专利名称:纽虫重组铁结合蛋白及制备方法
技术领域：
本发明涉及重组铁结合蛋白，具体涉及纽虫重组铁结合蛋白及纽虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法。
背景技术：
铁结合蛋白(铁蛋白)是 一种具有储存数千铁离子和数百磷分子能力的蛋白质，其分子结构被认为是由高度对称性亚基所组合的蛋白质，外壳可以包裹着由铁磷化合物组成的铁核。铁核结构起着供给和存储铁的“仓库作用”，铁蛋白的蛋白壳上含有两种横跨蛋白壳的隧道，即三相(X.Y.Z)物质交换隧道和电子隧道，前者的作用供无机磷铁及其他小分子进出，后者的功能起着接收及传递电子的作用。脊椎动物的铁蛋白由两种不同类型的亚基组成，即H和L亚基，L型亚基与H型亚基相互作用使氧化型铁矿化为一个铁核。。目前大部份是脊椎动物的重组铁蛋白，如申请号为CN为200510048963.X的发明专利申请就公开了利用基因工程技术，通过人乳铁蛋白基因的克隆、重组杆状病毒的构建、家蚕体内表达和人乳铁蛋白纯化得到重组人乳铁蛋白。也有无脊椎动物的重组铁蛋白，如公开号为CN102051363的发明专利申请，则公开了文蛤铁蛋白基因、编码蛋白、体外重组产物等，通过文蛤RNA提取和纯化、cDNA构建及铁蛋白基因的筛选、RACE获得铁蛋白基因序列，再利用铁蛋白基因进行PCR扩增、克隆至表达载体、转化至大肠杆菌、LB培养剂培养、菌体用鸡蛋清溶菌酶处理、超声破碎、从包涵体体中纯化得到目的蛋白。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纽虫重组铁结合蛋白及纽虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，该重组纽虫铁结合蛋白具有存储铁功能外，还具有富集重金属和有机磷的功能。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:纽虫重组铁结合蛋白，该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
纽虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，其步骤如下:
a、RNA提取:取纽虫体壁80-100mg速冻于液氮中,研磨成粉,用RNAisoplus 提取试剂盒提取得到纽虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作；
b、cDNA合成:将纽虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物:5’ C、重组质粒:对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系:上述阳性克隆质粒l.0yL, 10XPCR 缓冲液 2.5 μ L，浓度 25mM 的 MgCl2L 5 μ L，浓度 IOmM 的 dNTP2.5yL，浓度ΙΟμΜ的正向引物1.0μ L，浓度ΙΟμΜ的反向引物1.0μ L，浓度5U/μ L的DNA聚合酶 0.2μ L，超纯水 15.3μ L ;扩增条件:94°C 4 min,94°C lmin、58°C lmin、72°C Imin，共35个循环，最后72°C延伸10 min ;其中正向引物序列为5’-ACGCAAGCTT TTAAGAAGAGTTCCTT-3’，反向引物序列为 5’ -CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT-3’，扩增产物经 QIAquickGel Extraction纯化试剂盒纯化后,再用I和III内切酶酶切,酶切产物与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒，重组质粒转化至E.Cb7i BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50 μ g/mL的LB培养液中，37 °C、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6^0.8时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为lmmol/L，37°C诱导表达3_6h，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4°C保存；
d、蛋白纯化:细菌沉淀物用IX磷酸缓冲液漂洗，再在4°C、12000 r/min离心5min，得漂洗后细菌沉淀物，每克漂洗后细菌沉淀物中加入5ml的I X磷酸缓冲液，混匀后4°C下，用450W超声波，超声破碎lOmin，12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200 μ L缓冲液B，0.5 μ L β -巯基乙醇和4 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置lh，12000 r/min离心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠10 μ L，轻微混勻30min, 12000 r/min离心10s,去上清得到镍珠-铁合结蛋白沉淀，10毫克镍珠-铁合结蛋白沉淀中加入250 μ L缓冲液C和5 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L缓冲液E和5 μ L浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的纽虫重组铁结合蛋白；所述缓冲液B的pH为8.0，所述缓冲液B含有浓度为IOOmM的NaH2PO4，浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为6M的盐酸胍；所述缓冲液C的pH为6.3，所述缓冲液C含有浓度为IOOmM的NaH2PO4,浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素；所述缓冲液E的pH为4.5，所述缓冲液E含有浓度为IOOmM的NaH2PO4，浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素。
与现有技术相比，本发明的优点在于纽虫重组铁结合蛋白及制备方法，该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示；该纽虫重组铁结合蛋白是从纽虫体壁中，通过RNA提取，再合成为cDNA，对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒，阳性克隆质粒扩增、酶切后，与载体连接培育得到重组质粒，重组质粒培育后破碎及蛋白纯化得到纽虫重组铁结合蛋白；该方法得到的纽虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白，用N1-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高，铁结合蛋白结合铁能力较好，还具有富集重金属和有机磷的作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例
RNA提取:取纽虫体壁80_100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus提取
试剂盒(购于Takara公司)提取得到纽虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作:体壁研磨成粉后，加入RNAiso裂解液，样品与裂解液的重量体积比为1:15-20，匀浆，室温下静置5分钟，4°C，12000 rpm,离心5min，取第一上清液，加入氯仿，上清液与氯仿的体积比为4-5:1，待溶液充分乳化后，室温下静置5min，4°C，12000 rpm/min离心15min，得第二上清液，加入异丙醇，第二上清液与异丙醇的体积比为1:1，室温下静置lOmin, 4°C, 12000 rpm/min 离心 IOmin,弃上清，沉淀用 75% 乙醇振荡洗漆,4°C, 12000 rpm/min离心IOmin,干燥沉淀就得纽虫RNA ；
cDNA合成:将纽虫RNA用cDNA试剂盒(购于Takara公司)合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增,上游引物:5’1.0 μ L，10 μ M的反向引物1.0 μ L，5U/μ L的DNA聚合酶0.2 μ L，超纯水15.3 μ L，总体积 25.Ομ L ;扩增条件:94°C 4 min, 94 °C lmin、58°C lmin、72°C Imin ,共 35 个循环，最后72°C延伸10 min ;正向引物序列为5’-ACGCAAGCTT TTAAGAAGAG TTCCTT-3’，反向引物序列为 5’-CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT-3’，扩增产物经QIAquick Gel Extraction纯化试剂盒(购于QIAquick公司)纯化后,再用I和III内切酶酶切,酶切产物(dz ferritin)与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒(pET-28 a ( + ) /dz ferritin),重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50 μ g/mL的LB培养液中，37°C、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6、.8时，加入IPTG使其终浓度为lmmol/L，37°C诱导表达3-6h (4小时为好)，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4°C保存；正反向引物是根据已克隆到的铁合结蛋白cDNA序列设计，重组质粒阳性筛选和测序用常规方法进行；
蛋白纯化:细菌沉淀物用IX磷酸缓冲液(PBS)漂洗，再在4 °C、12000 r/min离心5min，每克漂洗后的细菌沉淀物中加入5ml的I XPBS，混匀后4°C下，用450W超声波，超声破碎IOmin, 12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200 μ L缓冲液Β，0.5 μ LP-巯基乙醇和4 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置lh，12 000 r/min离心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠(N1-NTA) 10 μ L，轻微混匀30min，12000 r/min离心10s，去上清得到N1-NTA-铁合结蛋白沉淀，10毫克N1-NTA-铁合结蛋白沉淀中加入250 μ L缓冲液C和5 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心IOs,去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L缓冲液E和5 μ L浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的纽虫重组铁结合蛋白；其中缓冲液B的pH为8.0，缓冲液B含有浓度为IOOmM的NaH2PO4,浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，浓度为6M的盐酸胍；缓冲液C的pH为6.3，缓冲液C含有浓度为IOOmM的NaH2PO4,浓度为IOmM的Tris，浓度为8M的尿素；缓冲液E的pH为4.5，缓冲液E含有浓度为IOOmM的NaH2PO4,浓度为IOmM的Tris，浓度为8M的尿素。
上述引物由上海生工合成，BamH I和Hind III，载体pMD18_T，载体pET_28a(+)，E.Coli BL21(DE3)，E.Coli DH5 α等载体、酶，购于宝生物工程(大连)有限公司，地址:辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，联系电话:0411-87641681, 87641683。10XPCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶，LB平板培养基，LB培养液，PBS,镍珠等市售。
试验例
蛋白结合铁能力:以BSA作为空白对照，将纽虫铁结合蛋白和牛血清白蛋白配成浓度为I μ g/mL, 2 μ g/mL, 4 μ g/mL, 6 μ g/mL系列溶液，各取ImL的溶液，分别加入20 μ L的2mMFeCl2溶液,22°C反应IOmin,再加入40 μ L的5mM ferrozine,再反应15min后用分光光度计在波长为562nm处测其吸光值；其中空白对照的吸光值为1.3，I μ g/mL的纽虫铁结合蛋白的吸光值为1.3, 2 μ g/mL的纽虫铁结合蛋白的吸光值为1.15,4 μ g/mL的纽虫铁结合蛋白的吸光值为0.6，6 μ g/mL的纽虫铁结合蛋白的吸光值为0.4，从中可以看出纽虫铁结合蛋白具有结合铁能力。
对重金属的富集:ImL浓度为2 μ g/mL牛血清白蛋白为空白样观察，再在三份ImL浓度为2μ g/mL纽虫铁结合蛋白中分别加入20μ L的2mM FeCl2、20 μ L的2mM CuCl2与20yL的2mM CdCl2, 22°C培养Ih后观察，观察用的是美国Veeco公司的原子力显微镜，使用轻敲(Tapping)模式观察；观察用探针型号为NSCll (三角形悬臂，MikroMash公司)，弹性常数为50 N/m,共振频率为330 kHz，扫描速率为I 1.5 Hz，观察结果显示Ferritin空白样，绝大部分蛋白都是 分散较好的单个蛋白分子，直径10(T300nm，加入Fe2+、Cu2+、Cd2+的Ferritin空间结构发生变化，单个蛋白分子之间相互作用并连接成网状，加入Fe2+后的蛋白直径约为300 700nm，加入Cu2后的蛋白直径为400 1000 nm，加入Cd2后的蛋白对镉核进行团聚装富集包裹，蛋白的直径约为40(Tll00nm。说明纽虫铁结合蛋白可以富集金属离子。同样方法也可以看到纽虫铁结合蛋白对有机磷有富集作用。
权利要求
1.虫重组铁结合蛋白，其特征在于该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1 所示。
2.权利要求
1所述的纽虫重组铁结合蛋白的制备方法，其特征在于步骤如下: a、RNA提取:取纽虫体壁80-100mg速冻于液氮中,研磨成粉,用RNAisoplus提取试剂盒提取得到纽虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作； b、cDNA合成:将纽虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列为 AAGGGCATGA AGGTCCAAGA GGG,下游引物序列为 GTGGAAGCCA TCAGGGAA ； PCR扩增体系:CDNA文库质 粒1.0yL，10XPCR缓冲液2.5 μ L，浓度25mM的MgCl22.0 μ L，浓度IOmM的dNTP2.Ομ L，浓度10 μ M的上游引物1.0 μ L，浓度10 μ M的下游引物1.0 μ L，浓度5U/yL的 DNA聚合酶(λ 2μ L，超纯水:15.3μ L ;扩增条件:94°C 5 min、94°C 30 s、58°C 3sO、72°C Imin，共35个循环，最后72°C延伸10 min ;扩增反应后，用回收试剂盒回收PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.DH5 α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8_12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒； C、重组质粒:对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系:上述阳性克隆质粒l.0yL, 10XPCR 缓冲液 2.5 μ L，浓度 25mM 的 MgCl2L 5 μ L，浓度 IOmM 的 dNTP2.5 μ L，浓度ΙΟμΜ的正向引物l.0yL，浓度ΙΟμΜ的反向引物l.0yL，浓度5U/yL的DNA聚合酶(λ 2μ L，超纯水 15.3μ L ;扩增条件:94°C 4 min, 94 °C lmin、58°C lmin、72°CImin，共35个循环，最后72°C延伸10 min ;其中正向引物的核苷酸序列为ACGCAAGCTTTTAAGAAGAG TTCCTT，反向引物序列为 CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT，扩增产物经 QIAquickGel Extraction纯化试剂盒纯化后,再用I和III内切酶酶切,酶切产物与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒，重组质粒转化至E.Cb7i BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50 μ g/mL的LB培养液中，37 °C、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6^0.8时，加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为lmmol/L，37°C诱导表达3_6h，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4°C保存； d、蛋白纯化:细菌沉淀物用IX磷酸缓冲液漂洗，再在4°C、12000 r/min离心5min，得漂洗后细菌沉淀物，每克漂洗后细菌沉淀物中加入5ml的I X磷酸缓冲液，混匀后4°C下，用450W超声波，超声破碎lOmin，12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200 μ L缓冲液B，0.5 μ L β -巯基乙醇和4 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置lh，12000 r/min离心IOmin保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠10 μ L，轻微混勻30min, 12000 r/min离心10s,去上清得到镍珠-铁合结蛋白沉淀，10毫克镍珠-铁合结蛋白沉淀中加入250 μ L缓冲液C和5 μ L浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25 μ L缓冲液E和5 μ L浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID N0.1所示的纽虫重组铁结合蛋白；所述缓冲液B的pH为8.0，所述缓冲液B含有浓度为IOOmM的NaH2PO4，浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为6M的盐酸胍；所述缓冲液C的pH为6.3，所述缓冲液C含有浓度为IOOmM的NaH2PO4,浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素；所述缓冲液E的pH为4.5，所述缓冲液E含有浓度为IOOmM的NaH2PO4，浓度为IOmM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素。
专利摘要
本发明公开了纽虫重组铁结合蛋白及制备方法，该纽虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；该纽虫重组铁结合蛋白是从纽虫体壁中，通过RNA提取，cDNA合成，对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒，阳性克隆质粒扩增、酶切后，与载体连接培育得到重组质粒，重组质粒培育后破碎及蛋白纯化得到纽虫重组铁结合蛋白；该方法得到的纽虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白，用Ni-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高，铁结合蛋白结合铁能力较好，还具有富集重金属和有机磷的作用。
文档编号C12N15/12GKCN103087186SQ201310018470
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月18日
发明者苏秀榕, 周君, 李晔, 张春丹, 李成华, 刘艳, 李振, 张云云 申请人:宁波大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan