一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及 其应用。
【背景技术】
[0002] 锦鲤作为观赏鱼的一个大类，体型优美、色彩艳丽，在国内已大量养殖，是目前休 闲渔业的主要品种。随着养殖环境越来越恶劣，锦鲤的各种传染性疾病例如鲤春病毒血症、 疱疹病毒性乳头瘤、锦鲤疱疹病毒病等开始广泛传播，亟需各种疫病检测方法的建立，而抗 锦鲤免疫球蛋白IgM单克隆抗体的成功制备将为锦鲤各种疫病的免疫学诊断提供重要材 料。
[0003] 抗体是脊椎动物的免疫系统在抗原的刺激下，由淋巴细胞所产生的可与相应的抗 原发生特异性结合的免疫球蛋白，哺乳动物中已经报道的免疫球蛋白包括:免疫球蛋白Μ (IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)，鱼 类虽然是低等的脊椎动物，但是其免疫系统同样可以产生不同类型的免疫球蛋白，硬骨鱼 类中已经报道的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT，IgM是一类存在于所有有颂类脊椎动 物中的抗体。
[0004] 当前，对于锦鲤疱疹病毒的检测，最为常用的方法是基于PCR扩增技术的各种分子 生物学检测方法，具有较高的敏感性和特异性。但这些分子生物学方法都是检测病毒的核 酸存在与否，方法单一，经常导致假阳性和假阴性结果，难于对该病做到定量检测与确诊。 因此，急需其它方法来弥补分子生物学检测方法的不足，如各种免疫学(血清学)检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供一株杂交瘤细胞株A5-E10,已于2016年1月14日保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C2015218。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种由上述保藏编号为CCTCC N0:C2015218的杂交瘤 细胞株分泌产生的抗锦鲤免疫球蛋白IgM单克隆抗体。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体，其可特异性识别锦鲤免疫球蛋白IgM，效价 高于1:10000。所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2015218的杂交瘤细胞株分泌产 生。
[0009] 一株杂交瘤细胞株，已于2016年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE C0LLECTI0N，CCTCC)，保藏编号为CCTCC N0:C2015218,保藏地 址为：中国，武汉，武汉大学。
[0010] 上述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤免疫球蛋白IgM的免疫检测工具中的应 用。
[0011] 上述的单克隆抗体在制备用于检测锦鲤疱疹病毒的免疫检测工具中的应用。
[0012] 所述免疫检测工具包括试剂、试剂盒、芯片或试纸。
[0013] 一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒，其包括上述的抗锦鲤免疫球蛋白IgM的 单克隆抗体。
[0014] 所述试剂盒中还包括:包被液、标准血清、洗涤液、HRP标记羊抗鼠抗体、TMB显色液 和终止液。
[0015] 一种锦鲤疱疹病毒间接ELISA检测方法，包括如下步骤： (1) 加样:将待检样品加入包被有KHV病毒的酶标板中； (2) 温育：用封板膜封板后置36~38°C温箱中孵育 (3) 洗涤:将样品从每个孔中吸出，用PBST洗涤； (4) 加入鼠抗锦鲤IgM抗体:将稀释好的抗锦鲤免疫球蛋白IgM的单克隆抗体加入上述 步骤(3)洗涤好的酶标板中； (5) 温育、洗涤，同步骤(2)和(3); (6) 加入二抗:将稀释好的HRP标记羊抗鼠抗体加入上述步骤(5)中洗涤好的酶标板中； (7) 温育、洗涤，同步骤(2)和(3); (8) 显色:往反应孔中加入TMB显色剂，36~38°C避光显色； (9) 测定及结果判断。
[0016] 本发明的有益效果是： 本发明的杂交瘤细胞株及所分泌的抗锦鲤IgM单克隆抗体具有以下优点： 1) 本发明的杂交瘤细胞株由SP2/0细胞骨髓瘤细胞与免疫了锦鲤免疫球蛋白IGM的小 鼠脾细胞融合而获得； 2) 该杂交瘤细胞株能够无限增殖并持续产生抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体； 3) 本发明的抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体可以特异性识别锦鲤免疫球蛋白IGM; 4) 本发明的抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体特异性强效价高。
【附图说明】
[0017] 图1为纯化的锦鲤免疫球蛋白的SDS-PAGE胶检测图（1为Marker，2为锦鲤IgM)。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0019] 实施例1抗锦鲤免疫球蛋白IGM单克隆抗体的制备和纯化 材料与方法 实验材料 试验锦鲤来源于中国水产科学研究院珠江水产研究所，体长20cm;其他化学试剂为分 析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。
[0020] 1锦鲤IgM纯化 1.1断尾采取锦鲤血液，置于玻璃管中，于室温下凝固，先于37°C下放置2h，再于4°C放 置过夜，待血清充分析出后，3000g/min离心10min,取其上清。
[0021] 1.2纯化:将鱼血清12000rpm离心20 min，取上清;对上清液测量体积;边搅拌边慢 慢加入饱和硫酸铵溶液到上清液中，至最终饱和度为33%;将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过 夜(4°C)，使蛋白质充分沉淀;蛋白质溶液10000 rpm离心30min(4°C)，将上清移至干净管 中，沉淀用适量的1XTOS溶解，放入透析袋(8000-14000kd)在1XPBS透析24-48小时(4°C)， 每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸铵;透析后溶液5000rpm离心10min，上 清转到干净管中，并取小样备用;在之前的硫酸铵沉淀离心上清溶液中，继续缓慢添加饱和 硫酸铵至饱和度为50%;将溶液放在磁力搅拌器上搅拌过夜(4°C)，使蛋白质充分沉淀;蛋白 质溶液10000 rpm离心30min(4°C)，将上清移至干净管中，沉淀备用；将沉淀溶于少量 1XPBS中，沉淀溶解后放入透析袋在lXroS透析24-48小时(4°C)，每隔3-6小时换透析缓 冲液一次，以彻底除去硫酸铵;透析之后的溶液5000rpm离心10min，取上清转到干净管中， 并取小样备用;对两次饱和度的留取小样进行电泳检测;之后将50%硫酸铵沉淀的透析上清 过Protein A柱进行纯化(通过填料和上清混合后于摇床上摇晃反应4h)。
[0022] 1.3纯化后IgM的检测:通过SDS-PAGE电泳检测血清中IgM的纯化效果，样品与等体 积样品缓冲液混合后后，100°C沸水水浴3-5min，经离心后上样。分离胶浓度为12%，电泳电 压为100V，电泳时间为lh，电泳后用考马斯亮蓝染色。
[0023] 检测结果表明，经Protein A亲和层析柱纯化的样品进行SDS-PAGE检测，得到大小 约为75kD与25kD的两条带，与预期的锦鲤IgM重链和轻链分子量相近。
[0024] 2动物免疫 以上述纯化的锦鲤IgM为特异性抗原免疫6周龄BALB/c小鼠，取6只6周龄雌性BALB/c小 鼠皮下注射抗原，第一次免疫将抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，l〇〇ug /只；两周后进行第 二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，50ug /只；两周后进行第三次免疫， 免疫方法及剂量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠断尾采血测其效价，第三次免疫两 周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞 融合。
[0025] 3小鼠融合 3.1小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞融合 将生长状态良好的SP2/0细胞，吹打下来后，lOOOrpm离心5min;弃去上清，用20-40ml预 热的1640培养液重悬，lOOOrpm离心5min;重复上述步骤;弃去上清，加入适量预热的1640培 养液重悬沉淀;取50ul细胞悬液与150ul台盼蓝混匀后，于显微镜下检活计数;每个融合取1 X107个细胞，与处理好的1X108个脾细胞在进口的50ml离心管中混合均匀后，1350rpm离心 7min;用抽液栗抽干上清;有节奏的在超净台桌面上敲打离心管底部，使沉淀松动呈糜状； 沿着离心管底部的管壁，缓慢加入lml预热的PEG，并用枪头顺时针方向搅拌，同时离心管保 持逆时针方向转动。该步骤需在60-90s内完成;将离心管静置30-60s;沿管壁缓慢滴加5ml 预热的1640培养液，再逐渐加快速度，加入15ml预热的1640培养液，再加入20ml SP2/0骨髓 瘤细胞培养液；1200rpm离心5min;弃去上清，将细胞重悬至100ml预热的含15% FBS 1*HAT 的1640细胞培养液中，100ul/孔的量将混合细胞悬液铺到96孔细胞培养板上。然后将培养 板置37°C 5% C02培养箱内培养;5 d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10 d后用预热 的HT换出HAT;观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积 的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测，两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。 [0026] 3·2多克隆细胞株的ELSIA检测 包板：用Coating buffer稀释抗原至lug/ml，以50ul/孔的量铺到酶标板上，轻轻振摇 使包被液铺满孔底，4°C包被过夜;次日弃去包被液，用TOST以200ul/孔洗1遍，在吸水纸上 拍干； 封闭：以60ul/孔加入1% BSA，37°C封闭lh; 一抗(加样）:将稀释好的样品以50ul/孔加入到酶标板上，同时设置好阳性对照与阴性 对照(对照组需做复孔），37°C作用lh;用PBST以200ul/孔清洗2遍； 二抗：用1%BSA稀释HRP标记的羊抗鼠二抗，1:10000稀释，以50ul/孔