·2H2O0.296g，NaCl8.5g，Proclin3000.6mL，BSA10g，胎牛血清150mL，硫酸庆大霉素2支(8万单位/支)，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。过滤除菌，2-8℃保存。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。可作为阴性对照或阴性样品使用。4)洗涤液：为20倍的浓缩洗液，使用前20倍稀释。其配方为：Na2HPO4·12H2O58g，NaH2PO4·2H2O5.92g，NaCl170g，Tween-205.0mL，Proclin3000.6mL，用双蒸水定容至1000mL，调整pH值为7.2-7.6。每个试剂盒1瓶，25mL/瓶。5)显色液A：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：无水乙酸钠4.5g，冰醋酸1.2mL，过氧化脲0.8g，用双蒸水定容至1000mL。6)显色液B：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。显色液B配方为：柠檬酸1.62g，EDTA-2Na0.372g，甘油100mL，四甲基联苯胺盐酸盐0.50g，用双蒸水定容至1000mL。8)终止液：每个试剂盒1瓶，7mL/瓶。配方为：1000mL双蒸水中含有98％硫酸27.8mL。9)标准口蹄疫O型病毒阳性对照：O/GX/09-7或O/Mya98/BY/2010，每个试剂盒1瓶，1mL/瓶。该检测口蹄疫O型病毒抗原的ELISA试剂盒可用于对样本中口蹄疫O型病毒抗原进行定性和定量检测。利用该ELISA抗原检测试剂盒对口蹄疫疫苗生产过程中的口蹄疫O型病毒抗原进行检测，这些抗原包括灭活液、浓缩液以及成品疫苗(多价疫苗)，检测方法同实施例5。由于口蹄疫O型不同的毒株灵敏度不同，需要分别制备标准曲线，各自按照自身标准曲线计算浓度。另外，成品疫苗在检测前先进行破乳，破乳方法如下：取疫苗100ml，缓慢加入分析纯的正戊醇10ml。充分混匀30秒，置于2-8℃,30分钟。5000rpm离心5分钟，可见油、水分离，取下层水相检测。表10用ELISA抗原检测试剂盒检测口蹄疫O型病毒抗原的含量(ng/ml)表10中，浓缩液均是用灭活液浓缩10倍制成。O/GX/09-7样品用O/GX/09-7的标准曲线计算浓度；O/Mya98/BY/2010样品用O/Mya98/BY/2010标准曲线计算浓度；成品疫苗由金宇保灵生物药品有限公司提供，为口蹄疫三价疫苗，含有口蹄疫A型抗原(Re-A/WH/09)、亚洲1型抗原(JSL/06)和口蹄疫O型抗原(O/Mya98/BY/2010)。传统方法指的是目前疫苗生产厂家在用的蔗糖密度梯度离心法。从表10可以看出，该ELISA抗原检测试剂盒能够用于检测口蹄疫O型毒株抗原，配合标准曲线，可实现定量检测。口蹄疫疫苗生产商在生产时，通常采用蔗糖密度梯度离心法进行定量，该法需要高速离心机、成本高，且操作复杂，常需要3天以上的时间才可以定量，但是依然无法区分不同亚型的病毒，因此不能用蔗糖密度梯度离心法对实验中的口蹄疫多价疫苗中的O型病毒单独定量，根据金宇保灵生物药品有限公司提供的信息显示，该疫苗中含O型病毒5000-5500ng/ml，用本发明ELISA抗原检测试剂盒检测结果与其一致。从另外4份样品看，用本发明ELISA抗原检测试剂盒检测结果与对照方法基本一致。可见，采用双抗体夹心ELISA法可以在2个小时内对疫苗生产过程中的各种病毒液、成品疫苗中的口蹄疫O型病毒进行定量，其操作简单、快速，显示本发明ELISA抗原检测试剂盒的使用价值。实施例7、用单克隆抗体6D6anti和1F2anti、2H10anti和4H9anti及金标纸层析试纸(卡、盒)检测口蹄疫O型病毒抗原1、制备金标纸层析试纸如图5所示(图5A为金标纸层析试纸的正面结构图，图5B为金标纸层析试纸的组装示意图)，用于检测口蹄疫O型病毒的胶体金试纸由PVC背板①、吸水垫②、硝酸纤维素膜③、样品垫④、结合物释放垫⑤共五部分组成，硝酸纤维素膜③上设有检测线(T线)⑥和质控线(C线)⑦。金标纸层析试纸的制备方法包括以下步骤：1)包被硝酸纤维素膜③用抗体总浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体2H10anti和4H9anti等质量混合物包被检测线(T线)，用浓度为1-5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白(购自京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。具体操作为：用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将用作包被抗体的单克隆抗体2H10anti和4H9anti混合物(2H10anti和4H9anti的质量比为1:1)、羊抗鼠免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)③上，形成相互分离的检测线⑥和质控线⑦，质控线和测试线间距一般为0.3-1.0cm，优选0.5cm,37℃干燥6-24小时备用。2)结合物释放垫⑤的制备2.1用胶体金标记单克隆抗体6D6anti和1F2anti，方法为：在磁力加热搅拌下，向三角瓶中加入155mL纯化水，煮沸，加入1％四氯化金溶液5mL，煮沸，再加入1％柠檬酸三钠溶液7mL，煮沸5分钟，即为胶体金溶液，冷却后保存于2-8℃，取1毫升胶体金溶液于离心管中，加入15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min，加入10μl6D6anti和1F2anti混合物(6D6anti和1F2anti的质量比例1:1)，混匀后静置30min，加入10μl20％BSA溶液，平衡5min，加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min，用离心机10000rpm离心10min，去上清液，得到6D6/1F2anti-胶体金。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、1％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100和0.1％SDS的硼酸缓冲液。)，复溶后备用。2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上标记有胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti。将复溶后的6D6/1F2anti-胶体金用金标复溶液1:4稀释后以8μl/cm的速度喷膜，37℃下干燥6-24小时备用。3)制备金标纸层析试纸在PVC背板①上先粘贴硝酸纤维素膜③，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫②，在靠近测试线一端粘贴结合物释放垫⑤和样品垫④，得到用于检测口蹄疫O型病毒金标纸层析试纸，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。如将上述步骤制备的测试条装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试纸盒，该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样口(图5A中S处)，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗(图5B中C/T处)。本例的金标纸层析试纸、测试卡或试纸盒用于检测口蹄疫O型病毒抗原，简称金标纸层析抗原检测试纸、金标纸层析抗原检测测试卡或金标纸层析抗原检测试纸盒。2、金标纸层析抗原检测试纸(卡、盒)的使用金标纸层析试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫④即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫⑤时使干片上的胶体金标记单克隆抗体6D6anti和1F2anti复溶，并带动其向硝酸纤维膜③渗移。若样本中有待测特异抗原(阳性样本)，其可与胶体金标记单克隆抗体6D6anti和1F2anti结合，此抗原抗体复合物流至检测线⑥即被固相抗体2H10anti和4H9anti所获，在膜上显出红色检测线条(T线)。过剩的胶体金标记单克隆抗体6D6anti和1F2anti继续前行，至质控线⑦与羊抗鼠免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。反之，若样本中无待测特异抗原(阴性样本)，则无检测线条(T线)，而仅显示质控线条(C线)。如果检测线(T线)与质控线(C线)均不显色或仅检测线(T线)显色，则表示金标纸层析试纸(卡)失效。金标纸层析测试卡和试纸盒的使用方法：检测时，取待检样品2滴，滴在试纸盒的点样口，根据观测窗内的检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带来确定样品中是否存在口蹄疫O型病毒。3、用金标纸层析试纸(卡、盒)检测不同浓度的口蹄疫O型(O/GX/09-7)和口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒抗原金标纸层析抗原检测试纸(卡、盒)用胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被结合物释放垫，用单克隆抗体2H10anti和4H9anti包被检测线(T线)，用其检测不同浓度(浓度分别为120、60、30、15、5ng/mL)的口蹄疫O型(O/GX/09-7)和口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒，以评价试纸盒的灵敏度。检测结果显示：检测口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)灵敏度可达30ng/mL(参见图6A)；检测口蹄疫O型(O/GX/09-7)灵敏度可达15ng/mL(参见图6B)，表明该产品具有较好的灵敏度,具有实际应用价值。4、用金标纸层析试纸(卡、盒)检测口蹄疫O型疫苗中O型病毒抗原金标纸层析试纸(卡、盒)(用胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被结合物释放垫，用单克隆抗体2H10anti和4H9anti包被检测线(T线)，用其检测含有O型口蹄疫病毒的疫苗(多价疫苗)，由于疫苗中含有乳化剂，疫苗需要先进行破乳。疫苗破乳方法：取疫苗1ml，加入0.1ml正戊醇，充分震荡30秒后，静止30分钟。取下层水相用胶体金测试卡检测。用胶体金抗原测试卡(金标纸层析试纸卡、盒)检测显示，三个厂家的疫苗均为阳性，显示均含有口蹄疫O型病毒，结果见图6C(A、B、C表示三个品牌的口蹄疫疫苗)。猪场、牛场在注射口蹄疫疫苗前，通常无法了解疫苗中是否含有口蹄疫O型病毒以及大概含量。本发明金标纸层析抗原检测试纸(卡、盒)能够给口蹄疫疫苗的使用者提供一种定性判断疫苗中口蹄疫O型病毒的方法，如配合商品化的免疫层析分析记录仪(如北京北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100型号的免疫层析分析记录仪)，则可进行特定病毒抗原的定量检测。5、用抗原检测金标纸层析试纸(卡、盒)检测口蹄疫攻毒病猪的水泡皮疫苗在生产时，常常需要做动物实验以评价疫苗保护效果，动物实验首先需用口蹄疫活病毒感染猪等动物，猪发病后常取水泡皮进行PCR检测以定性分析被免疫动物是否成功感染有口蹄疫病毒以评价疫苗。PCR检测方法对仪器设备、实验人员要求较高，不利于推广和普及。用本例所述金标纸层析试纸盒(用胶体金标记的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti包被结合物释放垫，用单克隆抗体2H10anti和4H9anti包被检测线(T线))检测病猪的水泡皮样品，这些样品经过PCR方法确认，其中口蹄疫O型病毒阳性样品23份，口蹄疫O型阴性样品25份。样品处理：如同PCR检测，胶体金方法检测前也需要对水泡皮进行处理，处理方法如下：取水泡皮1g，用剪刀剪碎后，加入pH7.2-7.610mMPBS1毫升，充分研磨后取上清检测。检测方法：取待检样品2滴，滴在试纸盒的点样口，根据观测窗内的检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带来确定样品中是否存在口蹄疫O型病毒。结果显示，用该胶体金测试卡检测23份PCR阳性样品，22份为阳性；25份PCR阴性样品全部为阴性，两种方法总符合率为97.9％(见表10)。由于本发明方法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，因此在快速判断免疫动物是否感染病毒方面非常有优势，具有实际应用价值。表11金标纸层析抗原检测试纸检测病猪水泡皮中O型病毒的结果实施例8用单克隆抗体4H9anti制备胶体金试纸的胶体金竞争法检测疫苗免疫后口蹄疫O型抗体的效价口蹄疫疫苗免疫后通常通过检测口蹄疫抗体的效价来评价疫苗的免疫效果。本实施例使用单克隆抗体4H9anti制备胶体金试纸，以胶体金竞争法检测疫苗免疫后口蹄疫O型抗体的效价，用以评价疫苗的免疫效果。该试纸称为抗体检测胶体金试纸。1、制备抗体检测胶体金试纸如图5B所示，用于检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸由PVC背板①、吸水垫②、硝酸纤维素膜③、样品垫④、结合物释放垫⑤共五部分组成，硝酸纤维素膜③上设有检测线(T线)⑥和质控线(C线)⑦。抗体检测胶体金试纸的制备方法包括以下步骤：1)包被硝酸纤维素膜③用浓度为1-5mg/mL的单克隆抗体4H9anti包被检测线(T线)；用浓度为1-5mg/mL的羊抗兔免疫球蛋白(购自北京博尔西科技有限公司)包被质控线(C线)。用BIODOT公司XYZ3000喷膜机将单克隆抗体4H9anti和羊抗兔免疫球蛋白分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Millipore公司)③上，形成相互分离的检测线⑥和质控线⑦，质控线和检测线间距一般为0.3-0.8cm，优选0.5cm,37℃干燥6-24小时备用。2)结合物释放垫⑤的制备2.1用胶体金标记口蹄疫O型病毒抗原，方法为：在磁力搅拌下，向三角瓶中加入400mL纯化水，煮沸。加入1％四氯化金溶液3.5mL，煮沸。再加入1％柠檬酸三钠溶液6mL，煮沸5分钟。冷却后保存于2-8℃。取1毫升胶体金溶液于离心管中。加入5-15μl0.2M碳酸钾溶液，室温静止5min。加入10μl浓度为100-1000μg/ml的口蹄疫O型抗原，混匀后静置30min。加入10μl20％酪蛋白溶液，平衡5min。加入10μl20％PEG20000溶液，平衡30min；10000rpm，离心10min，弃上清。加入100μl金标复溶液(含有2％蔗糖、0.5％酪蛋白、0.5％BSA、0.1TritonX100、0.1％SDS的硼酸缓冲液)，复溶后备用。按照同样程序制备兔IgG胶体金标记物。其中：口蹄疫O型抗原可以采用O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93中的一种或几种组合，推荐采用O/JMS/2000毒株，或者O/GX/09-7与O/Mya98/XJ/2010的混合物。2.2制备结合物释放垫：结合物释放垫的材质为玻璃纤维膜，其上喷有胶体金标记的口蹄疫O型病毒抗原和兔IgG。将复溶后的两种胶体金标记物分别1:2-1:8稀释后，再按体积比1:1混匀，然后按照6μl/cm的速量喷膜，37℃下放置6-24小时干燥，备用。3)制备胶体金试纸条和检测卡在PVC背板①上先粘贴硝酸纤维素膜③，在靠近硝酸纤维素膜质控线的一端粘贴吸水垫②，在靠近检测线一端粘贴结合物释放垫⑤和样品垫④，得到用于检测口蹄疫O型病毒抗体的胶体金试纸，然后可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。如将上述步骤制备的试纸条装入塑料卡中，制成检测卡，并组装成试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗(图5A)。本例的金标纸层析试纸、测试卡或试纸盒用于检测口蹄疫O型病毒抗体，称金标纸层析抗体检测试纸、金标纸层析抗体检测测试卡或金标纸层析抗体检测试纸盒。2、抗体检测胶体金试纸条(卡、盒)的使用胶体金试纸条的使用方法：将样品垫端浸入样品中，样品垫④即吸取液体向上端移动，流经结合物释放垫⑤时使干片上的胶体金标记物复溶，并带动其向硝酸纤维膜③渗移。若样本中无口蹄疫O型抗体，此时，胶体金标记的抗原将与固定在检测线⑥的4H9anti反应，形成红色检测线。随着样品中的口蹄疫O型抗体逐渐增多，红色检测线将逐步变浅直至消失。不论有无口蹄疫O型抗体，胶体金标记的兔IgG继续前行，至质控线⑦与羊抗兔免疫球蛋白(固相二抗)结合，而显出红色质控线条(C线)。如无红色质控线出现，则表示胶体金试纸失效。胶体金检测卡和试纸盒的使用方法：检测时，取待检样品2滴，滴在检测卡的点样口，静止20分钟。根据观测窗内的检测线(T线)的颜色深浅来判断是否存在口蹄疫O型抗体。如配合使用免疫层析分析记录仪(如北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100型号的免疫层析分析记录仪)来读取检测线的灰度值(即颜色深浅程度)，则可进行定量检测口蹄疫O型抗体的效价水平。3、口蹄疫O型病毒抗体胶体金竞争法检测疫苗免疫后样品收集用口蹄疫O型病毒疫苗免疫后的猪血清，分别用本抗体检测试纸盒和中国农业科学院兰州兽医研究所的液相阻断ELISA试剂盒进行检测。1)以1:64为临界值定性评价两种检测方法的符合率共收集236份血清样品，其中大部分样品采于注射口蹄疫疫苗1个月以上。口蹄疫疫苗免疫后抗体效价达到1:64及以上被认为具有较好的保护作用，因此以1:64为临界值判断抗体阴阳性。其中抗体效价低于1:64(比如1:32)判为阴性；高于或等于1:64判为阳性(比如1:128)。检测前，首先确定抗体效价为1:64的血清在本发明检测卡上显示的检测线的颜色深浅。选择10份口蹄疫O型抗体阳性血清(液相阻断ELISA方法检测抗体效价＞1:64且＜1:128)等体积混合。然后用液相阻断ELISA方法检测抗体效价，为准确确定该混合样品抗体效价水平，检测时采用更密集的稀释方法稀释，比如1:65、1:70、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:105、1:110、1:115、1:120、1:125。根据ELISA结果选择一个合适的稀释比例1：M，使1:M为阳性，1：(M+5)为阴性。计算该混合血清的准确效价＝1：(M+2.5)。用10mMpH7.2-7.6的PBS稀释成1:64效价的抗体样品，稀释倍数为(M+2.5)/64。以稀释后的样品抗体效价为1:64。用胶体金测试卡检测该样品，其颜色深浅代表着临界值的颜色深浅。若待测样品检测线的颜色比临界值的颜色深，说明其抗体效价低于1:64；否则高于1:64。本发明涉及到的1:64的临界值血清，可统一制备，然后分装成小份，保存于-20℃，每次取用一支，作为临界值的质控血清样品使用。采用该方法定性检测收集到的236份样品，统计分析两种方法的阴性符合率和阳性符合率，结果见表12。表12显示，胶体金检测试剂与液相阻断ELISA方法总体符合率高，具有应用价值。表12用4H9anti制成的胶体金检测卡与兰州兽医研究所液相阻断试剂盒比较胶体金/液相阻断ELISA临界值阳性符合率91.7％1:64阴性符合率92.3％1:64总符合率91.9％1:642)胶体金定量检测随机选择以上定性检测呈阳性样品10份，用抗体检测胶体金试纸盒检测并用读卡仪(北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100型号的免疫层析分析记录仪)进行定量测量，同时与中国农业科学院兰州兽医研究所生产的液相阻断ELISA试剂盒对照，结果见表13。胶体金定量检测标准曲线见图7(四参数模型，X轴为抗体效价的倒数，Y轴为信号值)。FMDV-Ab竞争方程为：y＝(579.7850+4.5573)/[1+(x/13.5239)^0.9690]–4.5573表13用4H9anti制成的胶体金检测试剂(定量法)与兰州兽医研究所液相阻断试剂盒比较检测结果显示，胶体金配套读卡仪能够准确测量口蹄疫O型病毒的抗体水平(液相阻断ELISA方法通常只能提供一个抗体水平的范围，比如1:64-1:128)，与液相阻断ELLISA试剂盒检测结果在抗体效价高低水平上基本保持一致，并且操作简单、快速、方便。因此本产品将在口蹄疫疫苗免疫效果评价上具有非常广泛的用途。4、用单克隆抗体4H9anti制成的口蹄疫O型病毒抗体胶体金检测卡与兰州兽医研究所液相阻断ELISA方法比较，见表14。从表14可以看出，胶体金竞争法检测口蹄疫O型抗体，操作简单、储存、运输方便，且成本低，非常适合现场或小型养殖场使用。表14胶体金竞争法与液相阻断ELISA方法比较当前第1页1 2 3