Pik3ca基因多点突变单管快速检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种突变检测试剂盒，特别涉及一种PIK3CA多点突变单管快速检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 点突变与许多肿瘤有着密切的关系，已有研究表明，某些基团位点的点突变会使 肿瘤的发生率大幅提高。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K)是催化肌醇基团磷酸化的激酶，由催 化亚基和调节亚基组成的异二聚体；根据其底物结构不同分I、II和III型。PI3K是EGFR 下游信号分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使丝/苏氨酸激酶（AKT)磷 酸化而上调该通路的活性并产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调 控等。
[0003] 目前已发现在多种癌症中（如乳腺癌、非小细胞肺癌等）存在PIK3CA基因突变， PIK3CA基因突变导致PI3K/Akt信号通路持续性活化。PI3K作为EGFR下游信号分子被激 活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测PIK3CA基因突变可以预测肿瘤患 者对EGFR-TKI等药物的耐药性。
[0004] 突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型 DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有 限，不能完全满足临床要求。
[0005] 由于PIK3CA基因药物敏感的突变点较多，市面上的荧光PCR检测试剂盒普遍使用 的是单基因突变检测，分析过程繁琐而且没有必要。同时整个检测流程较慢，浪费大量的时 间和资源。
[0006] 有必要开发出一种更为快速高效的PIK3CA多点突变的检测试剂盒。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种高效的PIK3CA多点突变单管快速检测方法及试剂 盒。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： 1) 设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探 针及其淬灭探针；其中，中介连接引物由通用序列部分和特异序列部分构成，通用序列部分 与通用荧光探针部分序列互补，特异序列部分与点突变下游的部分序列互补； 2) 将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热 启动快速Taq酶系统混合，扩增； 3) 检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。
[0009] 一种PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，快速Taq酶系统 和PIK3CA突变检测引物，其特征在于：所述PIK3CA突变检测引物由多组ARMS引物及对应 的下游引物、中介连接引物，以及通用荧光探针组成；其中：中介连接引物的一端序列与待 PIK3CA突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与通用荧光探针部分核酸互补配对。
[0010] 快速Taq酶系统的组成为dNTPS (U)、UNG酶、快速Taq酶。
[0011] 优选的，上述PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中与 PIK3CA突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10 bp，特别的，互补的核酸数量为 15 ~30bp〇
[0012] 优选的，上述PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的中介连接引物中 与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于10 bp，特别的，互补的核酸数量为 15 ~45bp〇
[0013] 特别的，上述PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的ARMS引物的序列如 下： H1047R ：ATGAAACAAATGAATGATGCACG (SEQ ID NO ：1) H1047L ：CATGAAACAAATGAATGATGCACT (SEQ ID NO ：2) E542K ：TCTACACGAGATCCTCTCTCTA (SEQ ID NO：3) E545D ：AGATCCTCTCTCTGAAATCACTT (SEQ ID NO：4) E545K ：AGATCCTCTCTCTGAAATCACTA (SEQ ID NO：5)〇
[0014] 特别的，上述PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒中使用的通用荧光探针的序 列如下： 通用荧光探针： 5 ' -TG(dT-FAM)CTGATCTACGTAGTTGCAGTCAGTTACGTTATTTTTTTTTTTTTTT-3 ' 通用淬灭探针：5'BHQ-TCAGACA-3'。
[0015] 本发明的有益效果是： 1) 本发明的操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的 引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本； 2) 本发明的检测方法克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量； 3) 本发明的检测方法实现了多管检测反应的简易性，1管反应取代了之前的多管检 测。节省人力物力； 4) 本发明的检测方法中使用快速Taq酶，比普通Taq酶更好。
【附图说明】
[0016] 图1到图6是本发明检测方法的原理图； 图7是等浓度模板在不同Taq酶反应条件下的PCR扩增曲线，说明本试剂盒中使用的 快速Taq酶比普通Taq酶的扩增效果好。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图，进一步说明本发明的检测原理。
[0018] 以PIK3CA突变点H1047R为例子，该点的野生型为A，突变型为G，在PCR过程中， 首先使用1对引物，含1条针对突变点的ARMS引物（引物最后一个碱基为G)和下游引物。 该引物在快速酶的作用下特异性的扩增出突变位点G，野生型位点A不被扩增。如图1所 示； 当特异性扩增发生后，在ARMS引物的引导下，快速Taq酶沿着DNA模板向5' -3'方向 移动并水解中介连接引物的序列介导区域，而中介连接引物的探针互补区域则被释放，如 图2、图3所示； 释放出来的探针互补区域，基于碱基互补配对原则，与通用荧光探针发生互补，在淬灭 基团的存在下，荧光基团的荧光被淬灭，如图4所示； 快速Taq酶通过中介连接引物的探针互补区域，向5' -3'方向移动，水解淬灭基团，从 而淬灭基团远离荧光基团，从而PCR反应产生了荧光，如图5、图6所示。
[0019] 因此，只要多个突变位点的ARMS引物、下游引物和中介连接引物，1组通用荧光探 针与通用淬灭互补探针，可以置于一个PCR反应管中，即可以检测出样本中是否存在点突 变，显著提高了 ARMS法的检测通量。
[0020] 实施例1 PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，主成分如下： 1) DNA提取液： 50mM Na0H、10mMTris-HCl (PH8.0)、l%NP-40、6%Chelex、0.1mM EDTA (PH8.0)组成 2) 快速Taq酶系统： 3U 的快速 Taq，0. 5ul 的 dNTPs (25mM) 3) 引物： PIK3CA ARMS引物及对应的下游引物：
4) 通用荧光探针对如下： 通用荧光探针： 5 ' -TG(dT-FAM)CTGATCTACGTAGTTGCAGTCAGTTACGTTATTTTTTTTTTTTTTT-3 ' 通用淬灭探针：5' BHQ-TCAGACA-3'。
[0021] 使用PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，操作步骤如下： 1)DNA提取： 取2片10μm的FFPE组织切片，刮取下来后放入到1. 5ml离心管中，再加入120 ill的DNA提取液，100°C煮沸10分钟后，将离心管12000rpm离心5分钟，取10 ill的上清加入到 PCR反应管中； 2)快速PCR : 5〇111荧光？0?体系中，31]的快速1&9酶，1〇11111^18-10^5〇11111((^，0.51]的1]吣酶，0. 2mM dNTPS (U)，3mM MgC12。通用荧光探针与通用淬灭互补探针各1 ii m，5个突变位点的 ARMS引物、下游引物和中介连接引物各1ii m。95度5min后，95 °C 5秒，58 °C 31秒，循环数 为40循环； 3)监测反应体系的荧光变化，如存在点突变，则荧光信号会增长。
【主权项】
1. 多点突变单管快速检测方法，包括如下步骤： 设计针对不同点突变的ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用荧光探针， 其中，中介连接引物由与通用荧光探针部分序列互补的通用序列部分和与点突变下游的部 分序列互补的特异部分组成； 将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物和通用荧光探针与快速Taq酶系统混 合，扩增； 检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。2. -种PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，包括DNA提取液，快速Taq酶系统和 PIK3CA突变检测引物，其特征在于：所述PIK3CA突变检测引物由多组ARMS引物及对应的 下游引物、中介连接引物，以及通用荧光探针组成，其中： 中介连接引物的一端序列与待PIK3CA突变位点下游的部分序列互补，另一端序列与 通用荧光探针部分核酸互补配对。3. 根据权利要求2所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：快速 Taq酶系统的组成为dNTPS(U)、UNG酶、快速Taq酶。4. 根据权利要求2所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与PIK3CA突变位点下游的部分序列互补的核酸数量不少于10bp。5. 根据权利要求4所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与PIK3CA突变位点下游的部分序列互补的核酸数量为15~30bp。6. 根据权利要求2所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与通用荧光探针部分核酸互补配对的核酸数量不少于l〇bp。7. 根据权利要求6所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于：中介连 接引物中与通用突光探针部分核酸互补配对的核酸数量为15~45bp。8. 根据权利要求2~7任意一项所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征 在于：ARMS引物的序列如下：〇9. 根据权利要求8所述的PIK3CA多点突变单管快速检测试剂盒，其特征在于： 通用荧光探针： 5-TG(dT-FAM)CTGATCTACGTAGTTGCAGTCAGTTACGTTATTTTTTTTTTTTTTT-3' 通用淬灭探针：5'BHQ-TCAGACA-3'。
【专利摘要】本发明公开了多点突变单管快速检测方法及试剂盒。多点突变单管快速检测方法，包括：1）设计ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针；2）将ARMS引物及对应的下游引物、中介连接引物、通用荧光探针及其淬灭探针与热启动快速Taq酶系统混合，扩增；3）检测反应体系的荧光变化，确定是否存在点突变。本发明的发明，操作简单，可以定性检测出多点突变的存在。本发明的检测方法中使用的引物设计难度低，大幅降低了引物合成的成本；克服了现有ARMS技术的局限性，大大提高了其检测通量；实现了1管反应取代了之前的多管检测，节省人力物力。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039533
【申请号】CN201510395820
【发明人】陈华云, 陈嘉昌, 刘淑园, 肖湘文, 丁渭, 邓利琼, 张天海, 邓金萍
【申请人】广州和实生物技术有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月8日