专利名称:一种锦鲤疱疹病毒lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术领域：
，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法。
背景技术：
1998年5月在以色列的Magan Michael地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，同年成功分离出了病原锦鲤疱疫病毒(Koi herpes virus, KHV),为疱疫病毒科(Herpesviridae),鲤疱疫病毒属(Cyprinid herpesvirus)成员，又称鲤疱疫病毒III型(CyHV-1II)。锦鲤疱疫病毒病迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至我国，近年来给我国框镜鲤、鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。
目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、PCR、ELISA、原位杂交技术等，聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。但是这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。
环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号W000/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的KHV毒株的TK基因编码区序列(DQ177346)，应用PrimerExplorer V4(http://primerexplore r. jp/elamp4. O. 0/index, html)在线软件设计特异性引物,利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对锦鲤疱疹病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。
本发明的另一个目的是在于提供了一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞(例如Ko1-Fin细胞)，非常适用于KHV的现场快速检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分
该试剂盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBRGreen I (Invitrogen)0
F3 :5，-GCATCGCCGTCAAGCAC-3，；[0011]B3 :5’-GCAGCTGCACGACTCC-3’ ；
FIP :5’-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3’ ；
BIP :5’-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3’。
一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是
1、病毒DNA的获取
采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。
2、LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和B3各 O.1 μ M，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl22-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。选择55_65°C的温度范围和30-120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。
3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000X SYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则`结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法(最佳条件)，其步骤是
1、病毒DNA的获取
采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。
2、LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ L·反应管于62°C温育60分钟进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。
3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点
1、特异性好，能有效检测出锦鲤疱疹病毒；
2、快速高效，检测时间约I小时，非常适用于KHV的现场快速检测；[0035]3、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；
4、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000XSYBR Green I,可提高结果的灵敏度。
图1为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。
从左至右的泳道依次为空白对照(水)、鳗疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型、GSIV、KHV、DL2,OOOMarker0
图2为一种锦鲤疱疹病毒LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。
从左至右的泳道依次为Ifg KHVUOfg KHVUOOfg KHVUpg KHVUOpg KHVUOOpgKHVUng KHV, DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。
实施例1 :
一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分
该试剂盒它包括以下成分10X ThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBRGreenI (Invitrogen)。
F3 :5，-GCATCGCCGTCAAGCAC-3，；
B3 :5’-GCAGCTGCACGACTCC-3’ ；
FIP :5’-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3’ ；
BIP:5’-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3’ 。
实施例2
锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化
一、取待检样品提取病毒DNA:
培养锦鲤鳍条细胞系(Ko1-Fin)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O.1的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的锦鲤疱疹病毒细胞毒材料(朱霞，李新伟，王好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33(5) :340-343.)添加 10 μ L 的 Polybrene (终浓度 10μ g/ml)，置于 26°C 培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL2%胎牛血清(V/V)的培养液，置26°C培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80 V至室温(20-25 V )反复冻融3次,50001'/111；[11离心30111；[11,取上清25(^ I,用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-20°C保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. ΙμΜ, dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。
其中Mg2+的浓度分别为2、4、6、8和10mM。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于62°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示Mg2+的浓度为8mM时结果最好。
实施例3
锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法反应温度的优化
一、取待检样品提取病毒DNA:
待KHV感染的Ko1-Fin细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次,50001'/111；[11离心30111；[11,取上清25(^ I,用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10 X ThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I，去离子水补足余量。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管分别置于60、61、62、63、64、65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ l扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示62°C时结果最好。
实施例4
锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法的特异性
一、取待检样品提取病毒DNA:
GSIV(中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO: V201134)感染的EPC细胞、鳗疱疹病毒(F Rijsewijk, S Pritz-Verschuren, SKerkhoff, A Botter, M ffillemsen, T Nieuwstadt, OHaenen. 2005.Development of a polymerase chain reaction for the detection ofAnguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene.Journal of Virological Methodsl24:8794.)感染的 EPC 细胞、KHV 感染的 Ko1-Fin 细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同KHV)，鲤疱疹病毒2型检测阳性的病鱼组织的PBS匀浆液，于_80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250 μ 1，用ViralDNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于62°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。[0078]四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对KHV设计的特异LAMP引物组能保证对KHV的特异性检测，只检测出KHV，而GSIV、鳗疱疹病毒、鲤疱疹病毒2型和空白对照均无法检出(图1)。
实施例5
锦鲤疱疹病毒LAMP检测方法的灵敏度
一、取待检样品提取病毒DNA:
待KHV感染的Ko1-Fin细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次,50001'/111；[11离心30111；[11,取上清25(^ I,用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。临用前测定样品浓度，用灭菌水调整并制备10倍稀释的系列模板0. 2ng/ μ I至O. 2fg/ μ I。
二、LAMP 扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPs ImM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于62°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示能够检测到Ipg的KHV (图2)。
权利要求
1.一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 该试剂盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction缓冲液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ;外引物卩3和83、内引物？1卩和81卩、86七&11^，]/%(12，1000/3￥81 Green I;
F3 :5’_ GCATCGCCGTCAAGCACB3 :5’_ GCAGCTGCACGACTCC -3’ ；
FIP 5'-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACABIP 5'-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC2.利用权利要求
1所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是 1)、病毒DNA的获取 采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA ； 2)、LAMP扩增 采用25μ I反应体系内引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O.1 μ Μ，dNTPsImM, BetaineO. 5M, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPolReaction Buffer 2. 5 μ 1，选择 55-65。。和 30-120 分钟进行 LAMP 反应之后，80°C灭活 2 分钟； 3)、检测结果判定，采用下述三种方式之一 A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性； B、每25μ I体系的反应管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性； C、取扩增产物，用2%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
3.根据权利要求
2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于=MgCl2的浓度为8mM。
4.根据权利要求
2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于反应温度为62°C。
5.根据权利要求
2所述的一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其特征在于模板DNA在95°C 5分钟后置于冰浴中的预处理。
专利摘要
本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法，一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分10×ThermoPol Reaction缓冲液；Bst DNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBR Green I。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞，非常适用于KHV的现场快速检测。
文档编号C12Q1/70GKCN103060475SQ201310019401
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月18日
发明者曾令兵, 张辉, 周勇, 徐进, 范玉顶 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan