锦鲤疱疹病毒抗血清制备方法及其应用与流程

文档序号:12342425阅读:来源:国知局

技术特征:

1.锦鲤疱疹病毒抗血清,其特征在于,制备方法包括以下过程:

(1)、免疫动物准备

选健康锦鲤免疫动物,未接种过锦鲤疱症病毒病疫苗,体重为150~350g,体长15~25cm;接种前于室温环境下养殖不少于一周,定期少量喂食;

接种前,尾静脉采血,分离血清,作为阴性血清,冷冻保存备用;

(2)、免疫接种

取纯化的锦鲤疱症病毒抗原,含量不低于1mg/mL,50℃水浴1min灭活,与等量不完全佐剂混合,背部皮下多点注射,每条鱼注射0.2mL;接种后,定期少量喂食,并保持水体环境;

接种后第14天,尾静脉采血,分离血清测效价,每隔2周,采血测效价,剔除血清效价无变化的锦鲤;

第10~12周,当血清效价达到顶峰时,心脏或尾静脉大量采血,分离血清,测效价,分装冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的锦鲤疱疹病毒抗血清,其特征在于,所述的血清测效价的方法,为间接ELISA测血清效价,包括以下过程:

用包被液将纯化的锦鲤疱症病毒抗原稀释至0.5μg/mL,加入酶标板,每孔100μL,37℃2h;包被液包括8.4g/L的NaHCO3、3.56g/L的Na2CO3,pH9.5;

每孔加260μL PBST洗板3次,PBST的pH8.0;

用含10%脱脂奶粉PBST分别将抗血清和阴性血清进行10倍倍比稀释,即分别为1:10、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200,每种血清每个稀释度加2孔,每孔100μL,25℃环境下1h,洗板3次;

加入稀释兔抗鲤鱼IgM-HRP,每孔100μL,25℃环境下1h,洗板3次;

每孔加入底物TMB溶液100μL,25℃孵育20min,每孔加入1N硫酸溶液100μL终止反应,酶标仪测量OD450;相同稀释度下,当抗血清OD450值不低于1.0,阴性血清OD450值不高于0.2,即为血清效价。

3.根据权利要求1或2所述的锦鲤疱疹病毒抗血清,其特征在于,所述的纯化的锦鲤疱症病毒抗原,是通过密度梯度离心法或者沉淀法、分子筛法获得。

4.根据权利要求1所述的锦鲤疱疹病毒抗血清的应用,其特征在于,获得的锦鲤疱疹病毒抗血清,用于IFAT、ELISA免疫学方法检测KHV抗原,或作为KHV抗体检测方法的阳性血清,或用于制备免疫学检测KHV或KHV抗体的商品化试剂盒。

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