一种GP96蛋白纯化方法与流程

本申请大体涉及生物技术领域，具体而言，本申请涉及用于提取和/或纯化GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的方法，以及所获得的纯化的GP96蛋白/GP96蛋白-多肽复合体的用途。

发明背景

免疫治疗是肿瘤治疗的发展方向，目前主动特异性免疫治疗是研究的热点之一。以完整细胞作为疫苗及基因工程核酸疫苗在应用上还存在副作用及不安全性等缺点。利用肿瘤相关抗原(TAA)及肿瘤特异性抗原(TSA)激发免疫反应，达到治疗肿瘤的目的已取得了一些进展。但迄今为止对肿瘤特异性抗原的了解和制备抗原特异性肿瘤疫苗的困难比较大。

热休克蛋白Gp96是一种较为有效的抗肿瘤疫苗。从肿瘤组织提取的热休克蛋白Gp96可结合不同的抗原肽，形成的Gp96-多肽复合体可激活多个CTL克隆，从而产生较强的杀瘤效应。早在上世纪90年代，美国科研人员就开始尝试将这一技术应用于治疗人类肿瘤，至今已针对肾癌、结肠癌、黑色素瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤开展了免疫治疗。随后在美国、欧盟等也陆续开展了临床中心试验，发现Gp96免疫治疗安全性高，没有严重的毒副作用。同时，Gp96免疫可有效激活肿瘤特异性T细胞免疫应答，明显提高早期肿瘤患者的生存期。目前，美国FDA已经批准用Gp96自体疫苗治疗黑色素瘤、肾癌和神经胶质瘤孤儿药，欧盟EMEA将其批准为治疗肾癌及神经胶质瘤的孤儿药。

虽然GP96蛋白质的临床效果较好，但由于其是一种极具多相性的生物大分子，离开其天然环境后极不稳定，在特定的条件下才能保持其生物学活性，因此gp96提取成为此治疗方法的关键。尽管目前市面已开发出一些提取方法，但提取率也不理想，而且大多提取方法用到一种CONA sepharose 4B的层析填料。CONA为刀豆蛋白，又名刀豆凝集素，是一种植物血凝素，具有强力的促有丝分裂作用，近年来发现刀豆蛋白可介导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子和促炎细胞因子从而诱导肝损伤，为构建动物肝损伤实验模型常用方法。若选择此方法纯化GP96，作为治疗性药物会有潜在的危害。

因而，开发新的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体纯化方法具有重要意义。

发明概述

第一方面，本申请提供了提取GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的方法，所述方法包括：

(a)将组织或细胞的碎块与裂解液混合，进行裂解，离心后得到上清液；

(b)将获得的上清液进行疏水层析和等电聚焦电泳。

在一些实施方案中，在步骤(a)之前还包括步骤(a0)：将组织或细胞进行物理破碎的步骤。

在一些实施方案中，在步骤(a)和(b)之间还包括步骤(a1)：向上清液中加入等体积50mM/L磷酸盐缓冲液，离心后得到第二上清液，第二上清液用于疏水层析和等电聚焦电泳。在一些实施方案中，50mM/L磷酸盐缓冲液的pH值为7.0、含2M/L(NH₄)₂SO₄、1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。

在一些实施方案中，步骤(a0)、(a)和(a1)中的一个、两个或全部在冰浴中进行。

在一些实施方案中，裂解液为pH值7.0、含0.86％NaCl、1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM/L磷酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，在疏水层析步骤中，平衡层析柱，然后用5-15倍柱体积量的第一洗脱液洗去杂质蛋白，随后用5-15倍柱体积量的第二洗脱液冲洗层析柱，并收集洗脱液。

在一些实施方案中，第一洗脱液为pH 7.0，含0.6M/L(NH₄)₂SO₄的50mM/L磷酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，第二洗脱液为pH 7.0的50mM/L磷酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，在等电聚焦电泳步骤中，利用4.76的等电点值对GP96蛋白进行等电聚焦电泳分离。

在一些实施方案中，组织或细胞来源于肿瘤组织、非肿瘤病理组织、血液样本中的细胞，或体外培养的被病原体感染的哺乳动物细胞。

第二方面，本发明提供了通过前述方面的方法获得的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体在制备用于治疗和预防自身细胞变异、外源性病原体感染和/或自身免疫相关疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，自身细胞变异相关疾病为肿瘤。

附图说明

图1为对利用等电聚焦电泳纯化GP96蛋白时收集的5-7号管的蛋白进行SDS-PAGE以及蛋白质印迹的检测结果。其中图1A为SDS-PAGE的结果，各泳道分别表示：a.标准分子量蛋白标志物，b.5号管样品，c.6号管样品，d.7号管样品。图1B为蛋白质印迹的检测结果，其中各泳道分别表示：a.标准分子量蛋白标志物，b.5号管样品，c.6号管样品，d.7号管样品。

图2为对将利用等电聚焦纯化GP96蛋白收集的5-7号管的蛋白合并后的蛋白进行SDS-PAGE以及蛋白质印迹的检测结果。其中图2A为SDS-PAGE的结果，泳道1为标准分子量蛋白标志物，泳道2为合并后的蛋白。图2B为蛋白质印迹的检测结果，其中泳道2为合并后的蛋白。

发明详述

本申请的发明人对GP96蛋白的理化性质进行了深入的研究，并通过大量的探索和实践，开发出了新的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的提取和纯化方法。

本申请的方法的优势包括以下中的一项或多项：

实现快速提取，操作安全高；

提取率高；

尽量减少或避免提取过程中的毒副产物残留。

第一方面，本申请提供了提取GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体的方法，所述方法包括：

(a)将组织或细胞的碎块与裂解液混合，进行裂解，离心后得到上清液；

(b)将获得的上清液进行疏水层析和等电聚焦电泳。

本领域中公知，GP96蛋白属于热休克蛋白90家族，在细胞内发挥着分子伴侣的作用。其能够通过与Toll样受体等相互作用刺激抗原递呈细胞产生各种细胞因子激活免疫系统。此外，GP96能够与不同的抗原肽结合而形成本申请所述的“GP96蛋白-多肽复合体”，该复合体能够诱发机体抗原特异性细胞毒性T细胞免疫应答，清除病原物感染和肿瘤。

在一些实施方案中，在步骤(a)之前还包括步骤(a0)：将组织或细胞进行物理破碎的步骤。本文所用的术语“物理破碎”指利用工具将组织或细胞处理为物理学形态更小的碎块的步骤。该步骤可以理解为裂解液裂解步骤的预处理步骤，可以利用多种器具完成，例如小型镊子、剪刀等。

作为非限制性的实例，可以按下述操作破碎、裂解组织：量取体积总量为组织重量的6倍的预冷的裂解液。取1/3体积加到容纳有组织的烧杯内，冰浴条件下剪碎组织块，然后将剩余2/3体积溶液加到烧杯，随后用高速分散器在冰浴条件下进行匀浆。在一些实施方案中，匀浆步骤中可增加超声破碎和磁珠破碎中的至少一种，或用其替换高速分散器匀浆。

在一些实施方案中，裂解液为pH值7.0、含0.86％NaCl、1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM/L磷酸盐缓冲液。

本文提及的pH值7.0的50mM/L磷酸盐缓冲液的配方为：12.24g/L Na₂HPO₄·12H₂O、1.25g/L NaH₂PO₄·2H₂O，pH 7.0。

苯甲基磺酰氟在本领域中常被用作胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的抑制剂，可抑制丝氨酸蛋白酶，也可抑制半胱氨酸蛋白酶和乙酰胆碱酯酶。不受任何特定理论的束缚，在本申请中，含苯甲基磺酰氟的裂解液在组织破碎时为蛋白提供了稳定的缓冲环境。

在一些实施方案中，在步骤(a)和(b)之间还包括步骤(a1)：向上清液中加入等体积50mM/L磷酸盐缓冲液，静置(例如约0.5小时)，离心后得到第二上清液，第二上清液用于疏水层析和等电聚焦电泳。该步骤可以理解为疏水层析样品的准备步骤，以便于裂解上清液更好地适合于疏水层析处理。在一些实施方案中，该步骤中50mM/L磷酸盐缓冲液的pH值为7.0、含2M/L(NH₄)₂SO₄，1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。

在一些实施方案中，步骤(a0)、(a)和(a1)中的一个、两个或全部在冰浴中进行。在一些实施方案中，步骤(a0)、(a)和(a1)均在冰浴中进行。不受任何特定理论的束缚，这样的处理有利于获得高纯度的GP96蛋白。

疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法。在蛋白质溶液中加入无机盐，会吸引大量水分子与这些无机盐离子水合，因此蛋白质表面暴露出来的疏水性区域增加，从而可以与疏水介质结合，当逐渐降低溶液缓冲体系中盐浓度时，蛋白可被先后洗脱下来，从而达到分离目的。该方法基于蛋白质的疏水差异，在适合的盐溶液中，目标蛋白质会与疏水配基相结合，而其它的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可将目标蛋白质进行分离。

作为非限制性的实例，可以按下述操作实施疏水层析：用平衡液平衡疏水层析柱，将待处理的样品加载到层析柱，用15倍柱体积量的洗脱液1洗去杂蛋白，然后用15倍柱体积的洗脱液2冲洗层析柱，收集此步骤中的洗脱液，其内含有粗分离GP96蛋白。

在一些实施方案中，疏水层析的介质包括但不限于丁基琼脂糖凝胶4FF、辛基琼脂糖凝胶4FF和苯基琼脂糖凝胶6FF。在一些实施方案中，疏水层析的介质为苯基琼脂糖凝胶6FF。

在一些实施方案中，平衡液为pH 7.0，含1M/L(NH₄)₂SO₄的50mM/L磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，使用的平衡液的量为10倍柱体积。

在一些实施方案中，洗脱液1为pH 7.0，含0.6M/L(NH₄)₂SO₄的50mM/L磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，使用的洗脱液1的量为5-15倍柱体积。

在一些实施方案中，洗脱液2为pH 7.0的50mM/L磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，使用的洗脱液2的量为5-15倍柱体积。

等电点聚焦是在电泳槽中加入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上，达到蛋白分离的目的。

根据本申请发明人的研究和摸索，将GP96蛋白的等电点确定为约4.76。因此，在一些实施方案中，利用该等电点值对GP96蛋白进行等电聚焦电泳分离。

在一些实施方案中，采用的两性电解质为Bio-Lyte两性电解质。

在一些实施方案中，以1:0.5-1:5的比例，用pH范围为3/10的Bio-Lyte两性电解质与pH范围为4/6的Bio-Lyte两性电解质配制电解液。

在一些实施方案中，等电聚焦电泳采用的参数为：功率恒定为15W，时间为4小时。

在一些实施方案中，组织或细胞来源于哺乳动物，例如可以是人、非人类灵长类动物、小鼠、羊、猫、犬、牛、马或猪。

在一些实施方案中，组织或细胞可以是个体的肿瘤组织、非肿瘤病理组织、血液样本中的细胞，或体外培养的被病原体感染的哺乳动物细胞。

第二方面，本发明提供了通过第一方面所述的方法获得的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的GP96蛋白和/或GP96蛋白-多肽复合体在制备用于治疗和预防自身细胞变异、外源性病原体感染或自身免疫相关疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，自身细胞变异相关疾病为肿瘤。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

提供以下实施例仅仅是对本申请的一些实施方案进行举例说明，没有任何限制的目的或性质。

实施例1：肿瘤细胞中GP96蛋白的提取纯化

1.制备细胞裂解液

将人源前列腺癌细胞PC-3(购自上海复祥号CRL-1435^TM)，经过培养并达一定数量(10¹⁰数量级)，以1500RPM离心10分钟使细胞聚集，弃去培养基。加入细胞6倍体积的预冷的50mM磷酸盐缓冲液(12.24g/L Na₂HPO₄·12H₂O、1.25g/L NaH₂PO₄·2H₂O，pH7.0，含0.86％NaCl、1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF))，采用高速分散器(宁波新芝，XHF-D)在冰水中进行匀浆，10秒/次，间隙30秒，连续5-8次。将匀浆液以13000rpm/min离心20分钟，去除组织和细胞碎片等沉，并保留上清。

2.疏水层析分离

伴随搅拌，向所得上清溶液中缓慢加入等体积的50mM/L磷酸盐溶液(含2M/L(NH₄)₂SO₄、1mM/L PMSF，pH7.0)，静置半小时，全程操作在冰水浴中进行。然后13000rpm/min离心15min，并保留上清。

用50mM/L磷酸盐平衡液(含1M/L(NH4)₂SO₄、pH 7.0)平衡苯基琼脂糖凝胶6FF疏水层析柱(供应商：GE，型号：17-1355-01)，平衡液用量为10倍柱体积。将步骤1所得上清上样至层析柱进行疏水层析。随后用15倍柱体积量的洗脱液1(50mM/L磷酸盐冲洗液(含0.6M/L(NH₄)₂SO₄、pH 7.0))洗去杂蛋白。最后用15倍柱体积的洗脱液2(50mM/L磷酸盐洗脱液(pH7.0))洗脱，收集此粗分离蛋白溶液，将其浓缩。

3.等电聚焦电泳

材料与方法：

仪器：

Bio-Rad Rotoforprep IEF cell等电聚焦电泳仪，产品系列号193BR04929

Bio-Rad PowerPac ^TM HV电源，产品系列号044BR7901

循环水浴器(北京六一生物科技有限公司WD-9412A型恒温循环器)试剂：

Bio-Lyte两性电解质(pH范围3/10)

Bio-Lyte两性电解质(pH范围4/6)

实验步骤：

a.按以下量制备样品(均提前4℃预冷)：

58mL ddH₂O，

1mL疏水层析收集蛋白样品，

3mL Bio-Lyte两性电解质：pH范围为3/10的Bio-Lyte两性电解质1.5mL，pH范围为4/6的Bio-Lyte两性电解质1.5mL。

b.等电聚焦电泳仪装配

离子交换膜预先在对应电极液内浸泡平衡过夜，用0.1M/L NaOH浸泡；阳极膜用0.1M/L H₃PO₄浸泡。

c.完成装配后，将冷却芯和循环水浴器连接，4℃预冷。

d.然后将步骤a中样品灌装到电泳仪内，进行电泳，参数如下

e.等电聚焦结束后，用收集器将样品均分收集到20个小管内，通过

SDS-PAGE电泳鉴定每管蛋白样品，确定GP96所处位置。在本实施

例中，在上述参数下，GP96一般分布于5-7号管内。

实施例2：GP96的检测

将样品离心，PBS复溶重悬，利用SDS-PAGE电泳与蛋白质印迹对提取纯化的GP96蛋白进行检测进行分析鉴定。其中在Western blot检测中，使用的一抗为R&D鼠抗人GP96/HSP90B1，货号为#MAB7606，使用的二抗为R&D山羊抗鼠IgG HRP亲和纯化的PAb，货号为#HAF007。

检测结果分别如图1和图2所示。结果表明，5-7号管收集的GP96蛋白较纯，电泳条带单一，无杂蛋白。

在不偏离本申请公开的实质和范围的情况下，可对本申请公开的各实施方案进行多种改变和用等同替换。除非上下文中另有说明，否则本公开的实施方案的任何特征、步骤或实施方案都可以与任何其他特征、步骤或实施方案组合使用。