一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法与流程

本发明涉及伪狂犬病病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法。

背景技术：

目前，伪狂犬病病毒(pseudorabies,PRV)属疱疹病毒科(Herpesvirdae)a-疱疹病毒亚科(Alpherpesvirinae)，是一种以怀孕母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪发热、神经症状、麻痹、衰竭死亡为特征的传染病，其死亡率可达100％。伪狂犬病是危害养猪业最严重的传染病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，该病在我国广泛存在并引发巨大损失。

目前核酸方面的检测方法主要为传统PCR，荧光定量PCR以及核酸杂交技术等。定量或者半定量的PCR方法已经有许多的研究报道，往往也显示出不错的效果。然而，针对伪狂犬病病毒的核酸检测，很大程度上依赖于样品的采集部位。如采集样品刚好在扁桃体，三叉神经节，鼻粘膜等病毒含量高的部位则能使得检测顺利，检出率高。但是，在实际的检测中，不是所有时候都是检测者亲自采样，一些部位如三叉神经节也是很难精准采集的，若检测时使用的是血液等病毒含量少的样品，就有可能会出现漏检。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，该核酸组合包括检测伪狂犬病病毒的引物和探针，利用数字PCR技术检测出样品中低含量的伪狂犬病病毒，避免漏检。

本发明的第二目的在于提供上述检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用，提高检测的灵敏性和特异性，避免漏检。

本发明的第三目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的试剂盒，该试剂包括上述核酸组合，该试剂盒可用于检测低伪狂犬病病毒含量的样品，避免漏检，其具有灵敏性好、特异性强、检测速度快、操作方便等特点。

本发明的第四目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的方法，该检测方法以上述的核酸组合作为检测基础，结合数字PCR技术，可对伪狂犬病病毒含量的样品进行检测，具有灵敏性高、特异性强特点。

本发明的实施例是这样实现的：

一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其包括第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，第一引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示的引物，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。

上述所述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用。

一种检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其包括上述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合。

一种检测伪狂犬病病毒的方法，其包括：

往PCR体系中加入第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针；

将PCR体系形成微滴，并进行微滴数字PCR；

其中，第一引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。

本发明实施例的一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法的有益效果是：本发明的检测伪狂犬病病毒的核酸组合以基于数据PCR平台，根据伪狂犬病病毒的gB基因的保守序列进行设计，该核酸组合包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示的引物的第一引物对和碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示的第一探针，这样，该核酸组合可在数字PCR平台上通过对gB基因的检测，实现对伪狂犬病病毒的检测，在检测的过程中避免漏检，提高检出率，其具有灵敏性高、特异性强的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例4的标准质粒按10倍梯度稀释后检测得到的标准曲线；

图2为本发明实施例4的标准质粒按2倍梯度稀释后检测得到的标准曲线；

图3为本发明实施例5的特异性检测试验结果；

图4为本发明实施例7的实验组和对照组在FAM通道中的荧光信号检测结果；

图5为本发明实施例7的实验组和对照组在HEX通道中的荧光信号检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明的一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法进行具体说明。

微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出(现有的数字PCR仪器基本上都自动相应软件可自动计算出DNA分子数)样本中的DNA分子数。该方法无需内参基因无需制备标准曲线，在微量核酸样品的检测中显示出很好的检测效果。

基于此，发明人通过对伪狂犬病病毒的gB基因的保守序列进行设计出了可用于ddPCR平台的检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其包括：第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，第一引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示的引物，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。

具体地，第一引物对包括上游引物gB-F和下游引物gB-R，上游引物gB-F的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物gB-R的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

通过上述核酸组合，通过gB基因的检测，实现对伪狂犬病病毒的检测，其具有较高的灵敏性和特异性，能够从低伪狂犬病病毒含量样品中检出伪狂犬病病毒，有效地避免传统检测方法出现的漏检现象。

此外，根据大多数商业化伪狂犬病病毒的基因缺失疫苗都具有gE基因缺失，某些多基因缺失疫苗也是在gE基因缺失的基础上再缺失TK或gI基因等情况。本发明人还针对伪狂犬病病毒的gE基因设计出了相应引物和探针。以期在对病原实现准确快速检测的同时也能对所检出的伪狂犬病病毒是野毒株，还是gE缺失的疫苗毒株进行有效区分，使检测结果更可靠准确。

优选地，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的核酸组合还可包括：第二引物对和与第二引物对相对应的第二探针。第二引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.4-5所示，第二探针的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。第二探针的5’端的荧光报告基团为FAM，第二探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。需要说明的是，在这种情况下，第一探针的荧光报告基因的类别均可根据实际情况选择，只要保证其第一探针和第二探针的荧光报告基因的类别不同即可。第一探针和第二探针二者的淬灭基团则可相同，也可以不相同。

其中，第二引物对包括上游引物gE-F和下游引物gE-R。上游引物gE-F的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物gE-R的碱基序列如如SEQ ID NO.5所示。

第二引物对和第二探针对gE基因检测，其与第一引物对和第一探针配合，形成两重ddPCR，在对伪狂犬病病毒的检测同时不仅避免非特异性扩增，又可实现伪狂犬病病毒是野毒株、还是gE缺失的疫苗毒株的区分，也就说检测出gB基因和gE基因都有荧光信号为野毒株，检测出gB基因有荧光信号、gE基因没有荧光信号则gE缺失的疫苗毒株，这样可确保检测结果更准确更可信。

本发明还提供了上述的任意一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用。该检测伪狂犬病病毒的核酸组合其不仅可在ddPCR平台进行应用，还可以通过荧光定量PCR、普通PCR等方式来实现对检测伪狂犬病病毒的检测，只要采用本发明提供的核酸组合用于检测伪狂犬病病毒即属于本发明的保护范围。

本发明提供的检测伪狂犬病病毒的试剂盒包括上述任一种的核酸组合。

该试剂盒可用于在ddPCR平台上检测样品中是否含有伪狂犬病病毒，并同时对检出的病原进行区分，即对所检出的伪狂犬病病毒是野毒株还是gE基因缺失的疫苗毒株，同样具有灵敏性好、特异性强的特点。

优选地，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的试剂盒还可以包括在进行ddPCR时配套的PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一种或多种等成分。

此外，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的方法包括以下步骤：

(1)配制PCR反应体系

往PCR体系中加入上述的第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，以进行PCR，实现对样品中伪狂犬病病毒的高灵敏性检测。其中，PCR体系包括PCR反应混合液和待测样本的DNA模板。PCR反应混合液可通过市面购买，也可自行配制，PCR反应混合液主要包括：PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶等成分。

优选地，在该PCR体系还可加入上述的第二引物对和与第二引物对相对应的第二探针。以进行两重PCR，在实现对样品中伪狂犬病病毒的高灵敏性检测同时，进一步实现对所检出的伪狂犬病病毒的类别进行检测，区分所检出病原是伪狂犬病病毒是野毒株还是gE基因缺失的疫苗毒株，以使结果更加准确可靠。

(2)微滴生成

将PCR体系形成微滴，并进行微滴数字PCR。

优选地，采用微滴生成油对PCR体系进行微滴处理形成微滴，微滴生成油与PCR体系的体积比为6.8～7.2:2。优选地，微滴生成油与PCR体系的体积比为:7:2.。

当然，本发明在其他的实施例中，也可以采用将PCR反应体系分散到ddPCR反应芯片上的方式形成微滴，并不限于采用微滴生成油包裹的方式。

优选地，进行所述微滴数字PCR的的PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，50-60℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

更优选地，进行所述微滴数字PCR的的PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，58.3℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

(3)检测

在数字PCR仪器上检测相应的荧光信号，得到检测结果。

综上，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法具有很高的灵敏性和较强特异性，能够有效地对低病毒含量的样品进行检测，检出率高，同时区分出检出病原的类别，检测结果更准确可靠，克服了现有检测方法的缺陷，为伪狂犬病病毒的检测提供了更多的科学依据和支撑。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其包括第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，以及第二引物对和与第二引物对相对应的第二探针。第一引物对和第一探针根据伪狂犬病病毒的gB基因的保守序列设计，可用于检测出样品是否含有伪狂犬病病毒。第二引物对和第二探针根据伪狂犬病病毒的gE基因的保守序列设计，通过第二引物对和第二探针的加入，可使得在检测样品是否含有伪狂犬病病毒的同时，进一步区分所检测出的伪狂犬病病毒是野毒株(gB阳性、gE阳性)，还是gE缺失的商业化疫苗毒株(gB阳性、gE阴性)。

需要说明的是，在其他的实施例中，在不需要区分所检出的伪狂犬病病毒是野毒株还是gE缺失商业化疫苗毒株的情况下。本发明的检测伪狂犬病病毒的核酸组合可以仅包括第一引物对和第一探针，即可实现对伪狂犬病病毒的检测效果。

具体地，第一引物对的上游引物gB-F为：

5’-TGAAGCGGTTCGTGATGG-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.1所示)，第一引物对的下游引物gB-R为：

5’-CCCCGCACAAGTTCAAGG-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.2所示)。第一探针gB-probe为：

HEX-5’-CGCGTACGTGCTCCCGGACC-3’-BHQ(其碱基序列如SEQ ID NO.3所示)。

具体地，第二引物对的上游引物gE-F为：5’-CTTCCACTCGCAGCTCTTCTC-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.4所示)，第二引物对的下游引物gE-R为：5’-GTRAAGTTCTCGCGCGAGT-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.5所示)。第二探针gE-probe为：FAM-5’-TTCGACCTGATGCCGC-3’-BHQ(其碱基序列如SEQ ID NO.6所示)。

综上，本实施例提供的核酸组合可通过采用两重数字PCR技术，检测出样品中是否含有gB和gE基因成分，提高检出限、防止漏检，实现对伪狂犬病病毒快速检测，同时通过多重PCR，在检测的同时，区分所检病原是野毒株还是gE缺失商业化疫苗毒株。

实施例2

本实施例提供了检测伪狂犬病病毒的试剂盒，该试剂盒包括实施例1提供的核酸组合。该试剂盒可用于在ddPCR平台上检测样品中是否含有伪狂犬病病毒，并同时对检出的病原进行区分，即对所检出的伪狂犬病病毒是野毒株还是gE基因缺失的疫苗毒株，且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，能够避免样品中含有的病毒量少而导致的漏检情况发生。

当然，在其他的实施例中，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的试剂盒还可以包括在进行ddPCR时配套的PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一种或多种等成分。

实施例3

本实施例提供了检测伪狂犬病病毒的方法，具体如下。

1.配制ddPCR反应体系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探针(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，待测样品的DNA模板2μL，DEPC处理水补足至20μL。

gB-F、gB-R、gE-F、gE-R、gB-probe、gE-probe的碱基序列同实施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反应体系方式形成微滴，微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比7:2，微滴的数量为1×10⁴个。在本实施例中，在ddPCR仪器上(QX100微滴式数字PCR仪、美国伯乐公司)用75μL微滴生成油包裹ddPCR反应体系形成微滴。

3.按如下ddPCR反应条件进行反应：95℃预变性10min；95℃变性30s，58.3℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

4.检测，用在FAM通道和VIC通道下分别FAM和VIC荧光信号，FAM通道检测gE基因，HEX通道检测gB基因。根据荧光信号值，检测出待测样品的伪狂犬病病毒。若FAM通道和HEX通道均有荧光信号，则表明待测样品中含有伪狂犬病病毒野毒株；若HEX通道有荧光信号、FAM通道没有荧光信号，则表明待测样品中含有gE缺失的伪狂犬病病毒疫苗。

实施例4

对实施例1提供检测伪狂犬病病毒的核酸组合的灵敏性试验。

标准曲线绘制与灵敏性试验

用梯度稀释的标准质粒作为模板进行扩增，以估计的标准质粒浓度作为横坐标，以ddPCR检测得来的质粒浓度作为纵坐标，绘制标准曲线并以R²评价线性关系。得出在满足线性关系，并且FAM和HEX通道都能检测出阳性结果的前提下，该方法所能检测出的最小浓度，作为上述核酸组合的灵敏性判断指标。具体步骤如下。

1.配制质粒模板：以分别连接有gE基因的标准质粒(pMD19-T-gE)和gB基因的标准质粒(pMD19-T-gB)进行等浓度等体积混合，制备10倍和2倍梯度稀释的质粒模板。其中，10倍梯度稀释的浓度分别为：1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹以及0copies/μL；2倍梯度稀释的浓度分别为：76、38、19、9.5、4.75copies/μL。

2.配制ddPCR反应体系：2×ddPCR master mix 10μL(mix包括PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司)，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探针(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，质粒模板2μL，DEPC处理水补足至10μL。按上述ddPCR反应体系，配制出各梯度稀释浓度的ddPCR反应体系。按上述ddPCR反应体系配制出各梯度浓度的ddPCR反应体系。

3.微滴生成：采用数字PCR仪器(QX100微滴式数字PCR仪、美国伯乐公司)、用75μL的微滴生成油对应25μL的ddPCR反应体系生成10000个微滴，生成微滴后封膜并进行PCR扩增。ddPCR条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，58.3℃退火1min，进行40个循环；98℃10min，4℃保存。

4.检测：反应结束后，用数字PCR仪器(QX100微滴式数字PCR仪、美国伯乐公司)在FAM通道和VIC通道分别检测各梯度浓度的ddPCR反应体系所对应的FAM和VIC荧光信号，FAM通道检测gE基因，HEX通道检测gB基因。根据荧光信号值，数字PCR仪器通过自带软件自动计算出相应的标准质粒拷贝数(即检测所得标准质粒拷贝数)，以各梯度浓度的ddPCR反应体系中预计质粒拷贝数作为横坐标、以各梯度浓度的ddPCR反应体系中检测所得质粒拷贝数作为纵坐标、分别绘制出10倍和2倍梯度稀释的质粒模板的标准曲线，结果如图1～图2和表1所示。

由图1可知(图中)，在10倍稀释浓度下，检测gB基因的标准曲线的R²为0.998，检测gE基因的标准曲线的R²为999；由图2可知，在2倍稀释浓度下，检测gB基因的标准曲线的R²为0.9966，检测gE基因的标准曲线的R²为9968。由此可以看出本发明提供的核酸组合以及检测方法不管在高浓度或低浓度的情况下(1×10⁴～4.75copies/μL)都能保持良好的线性关系。且由表2可知，最小的检测浓度为4.75copies/μL，进一步表明本发明提供的核酸组合、试剂盒以及检测方法的灵敏性较好。

表1.在2倍梯度稀释浓度下检测出的标准质粒浓度

实施例5

对实施例1提供的检测伪狂犬病病毒的核酸组合的特异性试验。

以猪瘟疫苗，蓝耳疫苗，伪狂犬病病毒疫苗Bartha K61，伪狂犬野毒株，乙脑疫苗，是细小疫苗，圆环2型疫苗以及健康猪组织DNA作为受检样品，检测上述核酸组合的特异性。具体步骤如下。

1.提取受检样品的基因组DNA：按病毒DNA/RNA提取试剂盒的操作说明提取上述受检样品的基因组DNA，并将提取的各受检样品的DNA稀释至同一质量浓度100μg/μL，作为进行ddPCR的DNA模板。

2.配制ddPCR反应体系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探针(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，DNA模板2μL，DEPC处理水补足至20μL。按上述ddPCR反应体系，配制出各受检样品的ddPCR反应体系。同时以灭菌超纯水作为模板，配制出空白对照的ddPCR反应体系。

3.微滴生成：上机(QX100微滴式数字PCR仪、美国伯乐公司)、用75μL的微滴生成油对应25μL的ddPCR反应体系生成10000个微滴，生成微滴后封膜并进行PCR扩增。ddPCR条件：95℃预变性10min；95℃变性30s，58.3℃退火1min，进行40个循环；98℃10min，4℃保存。

4.检测：反应结束后，在FAM通道和VIC通道分别检测各受检样品所对应的FAM和VIC荧光信号，结果如图3所示。

由图3可知(图中：A代表FAM通道中的荧光信号检测结果，B代表在HEX通道中的荧光信号检测，A11是空白对照，B11是猪瘟疫苗，C11是蓝耳疫苗，D11是伪狂犬疫苗Bartha K61(gE缺失的伪狂犬病病毒疫苗)，E11是伪狂犬野毒株(伪狂犬病野毒株)，G11乙脑疫苗，H11是细小疫苗，A12是圆环2型疫苗，H12是健康猪组织)，在FAM和HEX检测通道中，空白对照以及猪瘟疫苗，蓝耳疫苗，乙脑疫苗，细小疫苗，圆环2型疫苗以及健康猪组织均没有荧光信号；伪狂犬疫苗Bartha K61(D11)只在FAM通道下有荧光信号，但在VIC通道中没有荧光信号，说明伪狂犬疫苗Bartha K61是缺失gE基因的伪狂犬病病毒疫苗，与实际结果一致；而伪狂犬野毒株(E11)在FAM通道和VIC通道中均检测到荧光信号，说明伪狂犬野毒株是伪狂犬病野毒株，与实际结果一致；由此表明，本发明提供的检测伪狂犬病病毒的的核酸组合、试剂盒以及检测方法的特异性较好，不会导致非特异性扩增，且同时能够有效地区分伪狂犬野毒与gE缺失的疫苗毒株，

实施例6

对实施例3提供的检测伪狂犬病病毒的方法进行重复性检测试验。

配制质粒模板：以分别连接有gE基因的标准质粒(pMD19-T-gE)和gB基因的标准质粒(pMD19-T-gB)进行等浓度等体积混合，梯度稀释出3个梯度浓度，分别为：7.6×10⁴、7.6×10³以及7.6×10²copies/μL，每个梯度浓度按实施例3的检测方法，检测出每个梯度浓度下的质粒拷贝数，结果以平均值表示，比较组内和组间变异系数(CV)，评价重复性，每个梯度浓度重复3次。重复性试验结果如表2所示。

表2.重复性试验结果

注：表中样本编号1、2、3分别表示7.6×10⁴、7.6×10³以及7.6×10²copies/μL

由表2可知，组内变异系数平均值为0.66％，组间变异系数为0.74％，均低于3％，由此表明本发明提供的检测伪狂犬病病毒的方法具有较好的重复性，也进一步表明本发明提供的核酸组合、试剂盒同样具有较好的重复性。

实施例7

对实施例3提供的检测伪狂犬病病毒的方法的退火温度的验证试验。具体如下步骤如下。

1.配制ddPCR反应体系：2×ddPCR master mix 10μL，引物(900nM)各0.9μL(gB-F、gB-R、gE-F、gE-R各0.9μL)，探针(250nM)各0.5μL(gB-probe、gE-probe各0.5μL)，待测样品的DNA模板2μL，DEPC处理水补足至20μL。

gB-F、gB-R、gE-F、gE-R、gB-probe、gE-probe的碱基序列同实施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反应体系方式形成微滴，微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比7:2，微滴的数量为1×104个。在本实施例中，在ddPCR仪器上(QX100微滴式数字PCR仪、美国伯乐公司)用75μL微滴生成油包裹ddPCR反应体系形成微滴。

3.以95℃预变性10min；95℃变性30s，58.3℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应的ddPCR反应条件作为试验组。以退火温度分别为50℃，50.7℃，52℃，53.9℃，56.3℃，59.4℃，60℃作为对比组(共7个对比组)，对比组的其他ddPCR反应条件的设置同试验组。

4.检测，用在FAM通道和VIC通道中分别检测FAM和VIC荧光信号，FAM通道检测gE基因，HEX通道检测gB基因。检测结果如图4和图5所示。

由图4和图5可知(图中：横坐标代表微滴数，纵坐标代表振幅，A12为50℃，B12为50.7℃，C12为52℃，D12为53.9℃，E12为56.3℃，F12为58.3℃，G12为59.4℃，H12为60℃)，在FAM通道中，试验组(F12)的阳性荧光信号和背景信号的差别最大，具有明显的反应效果，表明以58.3℃作为退化温度进行ddPCR，具有较佳的反应结果。

实施例8

在本实施例中，按实施例3提供的检测伪狂犬病病毒的方法对23份组织样品和21份血液样品进行伪狂犬病病毒检测。检测结果如表2所示。

表2.组织样品和血液样品的检测结果

由表2可知，23份组织样品中，gE和gB双基因阳性结果为18份，gE阴性gB阳性结果为1份，双基因阴性为4份，与已知检测结果的一致性为100％。21份血液样品预先用荧光定量PCR检测结果双基因与gB单基因的总阳性率为47.6％，ddPCR检测结果总阳性率为81％，证明本发明采用特异性引物(第一引物对和第二引物对)和探针(第一探针和第二探针)结合ddPCR技术来对伪狂犬病病毒的检测方法的检测结果与实际结果的符合性更高，并且进一步证明本发明提供的检测伪狂犬病病毒的核酸组合、试剂盒以及方法具有很高的灵敏性和较强特异性，能够有效地对低病毒含量的样品进行检测，同时区分出检出病原的类别，为伪狂犬病病毒的检测提供了更多的科学依据和支撑。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。