[0021] 热启动快速Taq酶系统的组成为dNTPS (U)、UNG酶、热启动快速Taq酶。
[0022] 本发明的有益效果是： 1) 本发明操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引 物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本； 2) 本发明检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量； 3) 本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管检 测，节省人力物力； 4) 本发明的检测方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。
【附图说明】
[0023] 图1到图6是本发明检测方法的原理图； 图7是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲线，说明本试剂盒中使用的 快速Taq酶比普通Taq酶的扩增效果好。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。
[0025] 以c-kit突变点D816V为例，该点的野生型为A，突变型为T，在PCR过程中，首先 使用1对引物，含1条针对突变点的ARMS引物（引物最后一个碱基为T)和下游引物。该引 物在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点T。野生型位点A不被扩增，如图1所示； 当特异性扩增发生后，在ARMS引物的引导下，快速Taq酶沿着DNA模板，向5'_3'方向 移动并水解中介连接引物的序列介导区域，而中介连接引物的探针互补区域则被释放，如 图2、图3所示； 释放出来的探针互补区域，基于碱基互补配对原则，与通用荧光探针发生互补，在淬灭 基团的存在下，荧光基团的荧光被淬灭，如图4所示； 快速Taq酶通过中介连接引物的探针互补区域，向5' -3'方向移动，水解淬灭基团，从 而淬灭基团远离荧光基团，从而PCR反应产生了荧光，如图5、图6所示。
[0026] 因此，只要多个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物，1组通用荧光探 针与通用淬灭互补探针，可以置于一个PCR反应管中，即可以检测出样本中是否存在点突 变，显著提高了 ARMS法的检测通量。
[0027] 实施例1 1. C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，主成分如下： 1)DNA提取液： 50mM Na0H、10mMTris-HCl (PH8.0)、l%NP-40、6%Chelex、0.1mM EDTA (PH8.0)组成。
[0028] 2)快速Taq酶系统： 3U 的快速 Taq，0. 5ul 的 dNTPs (25mM)。
[0029] 3)引物： C-KIT ARMS引物及对应的下游引物：
[0030] 4)通用荧光探针对如下： 通用荧光探针： 5? GA(dT-FAM)GCTCTGTAGGTGTAGAGCTCAGAGCGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3?, 通用淬灭互补探针：5' BHQ-GAGCATC-3'。
[0031] 2.使用C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，操作步骤如下： 1)DNA提取： 取2片10 ym的FFPE组织切片，刮取下来后放入到1. 5ml离心管中，再加入120 y 1的 DNA提取液，100°C煮沸10分钟后，将离心管12000rpm离心5分钟，取10 y 1的上清加入到 PCR反应管中。
[0032] 2)快速 PCR : 50 y 1 荧光 PCR 体系中，3U 的快速 Taq 酶，10mM Tris-HCL，50mM KCL，0? 5U 的 UNG 酶， 0. 2mM dNTPS (U)，3mM MgC12。通用荧光探针与通用淬灭互补探针各lym，28个突变位点 的ARMS引物、下游引物和中介连接引物各1 y m。95度5min后，95°C 5秒，58°C 31秒，循环 数为40循环。
[0033] 3)监测反应体系的荧光变化，如存在点突变，则荧光信号会增长。
【主权项】
1. 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： a)设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用荧光探 针，其中，中介连接引物由与通用荧光探针部分序列互补的通用序列部分和与点突变下游 的部分序列互补的特异部分组成；b)将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用 荧光探针与快速Taq酶系统混合，扩增；c)检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突 变。2. -种C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，快速Taq酶系统和 C-KIT突变检测引物，其特征在于：所述C-KIT突变检测引物由多组ARMS引物及对应的下 游引物、中介连接引物，以及通用荧光探针组成，其中： 中介连接引物的一端序列与待C-KIT突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通 用荧光探针部分核酸互补配对。3. 根据权利要求2所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：快速Taq 酶系统的组成为dNTPS(U)、UNG酶、快速Taq酶。4. 根据权利要求2所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与C-KIT突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10bp。5. 根据权利要求4所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与C-KIT突变位点下游的部分序列互补的核酸数量为15~30bp。6. 根据权利要求2所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10bp。7. 根据权利要求6所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量为15~45bp。8. 根据权利要求2~7任意一项所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征 在于：ARMS引物的序列如下：9. 根据权利要求8所述的C-KIT多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：通用荧 光探针的序列为： 5 'GA(dT-FAM)GCTCTGTAGGTGTAGAGCTCAGAGCGAGGITITITITITITITITIT-3 '，对应的淬灭 序列为：5'BHQ-GAGCATC-3'。
【专利摘要】本发明公开了多点突变单管快速检测方法及试剂盒。多点突变单管快速检测方法，包括：1）设计ARMS？引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；2）将ARMS？引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq？酶系统混合，扩增；3）检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。本发明的发明，操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本；克服了现有ARMS？技术的局限性，大大提高了其检测通量；实现了1？管反应取代了之前的多管检测，节省人力物力。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039534
【申请号】CN201510395847
【发明人】陈华云, 刘淑园, 肖湘文, 丁渭, 张天海, 陆同山, 赵丽, 彭俊然, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月8日