P8降糖肽的设计及其用途的制作方法

本发明涉及药学及医学相关领域，特别涉及糖尿病(包括1型及2型糖尿病)及其并发症的预防和治疗；具体地说，本发明涉及一种新型肽和其用途，以及含有该新型肽及其衍生物和类似物的药物制剂，能用于预防和治疗人糖尿病及其并发症。

背景

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合征，目前认为遗传和环境的相互作用是主要诱因，但是其发病机理尚未完全明确。糖尿病可分为4型：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他类型糖尿病。1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)是一种自身免疫性疾病，由于对自身抗体耐受性的丧失使胰岛β细胞损伤，机体无法产生足够的胰岛素，胰岛素绝对缺乏，引起血糖升高，故患者一旦发病需终生注射胰岛素。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)，又被称之为非胰岛素依赖糖尿病，缘于β细胞功能低下，胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。近年来，2型糖尿病的患病率逐渐增加，据世界卫生组织预测，2030年，全球将有3亿2型糖尿病患者。目前，针对2型糖尿病的治疗药物主要是口服降糖药和胰岛素。虽然该类药物能有效降低血糖，并改善患者症状，但仍然存在低血糖和体重增加等缺陷。此外，随着糖尿病病程的延长，该类药物均不能阻止患者β细胞的恶化。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由胰高血糖素原基因编码，后经加工修饰得到的30个氨基酸的肠降血糖素(incretin)。主要由小肠黏膜的L细胞合成并分泌，在胰岛的α细胞也有表达。GLP-1具有两种生物活性形式，GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，血液循环中主要以GLP-1(7-36)酰胺的活性形式存在，两者具有共同的生物学活性。

天然人GLP-1的稳定性较差，易被二肽基肽酶IV(DPPIV)降解，并快速被肾脏清除，其半衰期t1/2≤2min。GLP-1经DPPIV切割掉N末端His-Ala，生成GLP-1(9-36)氨基多肽，最初研究认为，GLP-1(9-36)氨基多肽不具有生物学活性，而且对GLP-1受体(GLP-1R)还具有一定的拮抗作用，近些年发现GLP-1(9-36)氨基多肽具有类胰岛素的作用。

GLP-1的生理作用主要包括三个部分，一是通过与GLP-1R结合，发挥生理学效应，包括：①葡萄糖依赖性促胰岛素分泌；②抑制胰高血糖素分泌；③延迟胃排空，降低食欲，减少饮食，控制体重；④抑制β细胞凋亡，促进β细胞增值和分化。二是，GLP-1经过DPPIV降解，生成GLP-1(9-36)氨基多肽，能够抑制肝脏糖异生酶和脂肪酸合酶的表达，抑制糖异生和肝脏脂肪合成，发挥类胰岛素作用。三是GLP-1(9-36)氨基多肽经过肽链内切酶(NEP 24.11)切割成GLP-1(32-36)氨基5肽，在肥胖型小鼠上增加能量消耗，抑制体重增长。

技术实现要素：

发明目的：

本发明的目的是设计一条新的降糖肽，有效治疗和预防糖尿病及其并发症。

技术方案：

本降糖调脂肽P8根据GLP-1的野生型进行改造，第2位的氨基酸由Ala替换成Gly，在GLP-1的末尾添加Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，延长其半衰期，能够降低1型糖尿病和2型糖尿病小鼠的血糖。序列如下：

GLP-1：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

P8：HEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG

P8肽在治疗或预防I型糖尿病药物中的应用。

P8肽在治疗或预防II型糖尿病药物中的应用。

有益效果：

临床证实，GLP-1类似物能够明显的降低II型糖尿病病人的血糖，抑制进食，降低糖化血红蛋白等，同时，GLP-1及其类似物能够降低I型糖尿病病人的血糖，降低糖化血红蛋白，但是有些个体存在体重减轻的不利因素。本发明中，将GLP-1的第2位的氨基酸由Ala替换成Gly，在GLP-1的末尾添加Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，起到了降低I型糖尿病和II型糖尿病小鼠血糖的作用。

本发明的优点在于通过氨基酸替换和末尾添加小肽，构建了一种降糖肽。实验结果证明P8肽能够有效地发挥糖依赖性促胰岛素分泌作用(IPTGG)，降低STZ糖尿病模型小鼠的血糖，抑制STZ糖尿病模型小鼠的进食，保持良好的胰岛形态(HE染色)，增加STZ糖尿病模型小鼠的胰岛面积(免疫染色，并累计面积)，增加STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平，其降糖作用明显优于艾塞那肽和GLP-1，P8肽能够有效地降低db/db小鼠的空腹血糖，作用明显优于GLP-1。

附图说明

图1 P8的糖依赖性的促胰岛素分泌作用(IPTGG)；

图2 P8对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响；

图3 P8对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响；

图4 P8对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响

图5 P8对STZ糖尿病模型小鼠胰岛形态(HE染色)的影响

图6 P8对STZ糖尿病模型小鼠胰岛面积的影响

图7 P8对STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平的影响

图8 P8对db/db糖尿病模型小鼠的血糖的影响

图9 P8对db/db糖尿病模型小鼠的胰岛素耐量的影响

具体实施方式

下面结合一些实例对发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：P8的糖依赖性的促胰岛素分泌作用

1、糖依赖性的促胰岛素分泌作用(IPTGG)

40只8周龄的雄性c57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)。随机分为4组，每组10只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Exendin-4组(阳性对照组)、GLP-1组(阳性对照组)、P8组(实验组)。腹腔糖耐量过程如下：c57小鼠空腹12小时，测空腹血糖，分别注射肽或者溶剂，30分钟注射葡萄糖(1.5g/kg)，之后分别在注射糖之后15、30、60、120分钟检测血糖，并分别计算曲线下面积。结果P8具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌功能，与溶剂组和GLP-1组均具有显著性差异，与Exendin-4组效果一样。结果如图1所示。

实施例2：P8的药效学评价一

1、STZ糖尿病模型小鼠造模，及分组

80只6周龄的雄性c57小鼠(购自扬州大学实比较医学中心，许可证号：SCXK(苏)2012-0004)，适应性饲养1周。实验前空腹12小时，按50mg/kg的剂量腹腔注射STZ溶液(pH＝5.2的柠檬酸缓冲液)，连续注射5天，注射后1周、2周分别检测空腹血糖，血糖值均超过11.0mmol/L，为造模成功。将成模小鼠随机分成4组，每组12只，分别为溶剂对照组(阴性对照组)、Exendin-4组(阳性对照组)、GLP-1组(阳性对照组)、P8组(实验组)。给药剂量为25nmol/kg，每天2次，溶剂为生理盐水，皮下注射0.1ml，固定时间点给药，AM 9：00-10：00，PM 8：00-9：00。阴性对照组，皮下注射0.1ml生理盐水。

2、对STZ糖尿病模型小鼠累计进食的影响

从给药开始，每组分别记录初始添食量，隔1天或2天检测剩食量，并继续添加新的鼠粮，并记录，依次类推，到5周给药结束，记录小鼠的总进食量，并绘制累计进食曲线，结果如图2，P8组累计进食明显少于溶剂组、GLP-1组和Exendin-4，具有相同的抑制进食的效果。

3、对STZ糖尿病模型小鼠血糖的影响

小鼠空腹8小时，AM 8：00开始禁食，PM 4：00，尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，作为给药0周血糖。之后分别在给药1、2、3、4、5周，检测空腹血糖，禁食时间和检测时间同0周方法，结果如图3，P8组能够显著降低STZ糖尿病模型小鼠的空腹血糖，明显优于GLP-1组和Exendin-4组，到第5周，与模型组比较，p≤0.01，具有显著性差异。

4、对STZ糖尿病模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸的影响

给药5周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒分别检测甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平，结果如图4。结果显示，血清甘油三酯水平，P8组与模型组比较，p≤0.001，具有极显著性差异，Exendin-4组与模型组比较，p≤0.01，GLP-1与模型组比较，无明显差异性；血清游离脂肪酸水平，P8组与模型组比较具有显著性差异，p≤0.01，GLP-1组、Exendin-4组与模型组比较，无显性著差异。结果说明，P8处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的甘油三酯和游离脂肪酸水平，优于GLP-1组、Exendin-4组。

5、对STZ糖尿病模型小鼠胰岛形态(HE染色)的影响

给药5周后，处死小鼠，取胰腺，用福尔马林固定，经HE染色后，观察胰岛形态，结果如图6。模型组胰岛损伤严重，几乎看不到完整的胰岛结构，GLP-1组、Exendin-4组和P8组胰岛形态得到明显改善，可以观察到细胞着色浅、排列呈团索状的胰岛结构。说明GLP-1组、Exendin-4组和P8组均能改善胰岛形态。

6、对STZ糖尿病模型小鼠胰岛面积的影响

给药5周后，处死小鼠，取胰腺，福尔马林固定，免疫染色(insulin、ki67)，结果如图7。免疫染色图片显示，模型组胰岛β细胞很少(STZ损伤诱导β-细胞死亡)，而GLP-1组、Exendin-4组和P8组胰岛β细胞增多，说明P8组能够明显增加胰岛β细胞量，增加胰岛β细胞面积。

7、对STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平的影响

给药5周后，眼眶取血，静置收集血清，试剂盒检测C肽水平，结果如图8。结果显示，P8组与模型组存在显著差异，p≤0.05，GLP-1组、Exendin-4组与模型组比较，无明显差异，说明P8处理后能够明显降低STZ糖尿病模型小鼠的C肽水平，优于GLP-1组、Exendin-4组。

实施例3：P8的药效学评价二

1、对db/db糖尿病模型小鼠血糖的影响

24只6周龄的雄性db/db小鼠(购自南京大学，许可证号：SCXK(苏)2015-00001)，适应性饲养1周。，从第7周开始检查血糖，AM 8：00开始禁食，AM 12：00，尾静脉检测血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)。第9周时，开始给药，并检测血糖，第10周时，与模型组、GLP-1组比较，血糖显著降低，分别为p≤0.001和p≤0.05，并持续维持较低的血糖水平，与模型组存在显著差异，降糖明显优于GLP-1组，与Exendin-4组基本持平。

2、对db/db糖尿病模型小鼠胰岛素耐量的影响

第16周，小鼠空腹8小时，AM 8：00开始禁食，PM 4：00，尾静脉检测空腹血糖，检测用血糖检测仪(欧姆龙血糖仪HEA-231型)，检测空腹血糖，作为胰岛素耐量的0点血糖，按1IU/kg的剂量皮下注射胰岛素，之后分别在注射胰岛素之后15、30、60、90、120分钟检测血糖，并分别计算曲线下面积。结果P8显著改善胰岛素耐量，与溶剂组和GLP-1组均具有显著性差异，与Exendin-4组效果一样。