38] 1. 1. 2. 1阳性药的配制
[0039] 用生理盐水将阳性药硫酸庆大霉素注射液稀释成所需浓度。现配现用，室温保存。 具体见表1 :
[0040] 表1阳性药硫酸庆大霉素注射液配制表
[0041]
[0042] L L 2. 2动物试验剂量设置
[0043] 硫酸庆大霉素注射液的临床用法为，成人采用肌肉注射或者稀释后静脉滴注，1次 80mg (即8万单位）或者按照体重一次1~1. 7mg/kg，每8小时1次，稀释采用生理盐水或 者5%葡萄糖注射液。本实验给予硫酸庆大霉素后希望导致：①.动物肾脏出现不同程度的 损伤；②.在不同时间出现不同程度的损伤：轻微的至严重的肾脏损伤；③.出现一定的剂 量依懒性和时间依赖性损伤。因此本实验设置5、20和80mg/kg组，同时设置阴性对照组， 给予生理盐水，具体见表2 :
[0044] 表2实验剂量设计
[0045]
[0046] 1. 1. 2. 3给药及观察检查
[0047] 阴性对照组和硫酸庆大霉素3个剂量组的给药途径均为肌肉注射，给药部位为大 鼠左右后腿股四头肌，每天给药1次，给药容量为2mL/kg。每次每只动物的左右后腿各注射 lmL/kg，每次的给药体积均根据最近一次测得的体重计算。
[0048] 试验期间每天上下午各观察1次动物死亡及濒死情况。给药期间每天观察2次临 床征状，上、下午各1次。
[0049] 给药第1、3、5、7和14天给药前称重，以及恢复期7、14、21和28天称重，每次解剖 前称重仅用于计算脏器系数。
[0050] 在首次给药后24小时、3天、7天、14天以及给药14天恢复期28天后，每个时间点 分别取10只动物（雌性各半），均从颈静脉采血约〇. 5mL，以1660g离心15min后吸取上清 液，用尿素酶法检测BUN、肌酐酶法检测CRE浓度。
[0051] 1. 1. 2. 4血清生化检测结果
[0052] 给药1天（D2)和3天（D4)后，给予庆大霉素组动物的血清BUN和CRE均值与阴性 对照组相比均未见明显统计学差异。给药7天（D8)后，5和20mg/kg组的血清BUN和CRE均 值与阴性对照组相比均未见明显统计学差异，而80mg/kg组的雌性动物的血清BUN和CREA 均明显高于阴性对照组（P〈〇. 05)，雄性动物血清CRE也明显高于阴性对照组（P〈0. 05)。给 药14天（D15)后，5mg/kg组雌雄动物的血清BUN和CRE均值也仍未见明显差异，20mg/kg 组雌性动物的血清CRE明显高于同期阴性对照组（P〈0. 05)，20mg/kg组雄性动物的血清BUN 和CRE与阴性对照组相比未见明显差异，而80mg/kg组雌雄性动物的血清BUN和CRE均明 显高于阴性对照组（P〈〇. 05)，结果见表3,表4。
[0053] 给药14天恢复期28天（R29)后，5和20mg/kg组雌雄动物的血清BUN和CRE与阴 性对照组相比均未见明显统计学差异。80mg/kg组雌雄性动物的血清CRE均值均明显低于 阴性对照组（P〈〇. 05)，而血清BUN均值与阴性对照组相比均未见明显异常。
[0054] 表3雌性动物肌肉注射庆大霉素后血清生化结果
[0055]
[0056]
[0057] *P〈0. 05, **P〈0. 01，与 Omg/kg 组比较；BUN 单位 mmol/L ;CRE 单位 umol/L ;D :给药 天数，R恢复天数。
[0058] 表4雄性动物肌肉注射庆大霉素后血清生化结果
[0059]
[0060] *P〈0.05,**P〈0.01，与Omg/kg组比较；BUN单位mmol/L ;CRE单位umol/L;D:给药 天数，R恢复天数。
[0061] 1. 1. 2. 5组织病理学检查结果
[0062] 组织病理学的改变见图1-3。给药1天后，阴性对照组和各剂量组动物肾组织病理 学未见明显与给药相关的改变（图1);给药3天后，阴性对照组和5mg/kg组动物肾组织病 理学未见明显与给药相关的改变，20和80mg/kg组部分雌雄动物肾可见轻微至轻度局灶性 肾小管扩张（图2)，其余未见明显异常；给药7天和14天后雌雄动物肾组织病理学改变类 似，阴性对照组和5mg/kg组动物肾均未见明显给药相关的改变，20mg/kg组雌雄动物均可 看到部分动物轻微至轻度的炎细胞浸润，轻微至轻度的局灶性肾小管扩张等轻微的改变， 80mg/kg组所有动物可见明显的局灶性肾小管上皮细胞变性坏死，局灶性肾小管嗜碱性变， 不同程度的炎细胞浸润，不同程度的局灶性肾小管扩张以及不同程度的局灶性管型等异常 改变（图3);给药14天恢复28天组，阴性对照组、5和20mg/kg组未见明显与给药有关的 异常，但各组均偶见自发的轻微炎细胞浸润、轻微嗜碱性小管等病变，高剂量组雌雄动物仍 可见局灶性炎细胞浸润和不同程度的嗜碱性小管及肾小管管型。
[0063] 1. 1. 2. 6结论
[0064] 本部分实验采用SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素5、20和80mg/kg和生理盐水对 照，同时设置给药1天（D2)、3天（D4)、7天（D8)、14天（D15)和给药14天恢复28天（R29) 后五个时间点采血进行血清生化检测、大体解剖观察、肾脏称重和组织病理学观察，以观察 庆大霉素诱导的肾损伤情况。
[0065] 血清生化检测，给药7天（D8)后，80mg/kg组动物BUN和CRE均升高。给药14天 (D15)后，80mg/kg组动物BUN和CRE均升高，20mg/kg组动物CRE也升高。给药14天恢复 28天（R29)后BUN和CRE末可基本恢复。
[0066] 病理组织学检查主要可见肾小管的损伤，包括坏死、肿胀、脱落等。肾组织病理学 检查发现，给药3天（D4)后，20和80mg/kg组肾见局灶性肾小管扩张；给药7天（D8)和14 天（D15)后，20mg/kg组肾脏见炎性细胞浸润和局灶性肾小管扩张，80mg/kg组肾见局灶性 肾小管上皮细胞变性坏死、炎性细胞浸润、局灶性管型（轻度）等。给药14天恢复28天 (R29)后，仅见80mg/kg组肾见嗜碱性小管、肾小管管型。
[0067] 综上可见，SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素后成功地诱导大鼠肾损伤，并且出现了 明显的时间依赖性和剂量依赖性的改变，因此庆大霉素诱导肾损伤模型成立，可用于肾毒 性生物标志物进一步探索。
[0068] 1. 2miRNA表达谱芯片的制备
[0069] 1. 2. 1 取样
[0070] 分别取相同品种属种、年龄相近大小均一一致的正常大鼠和已经建立好的肾损伤 模型中有肾损伤的大鼠各三只。大鼠解剖后立刻去肾脏称重，称重后取约〇. 5*0. 5cm大小 的肾脏组织，立刻加入至装有约lmL RNAlater液的4°C预冷过夜的EP管，并剪成小块，再放 入4°C冰箱，使其充分浸润，随后转入-80 °C保存备用。
[0071] 1.2.2总尺熟的提取
[0072]采用mirVana? PARISTM(Cat#AM1556, Ambion, Austin, TX, US)并且根据生产 厂商提供的标准操作流程进行样品的total RNA抽提，抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)电泳质检合格后备用。
[0073] 操作步骤如下：
[0074] (1)配制70%乙醇：35mL无水乙醇与15mL无核酸酶水混勾。
[0075] (2)离心均应4°C条件下进行，离心速度为13200rpm。
[0076] (3)匀浆：每100mg组织加入lmL TRIZ0L试剂，并用匀浆器匀浆。
[0077] (4)取已经加入lmL的TRIZ0L的白细胞；
[0078] (5)每lmL的TRIZ0L，加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混勾lmin左右，室温 静置5min。离心15min。小心取出上清液，避免触及中间层，将上清夜转入新的1.5mL离心 管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min。离心15min吸去上清，保留沉淀， 并向沉淀中加入lmL 70%乙醇，离心10min洗涤沉淀。吸去上清，沉淀室温自然晾干后适量 无RNA酶的水，用Tip头吹吸，充分溶解沉淀。
[0079] (6)样品储存在-80°C。
[0080] 1.2.3RNA 质量鉴定
[0081] 使用NanoDrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度。使用Agilent 2100Bioanalyzer验证RNA质量。结果显示所有样品均合格，可用于RT-PCR和芯片杂交分 析。
[0082] 1. 2. 4miRNA 标记和纯化
[0083]实验样品 RNA 采用 Agilent miRNA 芯