一种棉花遗传多样性分析ssr分子标记的快速筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，属于棉花分 子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 棉花种质资源是进行遗传育种研究的基础，种质资源的遗传多样性分析是棉花育 种过程中的重要环节。目前，可以利用多种方法评估种质资源的遗传多样性，如形态学方 法、DNA分子标记分析法等。DNA分子标记是一种中性标记，不受环境影响，可以客观的反应 遗传基础的差异。SSR标记是棉花遗传多样性分析最常用的分子标记，具有稳定强，易操作 等优点。但是，目前棉花上可用的SSR分子标记大约在17000条左右，数量很大，而且四倍 体棉花的遗传基础相对狭窄，大部分SSR标记的多态性较差，严重影响了棉花种质资源遗 传多样性分析的效率。如何从数据库中快速筛选出多态性较好的SSR分子标记，是提高种 质资源遗传分析的关键。
[0003] 现有的SSR分子标记筛选的方法是用单一核酸（DNA)模板逐一进行聚合酶链式反 应（PCR)。这种方法效率较低，特别是遇到大量样本和分子标记时，需要耗费大量的时间、人 力和物力。因此，在现有的实验基础上，迫切需要一种新方法来提高SSR标记的筛选效率。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种棉花遗传多样性分析SSR 分子标记的快速筛选方法，大大提高筛选效率。
[0005] 本发明一种棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其技术方案是， 采用DNA混池，所述DNA混池构建自棉花种质资源。即，将待检测棉花DNA混合，构成DNA 混池，以DNA混池为模板，进行PCR反应来筛选SSR分子标记。具体步骤如下：
[0006] (1) DNA模板准备：采用CTAB法提取棉花基因组DNA，稀释到50ng/ul;
[0007] (2) DNA混池构建：假定待检测的棉花种质资源数为10的倍数，将棉花种质资源随 机排列并按顺序编号，每10个DNA模板等量混合为一个池，每个池的第一个样品作为该池 的对照；
[0008] (3)进行 PCR 反应：
[0009] PCR 体系为 20ul，包含 2XEasyTaqPCR Supermix 10ul，DNA 模板 lul，正向引物和 反向引物各lul，DDH20 7ul;
[0010] PCR 程序为 94°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循 环，72°C后延伸lOmin;
[0011] (4) PCR产物在8 %的PAGE胶上电泳分离，采用银染法染色；
[0012] (5)标记多态性鉴定，根据PCR产物在凝胶上的迀移率的不同来判断；选取在混池 及对照间差异大的标记用于进一步的种质资源遗传多样性分析。
[0013] 本发明的有益效果为：
[0014]1、本发明通过多DNA模板混合构建混合池的方法，解决单一 DNA模板逐一进行PCR 反应筛选标记效率低的问题，极大地提高筛选效率。
[0015] 2、本发明在构建DNA混合池的同时，添加不同对照，这样可以有效避免了假阳性， 提尚了标记的筛选准确率。
[0016] 3、降低研究成本及节约时间，以检测56个标记和96个材料的为例，如果按照 现有做法逐个进行PCR，需要做5376 (56X96)个PCR反应，而采用本发明方法，只需要做 3136 (56 X 20+21 X 96)个PCR反应，以此计算实验成本至少可以降低41. 7 %。同时节约了 时间，可以在较短的时间内剔除没有多态性的标记，获得多态性较好的标记。
【附图说明】
[0017] 图1为DNA混池构建示意图；
[0018]图2为基于多态性较差的标记的遗传聚类分析；
[0019]图3为基于多态性较好的标记的遗传聚类分析。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。本发明中所述的CTAB法、PCR方法等如无特殊说明，均为本领域 中所常采用的方法。
[0021]实施例1、SSR标记的筛选
[0022] 1 ?材料
[0023] 56 个棉花基因组 SSR 标记来自于 Cotton Marker Database (http: //www. cottonmarker. org/)，并于上海博尚生物技术有限公司合成。引物名称及序列见表1。
[0024] 96份不同的棉花材料，均为已知材料（见表2)。
[0025] 表1?弓丨物名称及序列
[0026]
[0029]
[0030] 2?方法
[0031] 2.1DNA混池的制作
[0032] 棉花基因组DNA提取采用CTAB法，混池的制作如图1所示，将96份材料打乱顺序， 随机编号1-96。1-10号混为一个DNA池，编号为混合池1，11-20号混为一个DNA池，编号 为混合池2,以此类推，91-96为一个池，编号为混合池10 ;同时每个池选择第一样品作为各 自的对照，即1-10号混池选择1作为对照，编号为对照1，依次类推，91-96号混池选择91 号作为对照，编号为对照10。
[0033] 2. 2 PCR 反应
[0034] PCR反应在ABI9700PCR仪上进行，反应体系为20ul，包括2XEasyTaqPCR Supermix(购于北京全式金生物技术有限公司）10ul，DNA模板lul，正向引物和反向引物各 lul, DDH20 7ul ；
[0035] 反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，35个循 环，72°C延伸 lOmin。
[0036] 2. 3多态性分析
[0037] PCR产物在8 %的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电压120V，2h，采用银染法染色；根 据电泳条带的迀移率进行统计，阳性带为1，阴性带为〇,聚类分析软件为NTSYS2. 0。
[0038] 2. 4多态性标记的选择
[0039] 对于同一个标记而言，10个混合池与10个对照有两两比较，有差异即可认为这个 标记在这96个样品中有多态性，然后将筛选后的标记进一步用于单样品的多态性分析。
[0040] 3?结果与分析
[0041] 经过筛选，在56个SSR标记中，有21个标记在10个混池之间表现出差异（结果 如表3所示），差异标记所占比例为37. 5%。BNL2449等7个标记在10个混合池内都有差 异；BNL1053等6个标记在9个混合池中表现出差异；
[0042] 表3多态性SSR标记在10个DNA混合池中的差异表现
[0043]
[0044] 实施例2、DNA混合池差异的验证
[0045] 为了验证上述DNA混合池法筛选差异标记的可靠性，用56个标记分别对1-96号 样品进行了 PCR检测。结果显示，对于35个在10个混合池间及对照间没有表现出差异的 标记而言，在1-96号单样品的测试中也没有发现差异。对于21个有差异的标记而言，在 1-96号单样品的测试均发现了不同程度的差异，而且通过混合池间及对照间的相互对比， 可有效的排除对照带型对混池带型覆盖造成的假阳性，所谓的假阳性就是对照带型包括混 合池中样品的所有带型，掩盖了混合池中单样品间的差异。
[0046] 实施例3、DNA混合池差异对遗传多样性分析的影响
[0047] 为了验证混合池差异对遗传多样性的影响，分别挑选了在混合池筛选中差异较 大 6 个标记 BNL2449、BNL3031、BNL827、M0N022、NAU2083、NAU797 和差异较小的 6 个标记 M0N0362、M0N0398、M0N0613、N0N0707、M0N296 和 NAU808,将两组标记在 1-50 号样品中的多 态性分别进行了统计，并进行了聚类分析，结果如图3和图2所示。结果显示图3在遗传相 似系数为〇. 68时可以明显的将50份材料分为四类，效果要明显的好于图2,而且与图2相 比，图3更能细化遗传材料的分类，说明在遗传多样性分析中在混合池中差异较大的标记 可以优先使用，能取得更好的研究效果。
[0048] 本发明采用DNA混合池法进行棉花遗传多样性标记的筛选，结果表明该法可有效 提高棉花SSR标记的筛选效率，在本实验检测的56个标记和96个材料的规模下，如果按照 现有的逐个PCR的做法，需要做5376 (56X96)个PCR反应，而采用本发明方法，只需要做 3136(56X20+21X96)个反应，实验成本至少可以降低41. 7%，而且还节约了时间，提高了 效率，可以在相对较短的时间内剔除没有多态性的标记，将多态性较好的标记用于遗传多 样性分析当中。
【主权项】
1. 一种棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其特征是，米用DNA混池， 所述DNA混池构建自棉花种质资源。2. 如权利要求1所述的棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其特征是， 所述DNA混池构建方法是，假定待检测的棉花种质资源数为10的倍数，将棉花种质资源随 机排列并按顺序编号，每10个DNA模板等量混合为一个池，每个池的第一个样品作为该池 的对照。3. 如权利要求2所述的棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其特征是， 筛选步骤如下： (1) DNA模板准备：采用CTAB法提取棉花基因组DNA，稀释到50ng/ul ; (2) DNA混池构建：假定待检测的棉花种质资源数为10的倍数，将棉花种质资源随机排 列并按顺序编号，每10个DNA模板等量混合为一个池，每个池的第一个样品作为该池的对 昭. ， (3) 进行PCR反应： (4) PCR产物在8 %的PAGE胶上电泳分离，采用银染法染色； (5) 标记多态性鉴定，根据PCR产物在凝胶上的迀移率的不同来判断；选取在混池及对 照间差异大的标记用于进一步的种质资源遗传多样性分析。4. 如权利要求3所述的棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其特征是， 所述步骤⑶PCR反应的体系为20ul，包含2 X EasyTaqPCR SupermixlOul，DNA模板Iul，正 向引物和反向引物各lul，DDH2O 7ul。5. 如权利要求3所述的棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，其特征是， 所述步骤（3) PCR反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s， 35个循环，72°C后延伸lOmin。
【专利摘要】本发明提供一种棉花遗传多样性分析SSR分子标记的快速筛选方法，大大提高筛选效率。本发明技术方案是，将待检测棉花DNA混合，构成DNA混池，以DNA混池为模板，进行PCR反应来筛选SSR分子标记。本发明通过多DNA模板混合构建混合池的方法，解决单一DNA模板逐一进行PCR反应筛选标记效率低的问题，极大地提高筛选效率。且添加不同对照，这样可以有效避免了假阳性，提高了标记的筛选准确率。降低研究成本，同时节约了时间，可以在较短的时间内剔除没有多态性的标记，获得多态性较好的标记。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105039525
【申请号】CN201510374011
【发明人】王秀丽, 赵军胜, 姜辉, 陈莹, 高明伟, 王家宝, 张超, 王永翠, 张法铭
【申请人】山东棉花研究中心
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月30日