C-kit基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种C-KIT多点突变单管快速检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] C-kit是一种原癌基因，位于染色体4qll_12,大小约80 kb，人类C-kit受体是由 C-kit原癌基因编码的跨膜受体，全长976个氨基酸，相对分子质量为145,该受体具有胞外 配体结合区、跨膜区、膜内近膜区和酪氨酸蛋白激酶区（包含TK1和TK2两部分），属于III型 酪氨酸激酶受体家族。
[0003] 胃肠道间质瘤（gastro in testina 1 stromal tumor，GIST)是消化道最常见 的间叶性肿瘤，也是肿瘤生物靶向治疗中的典范。胃肠道间质瘤起源于胃肠道卡哈尔间质 细胞（interstitial cell of Cajal，ICC)或向ICC分化的原始间充质细胞。
[0004] 绝大多数G 1ST表达c-kit编码的K IT蛋白（⑶117)，且在许多病例中存在c-k it基因突变，由此通过相互独立地获得传导性激活。即在无配体结合的情况下，K IT仍然 能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号传导通路[1-3]。胃肠间 质瘤的C-kit突变区主要集中在4个外显子：9、11、13、17,最常见的为11外显子突变，约占 65%〇
[0005] 目前研究表明，原癌基因c-kit不仅参与了ICC分化发育及GIST的发生发展， 而且c-kit基因突变还与GIST危险度、基因靶向药物耐药性及预后有关，伊马替尼（Imat in ib mesy late ST 1-571)或称为格列卫（G leevec)作为一种KIT酪氨酸激酶抑制 剂，已应用于转移性和手术难于切除病例的治疗以及部分高度侵袭危险性病例的术后预防 性化疗。
[0006] c-kit基因药物敏感的突变点，目前普遍认为需检测7个突变位点，市面上的荧光 PCR检测试剂盒普遍使用单管一点进行检测，分析过程繁琐而且没有必要。
[0007] 本专利使用多点突变并行检测技术，在单管中，可通过荧光基团的指示作用，在同 一个PCR反应中，即可同时检测出多个突变位点。不需分开几个PCR管分别进行。实现简 单，方便的C-KIT点突变检测。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种高效的C-KIT多点突变单管快速检测方法及试剂盒。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： 1) 设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探 针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分 与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补； 2) 将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热 启动快速Taq酶系统混合，扩增； 3)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。
[0010] 作为上述方法的进一步改进，ARMS引物对应的下游引物、中介连接引物、通用荧 光探针应为简并的，即一条下游引物、中介连接引物、通用荧光探针可以对应于多条。
[0011] 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针上连接荧光基团的核苷酸和淬灭探针 上连接淬灭基团的核苷酸在互补配对后的间距不超过4个核苷酸，进一步的，不超过3个、 2个、1个或连接在相互配对的两个核苷酸上。
[0012] 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与突变位点下游的部分序列互补的 核酸数量不少于l〇bp，特别的，互补的核酸数量为15~30bp。
[0013] 作为上述方法的进一步改进，中介连接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对 的核酸数量不少于l〇bp，特别的，互补的核酸数量为15~45bp。
[0014] 互补序列的存在，有利于保证引物间存在足够的亲和力，保证检测结果的可靠性。
[0015] 作为上述方法的进一步改进，通用荧光探针的一端连接有保护核酸序列。保护序 列的作用在于防止探针的关键序列不被反应体系中无意引入的核酸外切酶过早切除。保护 序列不与待测序列、引物等互补配对，可以是简单重复序列，如多个A、T、C、G等。
[0016] 一种C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，热启动快速Taq酶 系统和C-KIT突变检测引物，其特征在于：所述C-KIT突变检测引物由多组ARMS引物及对 应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针组成；其中：中介连接引物的一 端序列与待C-KIT突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通用荧光探针部分核酸互 补配对。
[0017] 优选的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与 C-KIT突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10 bp，特别的，互补的核酸数量为 15 ~30bp〇
[0018] 优选的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与通 用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10 bp，特别的，互补的核酸数量为15~ 45bp〇
[0019] 特别的，上述C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如 下： ARMS 引物 1 :AAGACTTCTGCCTATGCCTAT ARMS 引物 2 :ATGTATGAAGTACAGGTTGT ARMS 引物 3 :GGTAATCACATGAATATTGC ARMS 引物 4 :GATTTTGGTCTAGCCAGAGT ARMS 引物 5 :TAGCCAGAGACATCAAGAATT ARMS 引物 6 :ACATCAAGAATGATTCTAAG ARMS 引物 7 :CATCAAGAATGATTCTAATG ARMS引物1对应的下游引物为Y1 :GAGCCTAAACATCCCCTTAAAT ARMS引物2对应的下游引物为Y2 :TACTGACCAAAACTCAGCCTGT ARMS引物3对应的下游引物为Y3 :AAATCATATTAAAATGTCATGT ARMS 引物 4-7 对应的下游为引物 Y4 :AGITGAAACTAAAAATCCTIT ARMS引物1对应的中介引物为Z1: ACCTCGCTCTGAGCTCTACGTAACAACAAAGGTATATTTC ARMS引物2对应的中介引物为Z2: ACCTCGCTCTGAGCTCTACACATAGACCCAACACAACT ARMS引物3对应的中介引物为Z3: ACCTCGCTCTGAGCTCTACGTAAAGCCGTGTCCAAGCTGC ARMS引物4-7对应的中介引物为Z4 : ACCTCGCTCTGAGCTCTACACGTGAGTACCCATTCTCT。
[0020] 特别的，上述c-kit多点突变单管快速检测试剂盒中使用的通用荧光探针的序列 为： 5 ' GA (dT-FAM) GCTCTGTAGGTGTAGAGCTCAGAGCGAGGITITITITITITITITIT-3 '，对应的淬灭 序列为：5' BHQ-GAGCATC-3'。