mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物中的用图
【专利说明】
[0001] 本申请要求申请日为2014年7月10日，申请号为201410328042. 8,发明名称为 "一种肾毒性生物标志物及其用途"的中国专利申请的优先权。本申请引用该中国专利申请 的全文。
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物 中的用途及试剂盒和引物。
【背景技术】
[0003] 肾脏是体内最重要的排泄器官，也是外源性毒物在体内的主要靶器官之一。很多 化合物（药物）进入体内可引起肾脏毒性损伤，据调查，急性肾功能衰竭中有32. 4%是由于 药物肾毒性引起的。因此急需建立发现和确证新的肾毒性生物标志物，能够早期发现肾损 伤，并可以反映出肾脏损伤的改善或加重，甚至能反映损伤的机制。
[0004]当前常规的肾毒性评价方法，非临床药物安全性评价和临床上常用的肾损伤指标 为血清肌酐（CRE)和尿素氮（BUN)，再进行病理组织学检查。CRE易受年龄、性别、种族、饮 食和机体内环境的影响，并且无法预测早期病变，不能反映肾小管的损伤和坏死；BUN不仅 受肾功能的影响，还受肾外因素如高蛋白饮食、消化道出血等的影响。而且两者需要病人发 生急性肾损伤（AKI)几天后才有限制升高，会延误肾毒性早期发现、诊断和治疗。
[0005] 随着肾毒性研究的深入，发现了一些新的肾脏毒性损伤的检测指标，如尿总蛋白 (uTP)、血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)作为药物肾小球损伤的生物标记物；丛生蛋白、 肾损伤分子（MM-l)、三叶因子-3 (TFF-3)可作为肾小管损伤的生物标志物，但是存在敏感 性、特异性及检测方法的问题，难以取代传统的肾毒性检测。因此，寻找及时、可靠、可行性 强的肾毒性的生物标记物十分有意义。
[0006] miRNA是一类内源性、非编码、单链小RNA。它们可以和靶基因mRNA-3'端非翻译 区（3' -UTR)部分或全部互补结合，在翻译后水平调苄基因表达，导致靶基因出现翻译抑制 或mRNA降解。成熟miRNA大小约18到25个核苷酸。它们首先在细胞核内转录形成初级 miRNA(pri-miRNA)，然后在由RNAase III、Dicer和Drosha形成的蛋白复合体以及RNA聚合 酶II的作用下形成前体miRNA(pre-miRNA)。pre-miRNA从细胞核进入细胞衆内，被Dicer 酶切为约22个核苷酸的双链miRNA。随后双链被切断，形成一条成熟的单链miRNA。单链 miRNA和RNA诱导的沉默复合体结合并选择性作用靶基因mRNA的反义互补序列，最终调控 靶基因的表达。
【发明内容】
[0007]因此，本发明要解决的技术问题是针对现有的肾毒性生物标记物特异性低、不能 早期发现检测、检测方法过于复杂等的问题，提供一种mo-miR-877在制备肾毒性生物标志 物中的用途及试剂盒和引物。所述的用途能够将mo-miR-877应用于肾毒性生物标志物的 制备从而检测外源性化合物引起的肾损伤；所述的试剂盒能够特异性检测外源性化合物引 起的肾损伤；所述的引物能够特异性扩增用以制备肾毒性生物标志物的mo-miR-877。
[0008] 本发明提供rno-miR-877作为肾毒性生物标志物的用途。
[0009] 本发明中，所述的rn〇-miR-877是一种miRNA。本发明中，大鼠的rn〇-miR-877,具 有序列表中SEQ ID No. 1所述的碱基序列。
[0010] 本发明中所述的肾毒性较佳地来源于外源性化合物引起的肾损伤。所述的 rno-miR-877作为肾毒性生物标志物可以用于检测外源性化合物引起的肾损伤。
[0011]本发明所述的外源性化合物为本领域常规，较佳的是庆大霉素（GM)、顺铂、N-苯 基邻氨基苯甲酸或阿霉素，更佳的是庆大霉素。
[0012] 本发明中，较佳地，rno-miR-877作为唯一的肾毒性生物标志物单独使用，或者和 常规的肾毒性生物标志物联合使用。优选的，所述的常规肾毒性生物标志物是血清肌酐、尿 素氣、尿总蛋白和丛生蛋白。
[0013] 本发明rno-miR-877作为肾毒性生物标志物用于检测外源性化合物引起的肾损 伤的方法，可以包括以下步骤，检测肾组织中rno-miR-877的含量。
[0014] 本发明还提供一种检测外源性化合物引起的肾损伤的试剂盒，其包括特异性检测 mo-miR-877的引物，所述的引物为核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA片段。
[0015] 较佳地，所述的试剂盒还包括RNA抽提试剂、反转录试剂和/或qPCR试剂。所述 的RNA抽提试剂为本领域常规的RNA抽提试剂，较佳地为TRIZ0L。所述的反转录试剂为本 领域常规的反转录试剂，较佳地为RNA逆转录酶。所述的qPCR试剂为本领域常规的所述的 qPCR试剂，较佳地为DNA聚合酶。
[0016] 本发明还提供一种特异性检测mo-miR-877的引物，其是核苷酸序列如序列表中 SEQ ID No. 2所示的DNA片段。
[0017] 本发明人发现，rno-miR-877在外源性化合物引起的肾损伤的大鼠血液白细胞中 高表达。所述的血液白细胞可以来源于各个组织的血液，较佳的，后腹主动脉。
[0018] 本发明寻找肾毒性生物标志物的方法，包括对miRNA芯片表达谱的分析，比较雌 雄大鼠分别经外源性化合物处理的不同时间和不做任何处理的对照组的表达谱，然后根据 已知的功能预测可能的肾毒性生物标志物。
[0019] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0020] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0021] 本发明的积极进步效果在于：本发明的发明人发现mo-miR-877是外源性化合物 引起的肾损伤的特异性的生物标志物，在外源性化合物引起的肾损伤的血液白细胞中高表 达，能够发挥在制备肾毒性生物标志物中用途，从而可以检测外源性化合物引起的肾损伤。 本发明提供的试剂盒能够特异性强、可行性高地检测肾毒性生物标志物，从而检测外源性 化合物引起的肾损伤。本发明提供的引物能够特异性强地扩增mo-miR-877,并应用于所述 的试剂盒中检测外源性化合物引起的肾损伤。
【附图说明】
[0022] 图1为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变（阴性对照组D2)。
[0023] 图2为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变（80mg/kg组D4)。
[0024] 图3为大鼠连续肌肉注射庆大霉素后肾脏组织病理学改变（80mg/kg组D8)。
【具体实施方式】
[0025] 本发明人以rno-miR-877为例，通过miRNA表达谱芯片数据分析，发现 rno-miR-877是外源性化合物引起的肾损伤的肾毒性生物标志物。检测发现rno-miR-877 在外源性化合物引起的肾损伤的肾组织中高表达。应用rno-miR-877为肾毒性生物标志 物，可以检测外源性化合物引起的肾损伤。
[0026] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0027] 实施例1寻找肾毒性生物标志物
[0028] 1. 1肾损伤模型的建立
[0029] 1. 1. 1实验材料和仪器
[0030] 实验试剂及仪器
[0031] 阳性药：硫酸庆大霉素注射液（批号：20110406,购自湖北制药有限公司，规格： 2mL :8万单位；80mg即为8万单位）；
[0032] 溶媒对照品：0. 9 %氯化钠注射液（生理盐水）（批号11010463 :购自山东长富结 晶药业有限公司）
[0033] CRE(Rl)(肌酐）测定试剂盒由日本和光纯药工业株式会社（Wako)生产，BUN(尿 素氮）检测试剂盒由德国罗氏诊断有限公司生产。
[0034] HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。
[0035] 实验动物
[0036] SPF级SD大鼠200只，雌雄各半，首次给药时体重在170~230之间，周龄在6~8 周之间。动物购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号为SCXK (沪）2008-0016。 动物采用苦味酸和伊红进行标识，5只/笼，每笼动物均有笼牌。动物饲养于国家上海新药 安全评价研究中心的SPF级动物房，动物房温度控制在22~26摄氏度，湿度控制在40~ 70%之间，每分钟通气次数多15次，12小时/12小时的明暗光照周期，动物自由摄食，饲料 为由北京科澳协力饲料有限公司提供的钴60辐照灭菌SPF大小鼠繁殖颗粒饲料，动物通过 饮水瓶自由饮用自制的去离子水。
[0037] 1. 1. 2实验方法
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