本发明涉及一种抗血清制备方法，具体为锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用。
背景技术：
锦鲤疱疹病毒病(KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(KHV)感染引起的鲤鱼、锦鲤及其变种的一种传染性和急性病毒病。该病感染所有年龄段的鲤鱼和锦鲤，引起严重疾病和死亡，死亡率高达80％～90％。目前已知发生或进境鱼发生KHVD的国家和地区至少有22个，如奥地利、比利时、丹麦、法国、意大利、卢森堡、荷兰、波兰、瑞典、英国、中国、中国香港、中国台湾、印度尼西亚、日本、韩国、马来西亚、新加坡和泰国。其他地方，如南非和美国曾报道发生KHVD。锦鲤疱疹病毒病(KHVD)被世界动物卫生组织(OIE)列为鱼类必报疫病，并发布诊断标准(《水生动物疫病诊断手册》)，已多次改版，该病在我国《进境动物检疫疫病名录》中被列为二类传染病。
该病诊断方法主要是用分子生物学方法，如PCR或实时定量PCR，或者在某些情况下用细胞培养分离病毒，但后者敏感性较差，而且OIE《水生动物疾病诊断手册》推荐至少使用2种方法监测和诊断KHV感染。但对于体内病毒含量非常低的病毒携带鱼，用上述方法进行检测则非常困难。因此研发出可用于检测鱼血清中KHV抗体的诊断试剂对于有效监测KHVD非常必要，特别是对于那些高价值的不能进行致死性诊断的观赏鱼(如锦鲤)尤为重要。
根据国外已有文献报道，KHVD已建立多种免疫学诊断方法，并有商品化抗KHV血清。这些抗血清的制备主要分为两种方法获得：
(1)通过克隆表达，获得病毒表达蛋白，免疫实验动物，获得抗血清；
(2)直接对病毒进行纯化，获得抗原，用抗原免疫实验动物，获得抗血清。
(3)通过以上两种方法获得表达蛋白或抗原，制备单克隆抗体。
该技术仅在国外有相关研究，我国国内未有相关技术的研究；另外该技术免疫实验动物需要制备大量纯化抗原；相关抗血清等试剂均需要从国外进口，国内没有生产单位，进口成本高。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明提供一种成本低的锦鲤抗KHV抗血清制备方法。
具体技术方案为：
锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，包括以下过程：
(1)、免疫动物准备
选健康锦鲤免疫动物，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm；接种前于室温环境下养殖不少于一周，定期少量喂食；
接种前，尾静脉采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用；
(2)、免疫接种
取纯化的锦鲤疱症病毒抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL；接种后，定期小量喂食，并保持水体环境；
接种后第14天，尾静脉采血，分离血清测效价，每隔2周，采血测效价，剔除血清效价无变化的锦鲤；
第10～12周，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。
所述的血清测效价的方法，为间接ELISA测血清效价，包括以下过程：
用包被液将纯化的锦鲤疱症病毒抗原稀释至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃2h；包被液包括8.4g/L的NaHCO3、3.56g/L的Na2CO3，pH9.5；
每孔加260μL PBST洗板3次，PBST的pH8.0；
用含10％脱脂奶粉PBST分别将抗血清和阴性血清进行10倍倍比稀释，即分别为1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200，每种血清每个稀释度加2孔，每孔100μL，25℃环境下1h，洗板3次；
加入稀释兔抗鲤鱼IgM-HRP，每孔100μL，25℃环境下1h，洗板3次；
每孔加入底物TMB溶液100μL，25℃孵育20min，每孔加入1N硫酸溶液100μL终止反应，酶标仪测量OD450；相同稀释度下，当抗血清OD450值不高于1.0，阴性血清OD450值不高于0.2，即为血清效价。
纯化的锦鲤疱症病毒抗原，是通过密度梯度离心法或者沉淀法、分子筛法获得。
本发明获得的锦鲤疱疹病毒抗血清，用于免疫印迹、IFAT、ELISA等方法检测KHV抗原，并可作为KHV抗体检测方法的阳性血清。目前，还没有用于免疫学检测KHV或KHV抗体的商品化试剂盒，本发明获得的抗血清也可用于组装上述方法的检测试剂盒。
本发明提供的锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，具有以下技术效果：
(1)、抗血清制备简单
获得纯化抗原后，一次性接种规定浓度抗原，不需要进行多次免疫，即可获得高效价血清。
(2)、抗血清制备成本低
使用抗原量少，节省大量抗原增殖、纯化的成本：浓度为1mg/mL纯化KHV抗原，与等量不完全弗氏佐剂混合后，取0.2mL接种锦鲤，抗原用量仅为0.1mg。
接种程序简单，节省抗原用量和免疫佐剂：本技术方案只需要接种一次实验动物锦鲤，不需要多次接种。
实验室动物易于获得、养殖成本低：本技术方案实验动物为锦鲤，相对于家兔、山羊、绵羊等实验动物，价格低，实验室养殖简单。
(3)、制备的抗血清填补国内空白
目前国内没有生产KHV抗血清的单位，基本依靠进口，成本高，不利于KHV免疫学诊断方法的推广使用，本专利提供了一种简单而有效的KHV抗血清制备方法。
本发明提供的锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法，建立了锦鲤抗KHV抗血清制备方法，获得了高效价抗血清，获得的抗血清可用于IFAT、ELISA等方法进行KHV抗原检测和作为阳性血清用于KHV抗体的检测。为国内开展KHV或KHV抗体免疫学诊断提供了程序化的抗血清制备方法，可提供成品化的免疫学诊断试剂。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
具体实施方式
结合实施例说明本发明的具体实施方式。
如图1所示，锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法：
(1)、免疫动物准备
选健康锦鲤免疫动物，来源于无锦鲤疱疹病毒病(KHVD)发病历史的养殖场，未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗，体重为150～350g，体长15～25cm。接种前于室温环境下(水温不超过30℃)养殖不少于一周，定期少量喂食。接种前，尾静脉少量采血，分离血清，作为阴性血清，冷冻保存备用。为防止接种期间锦鲤出现死亡而无法获得抗血清，并考虑需要获得的血清量，接种锦鲤数量不少于4尾。
(2)、免疫接种
取密度梯度离心法纯化的锦鲤疱症病毒(KHV)抗原，含量不低于1mg/mL，50℃水浴1min灭活，与等量不完全佐剂混合，背部皮下多点注射，每条鱼注射0.2mL。接种后，定期小量喂食，并保持水体环境。
接种后14天后，尾静脉少量采血，分离血清测效价，之后，每隔2周，采血测效价，期间密切注意血清效价变化情况，及时剔除血清效价无变化的锦鲤。
约10～12周，血清效价达到顶峰(之后血清效价逐步下降)，当血清效价达到顶峰时，心脏或尾静脉大量采血，分离血清，测效价，分装冷冻保存。
(3)、测效价为间接ELISA测血清效价
如表1，用包被液(8.4g/L NaHCO3，3.56g/L Na2CO3，pH9.5)将密度梯度纯化KHV抗原稀释至0.5μg/mL，加入酶标板，每孔100μL，37℃2h。每孔加260μL PBST(pH8.0)洗板3次。用含10％脱脂奶粉PBST分别将抗血清和阴性血清(免疫前获得的血清)进行10倍倍比稀释(1：10、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200)，每种血清每个稀释度加2孔，每孔100μL，25℃1h，洗板3次。加入稀释兔抗鲤鱼IgM-HRP(市售商品)，每孔100μL，25℃1h，洗板3次。每孔加入底物TMB溶液100μL，25℃孵育20min，每孔加入1N硫酸溶液100μL终止反应，酶标仪测量OD450。相同稀释度下，当抗血清OD450值1.0左右，阴性血清OD450值不高于0.2，即为血清效价。
表1酶标板加样示意图
(4)、应用
本发明获得的抗血清可用于免疫印迹、IFAT、ELISA等方法检测KHV抗原，并可作为KHV抗体检测方法的阳性血清。
本发明获得的抗血清也可用于组装上述方法的检测试剂盒。