本发明属于生物医学领域，涉及一种对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽，具体地说，本发明涉及一种能够和促红细胞生成素受体结合并激活促红细胞生成素受体或者能起促红细胞生成素激动作用的对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽及其制备方法，本发明还涉及所述模拟肽在制备治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的用途。
背景技术：
：促红细胞生成素是(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，为最早应用于临床的细胞因子，是迄今所知作用最单一、且安全可靠的升血红蛋白制剂。对于肾贫血、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及阵发性夜间血尿等均有一定疗效；此外，应用促红细胞生成素还可减少手术中的输血量，并能在一定程度上纠正由恶性肿瘤、化疗及类风湿性关节炎引起的贫血。由于促红细胞生成素主要由肾小管内皮细胞产生，肾性疾患引起的贫血是促红细胞生成素的首选适应证；促红细胞生成素纠正肾性贫血的疗效几乎100％，但并不能改善肾功能。促红细胞生成素的治疗安全、有效，适合长期治疗，也能避免血源紧张。在2006年的全球生物技术药市场上，促红细胞生成素类的重组药物占了119亿美元，有巨大的市场容量。促红细胞生成素作为一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素，对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，促红细胞生成素由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。在促红细胞生成素诱导红系祖细胞分化过程中，球蛋白被诱导，这能使细胞吸收更多的铁合成功能性的血红蛋白，这种功能性的血红蛋白可以和成熟的红血球中的氧结合，因此，红血球和血红蛋白在提供机体氧方面扮演了极其重要的角色。这一过程是由促红细胞生成素与红祖细胞的表面受体之间的相互作用引起的。当人体处于健康状态时，组织可以从已经存在的红血球中吸收足够多的氧，此时体内的促红细胞生成素浓度很低，这种正常的较低的促红细胞生成素浓度完全可以剌激促进由于年龄的问题而正常损失的红细胞。当循环系统中的依靠红细胞进行氧输送的水平被降低进而出现缺氧情况时，促红细胞生成素在体内的数量将会增加，机体缺氧状态可以由以下原因引起的：过量的辐射、因高纬度或长期昏迷造成的氧摄入量减少、各种类型的贫血等等。作为对组织处于缺氧压力的应答，促红细胞生成素水平的提高可以刺激红组细胞的分化达到提高红细胞生成的能力。当体内的红细胞的数量大于正常组织的需求时，循环系统中促红细胞生成素的水平被降低。正是由于促红细胞生成素对于红细胞的生成有着至关重要的作用，因此这类激素对于治疗和诊断以红细胞生成低下和缺陷为特征的血液病方面有着很广泛的前景。最近的研究为推测促红细胞生成素疗法在多种疾病、紊乱和血液学异常情况中的效用提供了基础，这些疾病包括：慢性肾衰竭(CRF)患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素和在艾滋病和接受化疗的癌症患者贫血症的治疗中使用促红细胞生成素(Danna,RP，Rudnick，SA，Abels，RI，In：MB，Garnick编著，临床应用中的促红细胞生成素-国际展望(ErythropoietininClinicalApplications-AnInternationalPerspective.MarcelDekker；1990:p301-324)。促红细胞生成素的部分生物学效应可以通过和细胞膜表面的受体内在作用来调节。最初在使用从小鼠的脾脏里分离出的未成熟的红细胞来研究细胞表面结合的促红细胞生成素蛋白时发现，这种蛋白是由两种多聚肽组成，其分子量大约为85000～100000KD(Sawyer,etal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3690-3694)。有研究表明从感染了friend病毒贫血株的小鼠的脾脏红细胞对EP0的响应情况发现，大约有400个结合位点，其中Kd水平高的为100pM，Kd水平低的为800pM。随后的工作就是两种促红细胞生成素受体被单个基因翻译和转录，这个基因已经被克隆。例如，小鼠和人的促红细胞生成素受体的DNA序列以及编码肽的序列在WO90/08822中已经有叙述。目前的模型表明促红细胞生成素结合到促红细胞生成素受体导致了两个促红细胞生成素受体的活化和二聚，这种二聚进一步导致了信号传导的开始。促红细胞生成素克隆基因的应用更有助于帮助寻找这些重要受体的激动剂和拮抗剂。某种程度上能够作用促红细胞生成素受体的肽已经被确定和叙述。特别是确定了一组含有主要肽段的肽，这些肽可以和促红细胞生成素受体结合并能剌激促红细胞生成素细胞的分化增殖。但是能够刺激红细胞增殖分化的肽的EC50却很低，在20nM和250nM之间，因此这些肽在临床应用上受到了较大的限制。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种生物活性更好、生物利用度更高的对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐以及它们的制备方法。本发明所使用的氨基酸除了包括本领域技术人员所熟知的二十种常见氨基酸外还包括部分非常见氨基酸，非常见氨基酸结构及名称见表1表1非常见氨基酸的名称和结构本发明提供了一种促红细胞生成素模拟肽，其特征在于，所述模拟肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示：SEQIDNO:1GGLYAC6HMGPITX1VC15QPLRX2KC其中，X1为3-(1-萘基)-L-丙氨酸(Nal)，X2为肌氨酸(Sar)，6位和15位的半胱氨酸(C)形成分子内二硫键，N末端乙酰化。本发明还提供了一种促红细胞生成素模拟肽的二聚体，所述二聚体是由上述促红细胞生成素模拟肽的22位半胱氨酸侧链巯基经对二亚甲基苯偶联形成的，所述二聚体的通式如下式I所示:GGLYACHMGPITNalVCQPLRSarKC22|GGLYACHMGPITNalVCQPLRSarKC22式I本发明还提供了所述二聚体的制备方法，所述方法包括步骤：1)根据SEQIDNO:1选择氨基酸，通过Fmoc固相多肽合成法合成序列如SEQIDNO:1所示的模拟肽，并形成分子内二硫键；优选地，通过氧化方法使所述模拟肽形成分子内二硫键，更优选地，所述氧化方法为20％DMSO氧化法或碘氧化法；2)与对二溴苄进行分子间偶联，优选地，在CH2Cl2或DMF的溶剂环境下通过DIEA或Et3N的作用使模拟肽与二溴苄反应，完成分子间偶联，得到模拟肽二聚体。在根据本发明的一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：将所述促红细胞生成素模拟肽二聚体纯化、脱盐以及冷冻干燥得到二聚体的冻干粉；优选地，所述纯化是通过在HPLCC18半制备柱中，以乙腈为流动相实现的。本发明还提供了一种促红细胞生成素模拟肽的可药用盐，所述可药用盐为所述模拟肽或其二聚体与酸性化合物或碱性化合物反应生成的盐；优选地，所述酸性化合物选自盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸或乙酸；优选地，所述碱性化合物选自铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐；更优选地，所述碱性化合物选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾；更优选地，所述可药用盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-l,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒 石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-l-磺酸盐、萘-2-磺酸盐或扁桃酸盐，优选地为三氟乙酸盐。本发明提供的促红细胞生成素模拟肽或其二聚体通过公知技术可使用酸性或碱性化合物与之反应成盐，通常采用的形成酸加成盐的酸为：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸。优选地，所述促红细胞生成素模拟肽及其二聚体的可药用盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、三氟乙酸盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-l,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-l-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐等，优选三氟乙酸盐。碱性化合物也可以和本发明的促红细胞生成素模拟肽或其二聚体成盐，这些碱性化合物包括铵，碱金属或碱土金属的氢氧化物，以及碳酸盐、碳酸氢盐，典型的有氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾等。本发明还提供了一种促红细胞生成素模拟肽或其二聚体在制备用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病的药物中的应用。优选地，所述以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病选自末期肾功能衰竭或透析；AIDS相关性贫血，自身免疫性疾病，或恶性肿瘤；囊性纤维变性；早期早熟性贫血；与慢性炎性疾病相关的贫血；脊髓损伤；急性失血；衰老和伴有异常红细胞产生的肿瘤疾病。本发明还提供了一种含上述促红细胞生成素模拟肽或二聚体及其药用盐的药物组合物，所述药物组合物用于治疗以缺乏红细胞生成素或红细胞群缺少或缺陷为特征的疾病。本发明的药物组合物包括一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂中的一种或多种。本发明所述的水溶性填充剂选自以下的一种或多种：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖。所述pH调节剂选自以下的一种或多种：枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸、碱或盐等。所述稳定剂选自以下的一种或多种：EDTA-Na2、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选地选自焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000和三羟甲基氨基甲烷中的一种或多种。所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。冷冻干燥注射剂的制备方法：取所述的促红细胞生成素模拟肽二聚体溶液或所述的促红细胞生成素模拟肽二聚体的可药用盐适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，冷冻干燥，制得白色疏松块状物，封口即得；优选地，每个规格分别含有对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽5μg，100μg以及1mg。注射液的制备方法：取所述促红细胞生成素模拟肽或其二聚体或其可药用盐溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得；优选地，每个规格分别含有所述促红细胞生成素模拟肽二聚体5μg，100μg以及1mg。本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在50μg/人-10mg/人，每 日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。与现有技术相比,本专利涉及的对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽及其可药用盐能够明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们刺激红细胞生成，同时还能够大大延长药物在体内的半衰期。对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽和促红细胞生成素蛋白对成熟的红细胞、血细胞压积、血红蛋白含量没有明显的影响，对外周血白细胞计数液没有明显影响。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1促红细胞生成素模拟肽二聚体的合成本发明的促红细胞生成素模拟肽为多肽，其制备可使用Fmoc固相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS336X型仪器进行本发明的多肽的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进行。本文所述的Fmoc固相多肽合成方法是指以聚合物树脂作为固相反应基质，将氨基端Fmoc保护的氨基酸在偶联试剂的存在下依次缩合，从而合成多肽的合成方法。其具体方法参见Fmocsolidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach,2000,OxfordUniversityPress。并通过氧化方法形成模拟肽分子内二硫键，例如20％DMSO氧化法以及碘氧化法。通过常用方法与对二溴苄完成分子间偶联，例如模拟肽在CH2Cl2或DMF中DIEA或Et3N作用下与二溴苄反应，发生分子间偶联。将制得的模拟肽二聚体使用HPLCC18半制备柱进行纯化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉。实施例2促红细胞生成素模拟肽二聚体对小鼠的作用采用小鼠评价并比较对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽二聚体及促红细胞生成素蛋白对小鼠红细胞生成的影响。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；昆明种小鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，均为雌性小鼠，试验中各组动物数：10只，分为4组。其中，1组小鼠皮注射对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽二聚体，剂量为4.5mg/kg，1组小鼠注射促红细胞生成素蛋白，剂量为4.5mg/kg，1组小鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，连续七天，然后处死小鼠，取全血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数。结果如表2所示，发现对二亚甲苯偶联的促红细胞生成素模拟肽二聚体及促红细胞生成素蛋白均能明显刺激小鼠外周血网织红细胞计数的升高，说明它们剌激红细胞生成(见表2)，而本发明的模拟肽二聚体具有更显著的效果。表2对小鼠网织红细胞生成的影响名称网织红细胞数目(×109/L)空白89.14±2.04模拟肽二聚体634.30±3.10EPO503.79±3.21实施例3：促红细胞生成素模拟肽对猕猴的作用本发明所使用的EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司。采用猕猴用于评价促红细胞生成素模拟肽对红细胞生成的影响，猕猴，体重5.5～8.5kg，雌雄不限，购自海南实验动物中心。猕猴根据基础血红蛋白分组，分为两组，每组三只。实验组使用本发明的模拟肽二聚体，每周静脉注射一次，每次4.5mg/kg；阳性对照组使用EPO，三次/周，每次1.5mg/kg，连续给药五周，每周测1次血液学指标。结果发现，本发明的模拟肽单次静脉注射导致猕猴外周血血红蛋白含量上升(32％)，血细胞压积升高，说明模拟肽能够刺激血红蛋白生成。阳性对照组中促红细胞生成素也能够升高猕猴外周血血红蛋白含量(31％)，升高血细胞压积，但需要每周注射三次，显然本发明的肽衍生物相对EPO明显具备更佳地长效性。表3促红细胞生成素模拟肽给药5周对猕猴血液学指标影响组别红细胞计数(×1012/L)血红蛋白含量(g/L)血细胞压积(％)空白6.51±0.12110.2±6.845.1±1.24EPO8.33±0.21144.3±7.447.3±1.12模拟肽二聚体8.42±0.19145.5±8.248.6±2.38实施例4促红细胞生成素模拟肽对大鼠的作用采用大鼠评价并比较促红细胞生成素模拟肽及促红细胞生成素蛋白对大鼠红细胞生成的影响。其中，EPO药品购自沈阳三生制药有限责任公司；SD大鼠，购自中科院上海实验动物中心，体重25～30g，均为雌性大鼠，试验中各组动物数：10只，分为3组。其中，实验组大鼠皮注射促红细胞生成素模拟肽二聚体，剂量为4.5mg/kg，对照组大鼠注射促红细胞生成素蛋白，剂量为4.5mg/kg，1组大鼠为空白对照，注射PBS缓冲液，单次给药后，连续三天取血进行外周血细胞及网织红细胞计数，血细胞计数用全自动血球计数仪计数，并计算促红细胞生成素模拟肽的长效性，结果发现促红细胞生成素模拟肽在单次给药后2周内依然具有刺激红细胞生成作用，显然本发明的模拟肽比促红细胞生成素蛋白(EPO)具有更佳地长效性。结果如表3所示。表4促红细胞生成素模拟肽对大鼠的作用尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。序列表当前第1页1 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