专利名称：血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促红细胞生成素及其应用，具体地说是一种血脑屏障穿透 性促红细胞生成素及其应用，属于生物制药领域。
背景技术：
近年来，促红细胞生成素(EP0)己经成为在缺血性脑卒中神经保护治疗方 面最有前景的药物之一。在体外和体内的缺血损伤模型的研究中，EP0都显示具 有强烈的神经保护作用。最近， 一个应用EPO治疗急性脑卒中的临床试验证明 EPO可以减少脑卒中患者脑梗死面积，促进神经功能的恢复。因此，在脑卒中治 疗中，尤其对错过治疗时间窗，不适合应用组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂治 疗的患者，EPO显示了一个潜在的令人鼓舞的临床应用前景。但是，EP0的临床 应用也面临着一个重大的挑战如何能更有效地使EP0穿透血脑屏障(BBB) EP0 通过与神经元的受体结合而发挥作用，而EPO与神经元的结合能力远远低于EP0 与红母细胞的结合能力，约为其千分之一。此外，由于BBB的作用，注射到体 内的EPO只有大约P/。穿过BBB而进入大脑，所以，要使EPO在脑内达到有效浓 度，须加大注射剂量。临床上己报道用于治疗脑卒中的EP0剂量为33000U/次， 每天一次，此剂量远远高于治疗贫血的维持剂量3500U/次，每周两次。实验室 用于治疗脑卒中的剂量则更高，为5000U/kg体重。此外，EPO在血液中的半衰 期短，需要多次注射才能维持其神经保护作用。大剂量，反复多次注射EPO可 能致使其红细胞比容增加[8]，刺激血小板生成，增加微小梗塞灶，形成大梗死灶 的危险性亦增加，从而，严格地限制甚至阻止了 EP0在脑卒中治疗中的应用。 因此，通过促进或增加EPO穿透BBB的能力，将大大降低EPO的用量，从而， 降低EP0的促红细胞生成作用和其他潜在副作用，大大地增进EP0在脑卒中治 疗中临床应用的可能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对血脑屏障具有穿透性的促红细胞 生成素。
本发明要解决的另一个技术问题是提供促红细胞生成素在制备治疗缺血性脑卒中神经保护治疗药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案 血脑屏障穿透性促红细胞生成素，在野生型EP0或野生型EP0衍生物的羧基 末端连接有具有蛋白转导功能的蛋白转导序列(PTD)。蛋白转导序列包括
(1) HIV TAT;
(2) 由5-10个精氨酸组成的多聚精氨酸；
(3) 果蝇控制触角基因的同源结构域；
(4) 单纯疱疹病毒VP22。
所述HIVTAT标记为含有11个氨基酸残基RGRKKRRQRRR的肽或来自HIV TAT
的其它肽段。
所述野生型EPO的氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 2;成熟的人类促红细胞 生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 3;具有蛋白转导功能的人类促红细胞生 成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 4;具有蛋白转导功能的突变型人类促红细 胞生成素氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定点突变而产生的突变型EPO、甲酰 化EPO(Carbamylated EPO)、或无唾液酸EPO(asiaoerythropoietin EPO)。
所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素在制备药物中的应用，所述药物是治 疗脑卒中、急性心肌梗死、外伤性脑损伤、脊髓损伤、急性外伤性器官损伤、 急性中毒、急性器官衰竭以及麻醉意外、外伤或疾病引起的呼吸或心跳暂停而 引起的全身器官衰竭的药物。
我们构建了表达EPO-TAT融合蛋白和二氢叶酸还原酶(DHFR)的双顺反子 质粒，将此载体导入DHFR缺失的中国仓鼠细胞后，用DHFR的相似体氨甲喋林 进行筛选，诱导，扩增导入的DNA，使蛋白表达倍增。简而言之，用PCR方法将 HIV的TAT加至EPO cDNA的3，端，同时引入六个组氨酸残基组成的his-6标 记，用于分离、纯化EPO-TAT融合蛋白。PCR扩增的EPO-TAT-his-6用EcoRV 和EcoRI消化后插入pIRES-EYFP质粒(Clontech, Mountain View, USA )，然 后用鼠的(DHFR)置换EYFP，详细步骤见下述具体实施方式
实施例1 。
EPO是一种糖基化蛋白，只有糖基化的EPO才有生物学活性。大肠杆菌由于 缺乏糖基化的酶而不具有糖基化机制。因此，为获得适当的糖基化作用，EPO
4需在哺乳动物体系里表达。最常用的体系是缺乏DHFR的CHO细胞，此细胞由于 缺乏DHFR，可用DHFR类似物氨甲喋林进行选择性扩增导入的DNA。详细步骤见
实施例2。
人类EP0cDNA(序列SEQ ID No. l)编码193个氨基酸(序列SEQ ID No. 2)， EPO初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟 EPO(序列SEQ ID No. 3)。 因此成熟的人类EPO为166个氨基酸。本发明所采 用的野生型EPO的氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 2;成熟的人类促红细胞生成 素氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 3;具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素 氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 4;具有蛋白转导功能的突变型人类促红细胞生 成素氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
本发明的优点与效益在于本发明己经建立了一个稳定的哺乳动物细胞株， 它可以产生和分泌具有生物学活性的(糖基化的)EP0融合蛋白，而此蛋白含有 来自HIV反式作用转录激活子(TAT)的蛋白转导域(PTD)(图l-2)。我们前 期数据实验表明(l)体外实验证明EPO-TAT与野生型EPO—样，具有对缺血缺 氧以及兴奋性损伤具有很强的祌经保护作用(图3); (2)全身给药后在鼠脑内 EPO-TAT的转运量比野生型EPO的转运量增加了 2.5倍(图4); (3)重要的是， 我们发现在鼠局灶性脑缺血模型中，EPO-TAT减少脑梗死的效率远远高于野生型 EP0，如图5所示1000U/kg的EPO-TAT可明显减少脑梗死体积，其效果与使用 5000U/kg野生型EPO相似;(4)此外，因为TAT增加了 EPO通过BBB的转运率， 所以EPO-TAT比野生型EPO在脑内能更快更早达到有效的治疗浓度，延长了治 疗的有效时间窗。
与野生型EPO相比EPO-TAT具有两个优势第一，EPO-TAT可显著减少治疗 脑卒中所需EPO的剂量，从而明显减轻了 EPO的副作用；第二， EPO-TAT可以延 长脑卒中治疗时间窗，从而使更多脑卒中病人达到治疗。
下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依 照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开 内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图l-A为EP0-TAT全基因序列示意图。
图1-B为表达质粒pEPO-TAT-IRES的物理图，用PCR方法将HIV TAT加至EP0cDNA的3'端，同时引入由六个组氨酸残基组成的his-6标记，用于分离、 纯化EPO-TAT融合蛋白。PCR扩增的EPO-TAT-his-6用EcoRV和EcoRI消化后插 入pIRES-EYFP质粒(Clontech)，然后用鼠DHFR置换EYFP。
图2为稳定表达EP0-TAT融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株的建立及 其EPO-TAT融合蛋白的制备及纯化。pEPO-TAT-DHFR转染CH0DG44细胞(DHFR ——)。用氨甲喋啉进行诱导扩增，剂量从5pM逐渐扩增到20uM。取2W培养基上 清液用Western blot分析EPO-TAT的表达。如图2-A所示，我们成功地分离纯 化了 EP0-TAT，分子量约36-45 kD (泳道5-7)，其分子量比没有TAT的野生型 EPO (泳道2-4)商用标准EPO (泳道1)大1 2 kD。 图2-B显示特定表达的 EPO-TAT融合蛋白。
图3为小鼠体内实验证明，TAT能增加EPO血脑屏障通过率。腹腔注射 EPO-TAT或EPO (5000U/kg BW) 3小时后收集血浆和脑脊液(CSF)。通过ELSIA 检测在血浆(图3-A)或脑脊液(图3-B)中EPO蛋白含量。数据为平均数士标 准差(n=4)表示。*p<0.05， **p<0.01，与盐水对照组比较。##p〈0.01，与 野生型EPO组比较。
图4为体外实验，提示EP0-TAT具有抗OGD和醒DA的脑保护作用。用1U/ml 的EPO-TAT或EPO处理制备的皮层神经元24h后，然后给与OGD或醒DA毒性的 剌激。图4-A示暴露于90分钟OGD后给予正常糖氧浓度24小时后的神经元。 取培养基检测LDH活性，作为细胞死亡的标记。图中数据显示的是与单独OGD 对照组的LDH释放比例。图4-B示神经元接受200 uM丽DA刺激15分钟后恢复 到正常培养基，再培养24小时。细胞核用烟酸己可碱染色，计数浓縮及片段化 的细胞核比例。TAT-GFP融合蛋白作为对照。数据表示为平均值土标准误，每视 野取12-18个点，由3名与实验无关的技术员计数。*** /X0.001与0GD对照。 **p<0. 01与单纯NMDA对照。
图5为小鼠体内实验，证明与野生型EPO相比，EPO-TAT更能有效减少小 鼠大脑中动脉阻塞模型脑梗死体积。小鼠缺血60min注即刻腹腔注射EPO-TAT 或EPO，缺血72h后TTC染色。图5-A分别为对照组，EP0-TAT和野生型EPO的 MCAO大鼠脑的冠状切面TTC染色照片。图5-B为。数据用平均数士标准差表示 (n=9)。 **p〈0. 01与空白对照组比较，# p〈0. 05与EPO(1000U/kg)比较。多组 间比较4吏用方差分析(ANOVA)禾口 post hoc Student—Newman—keuls tests。
具体实施例方式
实施例1:载体制备
一、 人类EP0 cDNA的扩增
人类EP0 cDNA编码193个氨基酸，EP0初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟EP0。因此成熟的人类EP0为166个氨基酸。最近研究发现第166号氨基酸精氨酸也被切割。基于上述研究结果，我们在构建含有HIV TAT转导序列的融合蛋白时，将HIV的TAT以及用于分离纯化的组氨酸标签加于EP0cDNA的3'端，同时将第166号精氨酸删除。含有HIVTAT标签的人类EPO cDNA用PCR方法从人类肾脏Marathon-ready cDNA文库(Clontech ，USA)中扩增。引物设计依照已发表的人类EPO cDNA序列(基因序列号NM000799)。其中上游序列含有EcoRV及KOZAK序列(划线部分)5， ACgATATCgCCACCATgggggTgCACgAATgT CTTgC-3，。下游为95bp的长引物，从3'至5'依次含有EP0下游序列(小写部分)，编码11个氨基残基的HIVTAT标签(下划线部分)，六个组氨酸组成的组氨酸标签(斜体部分)以及EcoRV克隆位点(方框部分)。在不同肽段之间加入甘氨酸残基(黑体部分)，便于从功能上分隔不同肽段以及肽段的自由旋转。EPO-TAT下游引物序列为
4ACCgtcccctgccctgcaggcctcccctg-3' 。PCR反应条件为上述两弓l物各lOpmol，Marathon cDNA 2W， AccuprimerM Taq DNA polymerase (Invitrogen， Carlsbad,美国)1P1， dNTP 200PM。 94。C预变性2分钟后，94。C变性30秒，60。C退火30秒，68t:延伸50秒，28个循环后用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。克隆入AT克隆载体pGEM-T easy (Promega， Madison,美国)。质粒扩增及酶切鉴定后进一步进行DNA测序。EPO-TAT全基因序列示意图如图1-A所示。
二、 含TAT标签的EPO表达载体的构建
将上述测序后的EPO-TAT全基因用EcoRV及EcoRI双酶切后，亚克隆至pIRES-EYFP表达载体中(clontech，美国)。命名为pEPO-TAT-EYFP。此载体含有CMV启动子，同时含有心脑炎病毒的内核糖体自启动位点，因此一条mRNA可以同时翻译两种不同蛋白。小鼠二氢叶酸还原酶DHFR经PCR扩增，测序鉴定后，用SmaI及BsrGI双酶切。亚克隆至经相同酶切的pEPO-TAT-EYFP载体中，组成既表达EPO-TAT融合蛋白，又表达筛选标记酶DHFR的双顺反子真核表达载体pEPO-TAT-DHFR，见图1-B。
实施例2:为表达EP0-TAT融合蛋白的中国仓鼠卵巢(CH0)稳定细胞株的建立及其EP0-TAT融合蛋白的制备及纯化
一、 表达EP0-TAT融合蛋白的CHO稳定细胞株的建立
将载体pEP0-TAT-DHFR用Xhol酶线性化后，回收纯化。用转染试剂Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)将线性化的质粒导入DHFR缺失的CH0细胞株DG44 (Duke大学惠赠)。转染24h后，1: 12传代，改用无核苷酸的a-MEM培养基(Invitrogen,美国)培养，同时加入5 pM的氨甲喋林，2周后挑选单个克隆转入6孔板继续培养。取培养基用Western blot或稀释1000倍后用ELISA鉴定EPO-TAT高表达细胞株。取其中六个EP0-TAT高表达株，加入氨甲喋林至50pM，继续培养2周后传代，按上述方法依次增加氨甲喋林至500pM， 5nM， 50nM， 500nM, 5(41以及至最终浓度20^M。上清用Western blot和ELISA鉴定EP0-TAT的表达，结果见图2-A。
二、 EP0-TAT融合蛋白的制备及纯化经一系列的浓度的氨甲喋林筛选后，我们获得了 EPO-TAT高表达细胞株。其中11号细胞株EP0-TAT的分泌量达到1000U/ml，大量扩增后，收集培养基用Ni-NTA琼脂糖层析柱(QIAGEN， Valencia,美国)回收纯化EP0-TAT融合蛋白。简言之，培养基用Na0H将其PH值调至8. 0，加入5M NaCl至终浓度为300mM。将5ml Ni-TAT琼脂糖加入层析柱中，用PBS洗柱两遍后，将Nl-TAT琼脂糖加入培养基中。4-C振摇结合2小时后，将Ni-TAT琼脂糖培养基加入层析柱中，用磷酸盐缓冲液(50mMNaH2P04, 300mMNaCl， 20mM咪唑imidazole,pH8. 0)洗柱6遍，然后加入洗脱液(50mMNaH2P04, 300mMNaCl，250mM imidazole, PH8. 0) 10ml洗脱EPO-TAT融合蛋白。将洗脱的EPO-TAT融合蛋白加入Slide-A-Lyzer透析盒中(PIERCE， Rockford,美国)，置于1000ml PBS中进行透析，每8小时更换一次PBS，透析6次后收集蛋白。SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮兰染色鉴定蛋白纯度。用ELISA试剂盒(R&D System, Minneapolis,美国)进行定量分析。
8理论上未糖基化的EPO-TAT分子量应为23kD， Western blot法确定纯化的EPO-TAT融合蛋白分子量为36至40kD (图2-B)，表明我们生产的EPO-TAT为糖基化的。用此法提纯的EPO-TAT纯度可达90%，浓度高达50U/W。纯化的蛋白经0. 2to滤器过滤后分装，冻存于-8(TC或冷冻真空抽干备用。
实施例3:检测TAT介导的EPO是否能增加EPO通过血脑屏障
我们制备TAT标记的EPO的目的是提高其穿透血脑屏障而增加EPO在大脑内的治疗浓度。为进一步证明此问题，我们给成年大鼠腹腔注射EPO-TAT或野生型EPO (未融合TAT)，剂量为5000U/公斤体重。注射3h后，收集血浆和脑脊液并使用ELISA试剂盒(R&D System)测定EPO含量，该试剂盒的敏感性为0.8mU/ml。我们发现这个试剂盒在测量EPO-TAT和野生型EPO的敏感性上没有差别。如图3所示，血中EPO-TAT的含量明显高于野生型EPO。脑脊液样本的监测结果显示EPO-TAT通过BBB的效率明显高于野生型EPO (大约增加2. 5倍)。这些数据支持EPO-TAT能增强EPO通过BBB的能力。ELISA按厂家说明进行，脑脊液的收集按Frankman SP (Physiol Behav. 1986; 37 (3) :489-63)所报道的方法。简言之，大鼠用1.5%异氟垸/30% 02/70%&0混和气体麻醉后，切开枕部外皮肤，暴露枕骨下膜，用25号针头插入小脑延髓池，轻轻吸取给200W脑脊液。取稀释后在显微镜下计数红细胞。血浆中EPO浓度约为脑脊液的1000倍。因此红细胞污染若大于O. 0P/。V/V或红细胞计数大于500/ml，该脑脊液样品作废。
实施例4: EPO-TAT具有抗OGD和NMDA的脑保护作用一、大鼠皮层神经元原代培养
按Cao等报道的方法进行(Cao G， J Neurosci. 2001， 21a913a0:4678x-46901)。简言之，取怀孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀将大脑皮层组织剪成约lmmi小块，用0.01%胰酶缓冲液37°(:消化30分钟后，加入马血清灭活胰酶，用吸管吹打后过滤190g离心10分钟后收集细胞，重悬于Neurobasal培养基(invitrogen)后禾中于poly—D—lysine coated 24孑L板(3X 10s)或100mm盘(5X106)中，同时加入50XB27添加剂(invitrogen)。每72小时更换一次液体。用Neurobasal培养基所得神经元纯度为95%。
二、 缺糖缺氧模型(0GD模型)
上述培养的神经元至第11天时，更换新鲜培养基，同时加入B27(-)添加剂(invitrogen)。 12小时后，更换为无糖培养基MEM-PAK (UCSF cell culture,San Francisco ， 美国)。将上述细胞置于缺氧培养室(Billups-Rothenberg,Del Mar， 美国)，通入95%氩气/5%二氧化碳气体90分钟。更换新鲜培养基及给予正常浓度氧气，继续培养24小时。为证明EPO-TAT融合蛋白是否对缺糖缺氧所致神经元损伤具有保护作用，神经元提前24小时用EPO-TAT或常规EP0(lU/ml)预处理，然后给予缺糖及缺氧，24小时后取培养基上清检测LDH活性，作为细胞死亡的标记。
三、 NMDA毒性模型
生长至11天的原代培养神经元更换新鲜培养基，加入B27(-)添加剂，同时加入EPO-TAT或常规EPO (lU/ml)，半小时后加入200南NMDA作用15分钟后更换为新鲜培养基及B27(-)添加剂。同时加入EP0-TAT或常规EPO。 24小时后用Hoechest染色细胞核。计数浓縮及片段化的细胞核比例。TAT标签的绿色荧光蛋白作为阴性对照。
为了确定纯化的EPO-TAT蛋白是否具有生物活性，我们验证了其在缺氧和葡萄糖缺乏(0GD)或醒DA毒性诱导的神经细胞死亡中的作用。90分钟缺氧后，给予正常浓度的氧和葡萄糖，24小时后测定LDH值。如图4-A所示，EPO-TAT显著保护由0GD造成的原代皮层神经元损伤，其效果与商用标准EP0(R&D System,Minneapolis,美国)相似。我们又深入研究了 EPO-TAT抗匪DA毒性的保护作用(图4-B)。阴性对照TAT标签的绿色荧光蛋白(TAT-GFP)在上述两种模型中没有保护作用，但是EPO和EPO-TAT都能显著降低由應DA诱导的细胞凋亡及坏死。这些数据证明EPO-TAT融合蛋白具有生物活性，而且TAT的加入不会减少EPO的神经保护作用。实施例5: EPO-TAT在小鼠大脑中动脉阻塞模型中的脑梗死体积的影响
一、 小鼠短暂局部脑缺血模型的制作利用单股尼龙缝合线栓塞左侧大脑
中动脉制作局部脑缺血模型。取体重25-30g， 2-3月龄雄性C57/B6小鼠(TheJackson Laboratory, Bar Harbor,美国)，1. 5%异氟烷/70°認20/30%02混和气体气管插管吸入麻醉。手术全程动物的直肠温度通过反馈恒温加热毯维持在37.0土0.5i:之间，栓塞时使用鼠尾血压监测器监测小鼠的平均动脉压，于栓塞后15分钟取动脉血行血气分析。栓塞60分钟后于各指定时间点拔出线栓恢复血供造成再灌注。手术完毕解除麻醉，小鼠被放回笼内饲养在2(TC恒温的空调屋内。
二、 梗死体积测定梗死体积的测定采用Yang所描述方法(Stroke. 1994，25(1) :165-70)。概括如下于再灌注不同时间点处死动物，快速取出脑组织，冠状位切片，共6片，每片厚2毫米，将切好的脑片放入用PBS配置的2%TTC
(氯化2， 3， 5-三苯基四氮唑)溶液中，37. 5。C水浴20分钟，然后将其放入4%的多聚甲醛中固定15分钟后取出拍照。使用图像分析系统(MCID，St. Catherine' s，加拿大)。计算机图像分析系统计算各层脑组织面积。公式为梗塞面积=非梗塞面积-梗塞侧正常脑组织面积，这样可以减小脑水肿对计算梗塞面积的影响。总的梗塞体积二各层梗塞面积X层厚(2mm)。为了验证TTC染色测定梗死体积的准确性，实验室进行了组织学染色与之对比。将动物处死后快速取脑，将脑组织放入2-甲基-丁烷在3(TC下冰冻。行冠状位连续冰冻切片，每片厚20陶，每隔0. 5mm取一张脑片(每个脑组织大概可取22-24张脑片)。
切好的脑组织切片进行甲酚紫染色，按上述的方法进行梗塞体积的计算。
我们进一步证实了 EP0-TAT在小鼠脑缺血再灌注模型中的神经保护作用。C57/B6小鼠大脑中动脉栓塞60分钟再灌注72小时后造成同侧半球梗死，TTC染色显示梗死体积大约为32 mm:'。缺血后再灌注即刻使用1000U/kg EP0-TAT可明显减少梗死体积(P〈0.01，与空白对照组比较)，其效果与5000U/kg野生型EP0相似(图5-A和5-B)。表明EP0-TAT能显著促进EP0穿透血脑屏障而进入大脑，因而可显著降低EPO的注射剂量。序列表
<110>曹国栋、陈俊、罗玉敏、吉训明、邢娟〈120〉血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用<130〉<160〉 68
<170〉 Patentln version 3. 5
〈210〉 1
〈211〉 582
〈212〉 DNA〈213〉人属，人种
<400〉 1 (人类促红细胞生成素cDNA)
atgggggtgc acgaMgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct GO
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240
atggaggtcg ggcagcaggc cgt卿agtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582
<210〉 2
<211〉 193
<212〉 PRT〈213〉人属，人种
12<400〉 2 (人类促红细胞生成素氨基酸序列)
MetGly ValHisGluCysProAla TrpLeuTrp LeuLeuLeuSer Leu Leu SerLeu Pro
15101520
LeuGly LeuProValLeuGlyAla ProProArg LeulieCysAsp Ser Arg ValLeu Glu
25303540
ArgTyr LeuLeuGluAlaLysGlu AlaGluAsn lieThrThrGly Cys Ala GluHis Cys
45505560
SerLeu AsnGluAsnlieThrVal ProAspThr LysValAsnPhe Tyr Ala TrpLys Arg
65707580
MetGlu ValGlyGinGinAlaVal GluValTrp GinGlyLeuAla Leu Leu SerGlu Ala
859095100
ValLeu ArgGlyGinAlaLeuLeu ValAsnSer SerGinProTrp Glu Pro LeuGin Leu
105110115120
HisVal AspLysAlaValSerGly LeuArgSer LeuThrThrLeu Leu Arg AlaLeu Arg
125130135140
AlaGin LysGluAlalieSerPro ProAspAla AlaSerAlaAla Pro Leu ArgThr lie
145150155160
ThrAla AspThrPheArgLysLeu PheArgVal TyrSerAsnPhe Leu Arg GlyLys Leu
165170175180
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg185 190
<210〉 3<211〉 166〈212〉 PRT<213〉人属，人种
〈400〉 3 (成熟的人类促红细胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
13Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
〈210〉 4〈211〉 178<212> PRT〈213〉人属，人种
<400〉 4 (具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Uu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg165 170 175 178
〈210〉 5
〈211〉 178
〈212〉 PRT<213〉人属，人种
〈400〉 5 (具有蛋白转导功能的突变型(R14E)人类促红细胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp1 5Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu10 15His Cys Ser
CysTyr
Glu
Trp
Lys Arg Met
Ala30Ala
45 50Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Leu Asn Glu Asn35
105 110
Glu Val55
Leu Arg75
Val Asp95
Gin Lys115
Gly GinGly GinLys AlsGlu Ala
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser100
lie Ser120Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 6
<211〉 178
〈212〉 PRT 〈213>人属，人种
<400〉 6 (具有蛋白转导功能的突变型(R14A)人类促红细胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Ser Arg Val Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30 35 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 8590 95
Gly Gin Gly Gin Lys Ala
Ala
Val
Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 105 110 115
Leu Arg 130
Arg Gly 150
Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Thr lie Thr Ala Asp 135 Lys Leu Tyr 155
Lys Leu
Glu Ala lie Thr Phe Arg Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg165 170 175 178
<210〉 7 〈211〉 178 <212> PRT <213〉人属，人种
<400〉 7'(具有蛋白转导功能的突变型(S100A)人类促红细胞生成素氨基j酸序歹ij)AlaProProArgLeulieCysAspSerArgValLeuGluArgTyr LeuLeuGluAlaLys
15101520
GluAlaGluAsnlie 25ThrThrGlyCysAla 30GluHisCysSerLeu Asn 35GluAsnlieThr 40
ValProAspThrLys 45ValAsnPheTyrAla 50TrpLysArgMetGlu Val 55GlyGinGinAla 60
ValGluValTrpGin 65GlyLeuAlaLeuLeu 70SerGluAlaValLeu Arg 75GlyGinAlaLeu 80
LeuValAsnSerSer 85GinProTrpGluPro 90LeuGinLeuHisVal Asp 95LysAlaValAla 100
GlyLeuArgSerLeu 105ThrThrLeuLeuArg 110AlaLeuArgAlaGin Lys 115GluAlalieSer 120
ProProAspAlaAla 125SerAlaAlaProLeu 130ArgThrlieThrAla Asp 135ThrPheArgLys 140
LeuPheArgValTyr 145SerAsnPheLeuArg 150GlyLysLeuLysLeu Tyr 155ThrGlyGluAla 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 8 <211〉 178 <212〉 PRT <213〉人属，人种〈400〉 8 (具有蛋白转导功能的突变型(S100E)人类促红细胞生成素氨基酸序列) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg
165 170 175 178
<210〉 9 〈211〉 178 〈212〉 PRT 〈213〉人属，人种
〈400〉 9 (具有蛋白转导功能的突变型(R103A)人类促红细胞生成素氨基酸序列) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Ala Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
<210〉 10 <211〉 178 <212〉 PRT <213>人属，人种
<400〉 10 (具有蛋白转导功能的突变型(R103E)人类促红细胞生成素氨基酸序 列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
〈210〉 11
〈211〉 178
<212〉 PRT 〈213〉人属，人种
〈400〉 11 (具有蛋白转导功能的突变型(S104I)人类促红细胞生成素氨基酸序 列)
Leu lie Cys Asp Ser Arg 5 10 lie Thr Thr Gly Cys Ala 25 30 Lys Val Asn Phe Tyr Ala 45 50 Gin Gly Leu Ala Leu Leu 65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro
85 90 Gly Leu Arg lie Leu Thr Thr Leu Leu Arg 105 110
Ala Pro Pro Arg 1
Glu Ala Glu Asn Val Pro Asp Thr Val Glu Val Trp
Val
Glu
Trp
Leu Glu Arg His Cys Ser Lys Arg Met
Ser Glu Ala Val
Leu Gin Leu His
Ala teu Arg Ala
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 20 Leu Asn Glu Asn lie Thr
35 40 Glu Val Gly Gin Gin Ala
55 60 Leu Arg Gly Gin Ala Leu
75 80 Val Asp Lys Ala Val Ser
95 100 Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
20Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Arg Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 165 170 175 178
权利要求
1.血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端连接有具有蛋白转导功能的蛋白转导序列；蛋白转导序列包括(1)HIV TAT；(2)由5-10个精氨酸组成的多聚精氨酸；(3)果蝇控制触角基因的同源结构域；(4)单纯疱疹病毒VP22。
2. 根据权利要求1所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于 所述HIV TAT标记为含有11个氨基酸残基RGRKKRRQRRR的肽或来自HIV TAT的 其它肽段。
3.根据权利要求l所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于具有蛋白转导功能的人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表SEQ ID No. 4;具 有蛋白转导功能的突变型人类促红细胞生成素氨基酸序列为序列表中SEQ ID No. 5至No. 11。
4. 根据权利要求1所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于 所述野生型EPO的衍生物包括由氨基酸定点突变而产生的突变型EPO、甲酰化 EPO、或无唾液酸EPO。
5. 权利要求1至4中任何一项所述的血脑屏障穿透性促红细胞生成素在制 备药物中的应用，其特征在于所述药物是治疗脑卒中、急性心肌梗死、外伤 性脑损伤、脊髓损伤、急性外伤性器官损伤、急性中毒、急性器官衰竭以及麻 醉意外、外伤或疾病引起的呼吸或心跳暂停而引起的全身器官衰竭的药物。
全文摘要
本发明公开了一种血脑屏障穿透性促红细胞生成素，属于生物制药领域。血脑屏障穿透性促红细胞生成素，其特征在于在野生型EPO或野生型EPO的衍生物的羧基末端连接有具有蛋白转导功能PTD，选自(1)HIV TAT；(2)由5-10个精氨酸组成的多聚精氨酸；(3)果蝇控制触角基因的同源结构域；(4)单纯疱疹病毒VP22。本发明的创新性在于与野生型EPO相比EPO-TAT具有两个优势第一，EPO-TAT可显著减少治疗脑卒中所需EPO的剂量，从而明显减轻了EPO的副作用；第二，EPO-TAT可以延长脑卒中治疗时间，从而使更多脑卒中病人达到治疗。
文档编号A61P9/00GK101671388SQ20081022210
公开日2010年3月17日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者吉训明, 曹国栋, 罗玉敏, 娟 邢, 俊 陈 申请人:曹国栋;陈 俊;罗玉敏;吉训明;邢 娟