使用定量PCR和数字PCR进行核酸检测的新颖制剂、方法和系统与流程

背景技术：

核酸扩增方法允许从复杂混合物如生物样品中有选择地扩增和鉴定感兴趣的核酸。为了检测生物样品中的核酸，通常对生物样品进行处理，以从生物样品的其他组分和其他可能干扰核酸和/或扩增的其他物质中分离出核酸。在从生物样品中分离出感兴趣的核酸之后，可通过例如扩增方法，如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(pcr))，对感兴趣的核酸进行扩增。在扩增感兴趣的核酸之后，可以检测扩增产物，并由最终用户解读检测结果。然而，当需要进行多重或多个扩增反应时，所述方法可能是繁琐、冗长而效率低下的。

已有报道将小液滴用作容器进行受限体积内的化学和生化反应(例如，核酸扩增)，并已开发了多种方法来生成此类小液滴。然而，这些技术通常具有小液滴大小不一，组成各异，相对较低的通量，和/或无法生成单分散性小液滴等问题。

技术实现要素：

本领域存在供分析来自复杂样品类型的核酸的快速、准确和高通量的制剂、方法和装置的需求。这种方法和装置可用于，例如，实现迅速的样品-应答检测(sampletoanswerdetection)和应对可通过其核酸检测的疾病。

本发明提供了用于有效地扩增核酸，如rna和dna分子的方法和系统，特别是用于以高通量和/或平行扩增和分析大量不同核酸分子的方法和系统。扩增的核酸产物可迅速地以高敏感度检测出来。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴定来自从受试者获得的生物样品的靶核酸分子的存在与否，或相对量的方法。所述方法可包括：(a)生成乳液，所述乳液包含氟化油、电子液体和基于月桂醚的表面活性剂，其中所述乳液包含多个小液滴，所述小液滴包含(i)来自所述受试者的所述生物样品的多个核酸分子，和(ii)进行脱氧核糖核酸(dna)扩增和任选的逆转录扩增所需的试剂；(b)对所述多个小液滴中的所述多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行所述dna扩增；以及(c)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一些实施方案中，所述dna扩增是聚合酶链反应(pcr)。

在一些实施方案中，所述生物样品从所述受试者直接获得，未经预培养、非选择性富集、选择性富集、铺板于区分培养基、和/或预期性生物医学鉴定。在一些实施方案中，所述生物样品来自所述受试者的组织或流体。

在一些实施方案中，(a)中的所述试剂包含生成所述信号的报告剂。在一些实施方案中，所述信号的强度与所述多个核酸分子的所述扩增产物的量成比例。在一些实施方案中，所述报告剂是染料。在一些实施方案中，所述染料是荧光染料。

在一些实施方案中，所述小液滴包含包封于油相的水相，其中所述水相包含所述多个核酸分子和所述试剂。

在一些实施方案中，所述小液滴在高于95℃的温度下是稳定的，不发生变形或合并。

在一些实施方案中，包含于所述多个小液滴的所述多个核酸分子未经提取和/或纯化。

在一些实施方案中，所述乳液通过将水性的第一流体和非水性的第二流体混合来生成。在一些实施方案中，所述乳液通过将水性的第一流体和非水性的第二流体混合以产生混合物，接着对所述混合物进行涡旋来生成。

在一些实施方案中，所述电子液体是电绝缘液体。在一些实施方案中，所述电子液体是基于氟代烃的液体。在一些实施方案中，所述电子液体包含全氟三戊胺。

在一些实施方案中，所述基于月桂醚的表面活性剂是乙醇酸聚氧乙基月桂醚。在一些实施方案中，所述乳液还包含另一种表面活性剂。在一些实施方案中，所述另一种表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯。

在一些实施方案中，其中(b)包括与所述dna扩增平行进行逆转录扩增。在一些实施方案中，其中(b)包括(i)对所述多个核酸分子进行逆转录扩增以产生互补dna(cdna)分子，和(ii)对所述cdna分子的至少一个子集进行与所述逆转录扩增平行的dna扩增以产生所述扩增产物。

在一些实施方案中，所述方法还包括将关于所述扩增产物的量的信息输出至接收者。在一些实施方案中，其中所述信息作为报告输出。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴定来自从受试者获得的生物样品的靶核酸分子的存在与否，或相对量的系统。所述系统可包括：小液滴生成器，其生成乳液，所述乳液包含氟化油、电子液体和基于月桂醚的表面活性剂，其中所述乳液包含多个小液滴，所述小液滴包含(i)来自所述受试者的所述生物样品的多个核酸分子，和(ii)进行脱氧核糖核酸(dna)扩增和任选的逆转录扩增所需的试剂；控制器，其与所述小液滴生成器可操作地连接，其中所述控制器被编程为(i)对所述多个小液滴中的所述多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行所述dna扩增；以及(ii)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一些实施方案中，所述系统进一步包括检测器，所述检测器用于检测所述信号，其中所述控制器可操作地连接至所述检测器，并操纵所述检测器检测信号。

在一些实施方案中，所述乳液通过将水性的第一流体和非水性的第二流体混合来生成。在一些实施方案中，所述乳液通过将水性的第一流体和非水性的第二流体混合以产生混合物，接着对所述混合物进行涡旋来生成。

在一些实施方案中，所述电子液体是电绝缘液体。在一些实施方案中，所述电子液体是基于氟代烃的液体。在一些实施方案中，所述电子液体包含全氟三戊胺。

在一些实施方案中，所述基于月桂醚的表面活性剂是乙醇酸聚氧乙基月桂醚。在一些实施方案中，所述乳液还包含另一种表面活性剂。在一些实施方案中，所述另一种表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯。

在一些实施方案中，所述控制器被编程为(i)对所述多个小液滴中的所述多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行所述dna扩增，其中与所述dna扩增平行进行逆转录扩增；以及(ii)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一些实施方案中，所述控制器被编程为(i)对所述多个核酸分子进行逆转录扩增以产生互补dna(cdna)分子，和对所述cdna分子的至少一个子集进行与所述逆转录扩增平行的dna扩增以产生所述扩增产物；以及(ii)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一些实施方案中，所述控制器还包括输出模块，所述输出模块用于将关于所述扩增产物的量的信息输出至接收者。在一些实施方案中，所述信息作为报告输出。

根据下面的详细描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见，其中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够包括其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在多个明显的方面进行更改，所有这些都不背离本公开内容。相应地，附图和描述将自然被视为是说明性的，而非限制性的。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指明每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图(在本文中也称作“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1为描绘了示例性系统的示意图。

图2为根据本发明的方法制备的小液滴的照片。

图3为根据本发明的方法检测hbv病毒的照片。

发明详述

虽然在本文中已示出并描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的引用物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，术语“约”在置于数值之前时，除非上下文另有明确说明，指所述数值可上下浮动不超过10％。例如，所述数值可上下浮动不超过10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％等。

如本文所使用的，术语“扩增(amplifying)”和“扩增(amplification)”可互换使用，并且通常指生成核酸的一个或多个拷贝或“扩增产物”。术语“dna扩增”通常指生成dna分子的一个或多个拷贝或“扩增的dna产物”。术语“逆转录扩增”通常指经逆转录酶的作用从核糖核酸(rna)模板生成脱氧核糖核酸(dna)。

如本文所使用的，术语“循环阈值”或“ct”通常指热循环过程中的循环，在该循环中由于扩增产物而导致的可检测信号的增加达到统计学显著的高于背景信号的水平。

如本文所使用的，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用，并且通常指双链核酸的螺旋结构的完全或部分解旋，并且在一些情况下指单链核酸的二级结构的解旋。变性可包括病原体细胞壁或病毒外壳的失活，以及抑制剂蛋白质的失活。可发生变性的条件包括“变性温度”和“变性持续时间”，“变性温度”通常指允许发生变性的温度，“变性持续时间”通常指为发生变性而分配的时间量。

如本文所使用的，术语“孵育”通常指在进行或不进行振荡和搅拌的条件下，使得样品、混合物或溶液维持在某温度持续某段时间。“孵育温度”通常指允许孵育发生的温度。“孵育持续时间”通常指分配给孵育发生的时间的长度。

如本文所使用的，术语“延伸(elongation)”通常指以模板引导的方式将核苷酸掺入核酸。延伸可借助于诸如例如聚合酶或逆转录酶的酶而发生。可发生延伸的条件包括“延伸温度”和“延伸持续时间”，“延伸温度”通常指允许发生延伸的温度，“延伸持续时间”通常指为发生延伸而分配的时间量。

如本文所使用的，术语“核酸”通常指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物的聚合形式。核酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括dna、rna、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析确定的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核酶、cdna、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、分离的任意序列的dna、分离的任意序列的rna、核酸探针和引物。核酸可包含一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在核酸组装之前或之后进行。核酸的核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。核酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与报告剂偶联或结合。

如本文所使用的，术语“引物延伸反应”通常指双链核酸变性，引物与变性的核酸的一条或两条链结合，接着延伸引物。在一些情况下，模板核酸可在未经变性的情况下为单链的(例如，部分单链的)，而引物可结合于所述单链核酸，接着延伸引物。

如本文所使用的，术语“反应混合物”通常指包含对于完成核酸扩增(例如，dna扩增、rna扩增)所必需的试剂的组合物，此等试剂的非限制性实例包括对靶rna或靶dna具有特异性的引物组、由rna的逆转录产生的dna、dna聚合酶、逆转录酶(例如，用于rna的逆转录)、合适的缓冲液(包括两性离子缓冲液)、辅因子(例如，二价和一价阳离子)、dntp和其他酶(例如，尿嘧啶-dna糖基化酶(ung)等)。在一些情况下，反应混合物还可包含一种或多种报告剂。

如本文所使用的，“报告剂”通常指产生可检测信号的组合物，该信号的存在或不存在可用于检测扩增产物是否存在。

如本文所使用的，术语“靶核酸”通常指在核酸分子的起始群体中的、具有某种核苷酸序列的核酸分子，其存在、量和/或序列或者其中一项或多项的变化需要进行测定。靶核酸可以是任何类型的核酸，包括dna、rna和它们的类似物。如本文所使用的，“靶核糖核酸(rna)”通常指作为rna的靶核酸。如本文所使用的，“靶脱氧核糖核酸(dna)”通常指作为dna的靶核酸。

如本文所使用的，术语“受试者”通常指具有可测试或可检测的遗传信息的实体或介质。受试者可以是人或个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括鼠、猿猴、人、家畜、竞技动物(sportanimal)和宠物。受试者的其他实例包括食物、植物、土壤和水。

如本文所使用的，术语“流体”通常指液体或气体。流体无法维持限定的形状，并在可观察的时间范围内会流动，从而填充其所置于的容器中。因此，所述流体可具有任何允许其流动的合适粘度。如果存在两种或更多种流体，每种流体可独立地由本领域技术人员选自基本上任何流体(液体、气体等)。

如本文所使用的，术语“水性流体”通常指用水、由水、或从水制备的流体，或包含水的流体。例如，水性流体可为用水作为溶剂的水溶液。本发明的水性流体可包含用于进行所需的化学反应(例如聚合酶链反应(pcr))的试剂。水性流体的非限定性实例包括但不限于水和其它包含水的水溶液，如细胞或生物介质、乙醇、盐溶液等。

如本文所使用的，术语“非水性流体”通常指用除了水的液体、由除了水的液体、或从除了水的液体制备的流体。非水性流体的非限定性实例包括但不限于油，如烃类、硅油、氟代烃油、有机溶剂等。

如本文所使用的，术语“交叉位置”通常指一个通道穿过另一个通道，或与另一个通道汇合的点或区域。

如本文所使用的，术语“分区”通常指分裂为或分布为的部分或份额。分区的实例包括小液滴和孔。

如本文所使用的，术语“小液滴”通常指第一流体(例如水性流体)的分离的部分，其由第二流体(例如非水性流体)所围绕。乳液可包括第一流体(例如液体)在第二流体中的分散体。所述第一流体在所述第二流体中可能是不可混溶的。在一些实施方案中，所述第一流体和所述第二流体基本上不可混溶。本发明的流体可为球形，或可采用任何形状，如例如具有椭圆截面的形状。对于非球形的小液滴，其直径为与所述非球形小液滴具有相同体积的完美数学球体的直径。本发明的小液滴可为单一乳液、双重乳液、或三重乳液等。

小液滴可包含皮部(skin)。所述皮部可在小液滴加热时形成。所述皮部可相比于小液滴内部具有更高的粘度。在一些情况下，所述皮部可阻止所述小液滴与其他小液滴融合。

如本文所使用的，术语“微流体装置”通常指包含至少一个具有少于约10mm、1mm、0.5mm或0.1mm的横截面尺寸的流体通道的芯片、区域、制品或系统。

如本文所使用的，通道的“横截面尺寸”可相对于所述通道内的流体流动的大致方向垂直地加以测量。

如本文所使用的，术语“通道”通常指装置或基质(例如芯片)上或其内的特征，其至少部分地引导流体流动。通道可具有任何横截面形状(圆形、环状、椭圆形、三角形、不规则形状、方形或矩形等)，并且可为覆盖的或未覆盖的。当通道被完全覆盖时，所述通道的至少一部分可具有完全包封的横截面，或整个通道在其整个长度上被包封，仅其进口或出口或开口例外。本发明的通道可为任何合适的长度。所述通道可为直的，基本上直的，或其可包括一个或多个弯曲或弯折等。例如，所述通道可具有蛇形或螺旋形构造。在一些实施方案中，所述通道包含一个或多个分支，其部分或全部与一个或多个其它通道相连接。当通道在转角或转折点弯曲或弯折时，所述转角或转折点可以具有圆形轮廓，从而使得流体或分区不会被滞留在所述转角或转折点处。

通道亦可具有至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约8:1、至少约10:1、至少约15:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约40:1、至少约50:1、至少约60:1、至少约70:1、至少约80:1、至少约90:1、至少约100:1或更高的长宽比(长度对平均横截面尺寸之比)。开放通道通常会具有便于控制流体转运的特征，例如结构特征(延长的缩进)，和/或物理或化学特征(疏水性对亲水性)，或其他可对流体施加力(例如保持力)的特征。可产生合适的力的力致动器的非限定性实例包括压电致动器、压力阀、施加ac电场的电极等。通道内的流体可部分地或完全地充满所述通道。当使用开放通道时，可例如使用表面张力(即凸出或凹进的新月面)将流体保持在通道中。

如本文所使用的，术语“激发源”通常指能够产生具有多个不同波长或频率的激发信号的装置、设备或器件，例如本发明的实施方式所使用的发光二极管(“led”)。这里，波长可以是离散波长，并且激发信号可以是激发光。在一些实施方案中，激发源可以附加地或可选地包括一个或多个光学单元，用于将激发光引向和/或聚焦在给定检测区域内。

如本文所使用的，术语“光学检测器”通常指适用检测光信号的设备、装置或器件，其例如包括一个或多个光学单元或光传播通路。所述设备、装置或器件通常包括一个或多个透镜、一个或多个棱镜、图像采集或捕获装置、图像传感器。图像采集或捕获装置例如是各类照相机(例如电荷耦合器件(“ccd”)照相机)，其可选地支持调整分辨率、拍摄静态或移动图像、改变焦聚、镜头推近或拉远、改变成像模式、调整景深、改变曝光时间、调整视角或视野等功能。在本发明的一个实施方案中，光学检测器适于检测来自于样品(例如小液滴或生物样品)的经激发源的激发所产生的光信号，例如各种荧光或其他可检测的光，从而利用各类光学检测方法来实现对小液滴或生物样品的检测，这里的光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。

如本文所使用的，术语“致动器”通常指能够驱动一个或多个目标对象沿一个或多个方向移动或旋转的装置、设备或机构。通常致动器通过自身的移动(例如旋转)来驱动目标对象的移动。致动器本身可以由各种形式的能量来驱动，例如电能、光能、磁能、热能、机械能、液压或气压。在具体应用方面，致动器可以是各类的马达或电机。例如，电机可以是自整流或外部整流电机。电机还可以是交流(ac)或直流(dc)电机。电机可以包括直驱式电机、步进式电机、无极电机、或伺服电动机。电机可以被配置成沿单个的方向旋转，或能够向相反的方向旋转。在本发明的一些实施方案中，致动器可以是步进式电机，并且可以至少部分地位于检测单元内，或集成进检测单元内。在本发明的一些实施方案中，致动器可以与一个或多个计算机处理器耦合，从而可以接收来自于计算机处理器的指令，以便使得光学窗口在检测区域中相对移动。

在一个方面，本发明提供了一种用于鉴定来自从受试者获得的生物样品的靶核酸分子的存在与否，或相对量的方法。所述方法可包括：(a)生成乳液，所述乳液包含氟化油、电子液体和基于月桂醚的表面活性剂，其中所述乳液包含多个小液滴，所述小液滴包含(i)来自所述受试者的所述生物样品的多个核酸分子，和(ii)进行脱氧核糖核酸(dna)扩增和任选的逆转录扩增所需的试剂；(b)对所述多个小液滴中的所述多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行所述dna扩增；以及(c)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一个实施方案中，本发明的乳液包含氟化油、电子液体和基于月桂醚的表面活性剂。所述乳液可包含多个小液滴。所述小液滴可包含(i)来自所述受试者的所述生物样品的多个核酸分子，和(ii)进行脱氧核糖核酸(dna)扩增和任选的逆转录扩增所需的试剂。

例如，所述乳液可包含氟化油。本发明可使用任何合适的氟化油。合适的氟化油的非限定性实例包括hfe7100、hfe7500、fc-40、fc-43、fc-70、fc-3208，或其组合。

例如，所述乳液可包含电子液体。本发明可使用任何合适的电子液体。合适的电子液体可为任何适用于电子应用的电子液体。所述电子液体可具有表面活性剂的性质。所述电子液体可为电传导液体，或者，所述电子液体可为电绝缘液体。所述电子液体可为基于氟代烃的液体。例如，所述电子液体可包含全氟三戊胺。或者，所述电子液体可包含其他氟代烃，包括全氟代烃。在一些实施方案中，所述电子液体是fluorinert电子液体。例如，所述电子液体可选自fluorinertfc-87、fc-72、fc-84、fc-77、fc3255、fc-3283、fc-40、fc-43、fc-70、fc-5312。例如，所述电子液体可为fluorinertfc-70。

例如，所述乳液可包含表面活性剂。本发明可使用任何合适的表面活性剂。例如，本发明所述的表面活性剂可为亲水性表面活性剂或亲脂性表面活性剂。

亲水性表面活性剂可以是离子型或非离子型的。合适的离子型表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；夫西地酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐；甘油单酯和甘油二酯的单乙酰化和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的甘油单酯和甘油二酯；甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯；及其混合物。

在前述组内，一些离子型表面活性剂包括，例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐；甘油单酯和甘油二酯的单乙酰化和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的甘油单酯和甘油二酯；甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯；及其混合物。

离子表面活性剂可以是卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、peg-磷脂酰乙醇胺、pvp-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸的乳酸酯、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酰化甘油单酯、甘油单酯/甘油二酯的单/二乙酰化酒石酸酯、甘油单酯/甘油二酯的柠檬酸酯、胆酰肌氨酸、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯、蓖麻醇酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、硬脂酸酯、月桂基硫酸酯、十四烷基硫酸酯(teracecylsulfate)、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱及其盐和混合物的离子化形式。

亲水性非离子型表面活性剂可包括但不限于烷基糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫代葡糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯失水山梨醇脂肪酸酯如聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中至少一个成员的亲水性酯交换反应产物；聚氧乙烯甾醇、其衍生物和类似物；聚氧乙基化维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；及其混合物；聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯以及多元醇与由甘油三酯、植物油和氢化植物油组成的组中至少一个成员的亲水性酯交换反应产物。该多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、季戊四醇或糖。

其他亲水性非离子表面活性剂包括但不限于peg-10月桂酸酯、peg-12月桂酸酯、peg-20月桂酸酯、peg-32月桂酸酯、peg-32二月桂酸酯、peg-12油酸酯、peg-15油酸酯、peg-20油酸酯、peg-20二油酸酯、peg-32油酸酯、peg-200油酸酯、peg-400油酸酯、peg-15硬脂酸酯、peg-32二硬脂酸酯、peg-40硬脂酸酯、peg-100硬脂酸酯、peg-20二月桂酸酯、peg-25甘油三油酸酯、peg-32二油酸酯、peg-20月桂酸甘油酯、peg-30月桂酸甘油酯、peg-20硬脂酸甘油酯、peg-20油酸甘油酯、peg-30油酸甘油酯、peg-30月桂酸甘油酯、peg-40月桂酸甘油酯、peg-40棕榈仁油、peg-50氢化蓖麻油、peg-40蓖麻油、peg-35蓖麻油、peg-60蓖麻油、peg-40氢化蓖麻油peg-60氢化蓖麻油、peg-60玉米油、peg-6癸酸/辛酸甘油酯、peg-8癸酸/辛酸甘油酯、聚甘油-10-月桂酸酯、peg-30胆固醇、peg-25植物甾醇、peg-30大豆甾醇、peg-20三油酸酯、peg-40失水山梨醇油酸酯、peg-80失水山梨醇月桂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、poe-9月桂基醚、poe-20月桂基醚、poe-10油基醚、poe-20油基醚、poe-20硬脂基醚、生育酚peg-100琥珀酸酯、peg-24胆固醇、聚甘油-10-油酸酯、吐温40、吐温60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、peg10-100壬基苯酚系列、peg15-100辛基苯酚系列和泊洛沙姆。

仅举例而言，合适的亲脂性表面活性剂包括：脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；失水山梨醇脂肪酸酯；聚乙二醇失水山梨醇脂肪酸酯；甾醇和甾醇衍生物；聚氧乙基化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；甘油单酯和甘油二酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中至少一个成员的疏水性酯交换反应产物；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在该组内，一些亲脂性表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯及其混合物，或者是多元醇与由植物油、氢化植物油和甘油三酯组成的组中至少一个成员的疏水性酯交换反应产物。

常规使用的表面活化剂还包括例如油酸、卵磷脂、失水山梨醇三油酸酯、氯化十六烷基吡啶、苯扎氯铵、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯、聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物、聚氧丙烯/聚氧乙烯/乙二胺嵌段共聚物、乙氧基化蓖麻油等。其他合适的表面活性剂/乳化剂对于本领域技术人员是已知的，并且在ctfainternationalcosmeticingredientdictionaryandhandbook,vol.2,第7版(1997)中列出。

在一些实施方案中，所述表面活性剂是基于月桂醚的表面活性剂。例如，所述表面活性剂是乙醇酸聚氧乙基月桂醚。

在一些实施方案中，所述乳液还包含另一种表面活性剂。例如，所述另一种表面活性剂是本文中所述的任何另一种表面活性剂。在一个实施方案中，所述另一种表面活性剂是聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)。

在一些实施方案中，所述表面活性剂是氟代表面活性剂。例如，所述表面活性剂可包含疏水性尾基团和亲水性头基团，基于聚合物的尾基团和亲水性头基团，基于聚合物的尾基团和基于聚合物的头基团，氟化的尾基团和是亲水性头基团，或基于氟化聚合物的为集团和基于亲水聚合物的头基团。在一些实施方案中，所述表面活性剂属于双嵌段共聚物或三嵌段共聚物类型。例如，所述表面活性剂可为嵌段共聚物，例如由两个全氟聚醚嵌段和一个聚乙二醇嵌段组成的三嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自下组：pfpe-peg-pfpe(全氟聚醚-聚乙二醇-全氟聚醚)、三嵌段共聚物ea-表面活性剂(raindancetechnologies)和dmp(二吗啉代磷酸)-表面活性剂(baret,kleinschmidt等,2009)。聚合物种类(包括聚合物表面活性剂)中的peg的长度，可为任何合适的长度，并可根据所使用的不同聚合物种类而变化。

在一些实施方案中，包含于所述多个小液滴的所述多个核酸分子未经提取和/或纯化。例如，所述多个核酸分子在包含于所述多个小液滴时尚未纯化。在一些实施方案中，所述多个核酸分子在包含于所述多个小液滴时，所述核酸分子未经提取。例如，所述多个核酸分子可为生物样品的一部分，所述多个核酸分子在包含于所述多个小液滴时，所述多个核酸分子并未从所述生物样品中提取。此外，在一些实施方案中，所述多个核酸分子在包含于所述多个小液滴时，存在于所述多个核酸分子中的靶核酸(例如，靶rna或靶dna)可能未经浓缩或富集。

例如，所述乳液可包含乳化剂。本发明可使用任何合适的乳化剂。所述的合适的乳化剂可以使得本发明所述的乳液稳定。所述乳化剂可具有表面活性剂的性质。所述乳化剂可为水包油乳化剂或油包水乳化剂。乳化剂的非限定性实例包括脂肪酸甘油酯、蔗糖酯、山梨糖醇酯、大豆磷脂、月桂酸甘油酯、丙二醇酯等。在一些实施方案中，所述乳化剂是山梨糖醇酯。在一些实施方案中，所述乳化剂是基于单硬脂酸酯的乳化剂。例如所述基于单硬脂酸酯的乳化剂可为tween系列乳化剂，例如聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯(tween60)。

在生成了本发明的乳液之后，可对乳液中的多个小液滴中的多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行dna扩增。可使用任何合适的dna扩增的方法进行所述dna扩增，包括但不限于本文中记载的dna扩增方法。

在一些实施方案中，所述dna扩增还包括与所述dna扩增平行进行逆转录扩增。可使用任何逆转录扩增的方法进行所述逆转录扩增，包括但不限于本文中记载的逆转录扩增方法。可使用任何方法进行平行的dna扩增和逆转录扩增，包括但不限于本文中记载的平行的dna扩增和逆转录扩增方法。

例如，所述dna扩增包括首先对所述多个核酸分子进行逆转录扩增以产生互补dna(cdna)分子，和与所述逆转录扩增对所述cdna分子的至少一个子集进行平行的dna扩增以产生所述扩增产物。

在一些实施方案中，所述小液滴在高于95℃的温度下是稳定的，不发生变形或合并。所述小液滴可在本文中所述的核酸扩增过程中是稳定的，不发生变形或合并。例如，所述小液滴可在本文中所述的核酸扩增过程中的任何温度下或任何热循环过程中稳定的，不发生变形或合并。

在另一个方面，本发明涉及一种用于鉴定来自从受试者获得的生物样品的靶核酸分子的存在与否，或相对量的系统。所述系统可包括：小液滴生成器，以及控制器，其与所述小液滴生成器可操作地连接。

所述小液滴生成器可为任何合适的小液滴生成器，只要其可根据本发明的方法生成乳液。例如，所述小液滴生成器可生成本发明所述的乳液。例如，所述乳液包含氟化油、电子液体和基于月桂醚的表面活性剂，其中所述乳液包含多个小液滴，所述小液滴包含(i)来自所述受试者的所述生物样品的多个核酸分子，和(ii)进行脱氧核糖核酸(dna)扩增和任选的逆转录扩增所需的试剂。

所述控制器可为任何合适的控制器，包括但不限于本发明所记载的控制器和可实现控制功能的任何装置和仪器。在一些实施方案中所述控制器被编程为执行本发明的方法。例如所述控制器可被编程为(i)对所述多个小液滴中的所述多个核酸分子在足以产生所述多个核酸分子的扩增产物的条件下进行所述dna扩增；以及(ii)检测来自所述多个小液滴中的一个或多个小液滴的信号，其中所述信号指示所述多个核酸分子中的所述靶核酸分子的存在与否或相对量。

在一些实施方案中，所述系统进一步包括检测器，所述检测器用于检测所述信号。所述检测器可以用任何合适的方法检测所述信号，包括但不限于本文中记载的方法。检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测、电化学检测等。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(nmr)波谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在扩增产物的高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。所述检测器可包括实时检测仪器。实时检测仪器的非限制性实例包括各种实时pcr热循环仪、实时pcr系统、序列检测系统、智能循环系统等。

在一些实施方案中，所述控制器可操作地连接至所述检测器，并操纵所述检测器检测信号。

在一个方面，本发明涉及形成分区的方法。所述方法包括引导包含核酸样品的水性流体通过第一通道，和引导非水性流体通过第二通道，使两者流向芯片中的多个交叉位置，从而在所述水性流体和所述非水性流体相接触时在所述多个交叉位置形成多个分区，其中所述多个分区的每个分区包括(i)所述核酸样品或其部分，和(ii)对于核酸扩增必需的试剂。在所述第二通道中，所述非水性流体可基本上不含所述样品和所述试剂。

所述方法可进一步包括(b)在足以产生所述核酸样品或其部分的扩增产物的条件下对所述多个分区中的每个分区中的所述核酸样品或其部分进行核酸扩增反应。在一些实施方案中，(b)可在收集区域中进行。在一些实施方案中，(b)可在芯片上进行。

在一些实施方案中，(b)可遵循任何核酸扩增反应方案进行，例如本说明书中记载的那些。

步骤(b)可包括对所述多个分区中的每一个进行热循环。所述热循环可包括使所述多个分区中的每个分区的温度在第一温度和比第一温度更高的第二温度之间循环。在一些情况下，所述热循环可包括使所述多个分区中的每个分区的温度在多于两个不同温度之间循环。

所述水性流体可包含核酸样品和对于核酸扩增必需的试剂。

在一个方面，本发明涉及形成分区的方法。所述方法包括当包含核酸样品的水性流体与非水性流体相接触时，形成多个分区，其中所述多个分区的每个分区包括(i)所述核酸样品或其部分，和(ii)对于核酸扩增必需的试剂。

所述方法可进一步包括(b)在足以产生所述核酸样品或其部分的扩增产物的条件下对所述多个分区中的每个分区中的所述核酸样品或其部分进行核酸扩增反应。

所述方法可进一步在(b)之后，包括(c)当所述多个分区配置于基本上平面的收集区域之后，在所述多个分区中同时检测指示所述扩增产物存在与否的信号。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述多个分区引导至所述收集区域。

在一些实施方案中，(b)在所述收集区域中进行。

所述收集区域可包含于芯片中。

在一些实施方案中，所述收集区域包括多个区间，且其中在(c)中，在所述多个区间中的给定区间同时检测信号。

所述收集区域的尺寸可设置为在一层内容纳所述多个分区。在一些情况下，所述收集区域的尺寸也可设置为在多层内容纳所述多个分区。

在一些实施方案中，(b)在芯片上进行。

在一个方面，本发明提供了一种形成分区的方法。所述方法包括当包含核酸样品的水性流体与非水性流体相接触时，形成多个分区，其中所述多个分区的每个分区包括(i)所述核酸样品或其部分，和(ii)对于核酸扩增必需的试剂。

所述方法可进一步包括(b)在足以产生所述核酸样品或其部分的扩增产物的条件下对所述多个分区中的每个分区中的所述核酸样品或其部分进行核酸扩增反应。

所述方法可进一步在(b)之后，包括(c)当所述多个分区被孔固定于收集区域之后，在所述多个分区中同时检测指示所述扩增产物存在与否的信号，其中每个孔具有的尺寸(例如长度、宽度、深度)小于所述多个分区中的给定分区的平均直径。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述多个分区引导至所述收集区域。

在一些实施方案中，(b)在所述收集区域中进行。

所述收集区域可包含于芯片中。

在一些实施方案中，所述收集区域包括多个区间，且其中在(c)中，在所述多个区间中的给定区间同时检测信号。

所述收集区域的尺寸可设置为在一层内容纳所述多个分区。在一些情况下，所述收集区域的尺寸也可设置为在多层内容纳所述多个分区。

在一些实施方案中，(b)在芯片上进行。

在一些实施方案中，所述孔的尺寸设置为容纳所述多个分区中的单个分区。

所述非水性流体可包含疏水性液体。疏水性液体的非限定性实例包括油，如烃类、硅油、氟代烃油、氟化油、有机溶剂等。在一些实施方案中，所述油是氟化油，例如hfe7100、hfe7500、fc-40、fc-43、fc-70、fc-3208，或其组合。在一些实施方案中，所述油是矿物油，如液体石蜡、轻矿物油、白油、精炼矿物油、环烷烃油、芳香油，或其组合。所述油可为任何可用于制备小液滴的油。

所述非水性流体可包含表面活性剂。所述表面活性剂可包含疏水性尾基团和亲水性头基团，基于聚合物的尾基团和亲水性头基团，基于聚合物的尾基团和基于聚合物的头基团，氟化的尾基团和是亲水性头基团，或基于氟化聚合物的尾集团和基于亲水聚合物的头基团。在一些实施方案中，所述表面活性剂属于双嵌段共聚物或三嵌段共聚物类型。例如，所述表面活性剂可为嵌段共聚物，例如由两个全氟聚醚嵌段和一个聚乙二醇嵌段组成的三嵌段共聚物。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自下组：pfpe-peg-pfpe(全氟聚醚-聚乙二醇-全氟聚醚)、三嵌段共聚物ea-表面活性剂(raindancetechnologies)和dmp(二吗啉代磷酸)-表面活性剂(baret,kleinschmidt等,2009)。聚合物种类(包括聚合物表面活性剂)中的peg的长度，可为任何合适的长度，并可根据所使用的不同聚合物种类而变化。所述表面活性剂可以以of0.0001％至5％(w/w)，例如0.001％至4％(w/w)，0.01％至3％(w/w)，0.1％至2％(w/w)，0.1％至1％(w/w)的浓度存在于非水性流体中。在一些实施方案中，所述表面活性剂以至少约、至多约、或约about0.1％(w/w)，0.2％(w/w)，0.3％(w/w)，0.4％(w/w)，0.5％(w/w)，0.6％(w/w)，0.7％(w/w)，0.8％(w/w)，0.9％(w/w)，1.0％(w/w)，1.2％(w/w)，1.4％(w/w)，1.6％(w/w)，1.8％(w/w)，2.0％(w/w)，2.5％(w/w)，3.0％(w/w)，3.5％(w/w)，4.0％(w/w)，4.5％(w/w)，5.0％(w/w)，7.0％(w/w)，10.0％(w/w)，15.0％(w/w)，20.0％(w/w)或更多或更少的浓度存在于非水性流体中。

所述第一通道可为任何合适的长度。所述第一通道可以基本上是直的。或者，所述第一通道可包含一个或多个弯曲或弯折等。所述第一通道可具有蛇形或螺旋形设置。所述第一通道可具有一个或多个分支。所述分支的一部分或全部可包含次级通道，使得第一通道的主通道与一个或多个第二通道连接。所述第一通道还可连接至本文所述的流体源。

所述第一通道可具有至少约1mm，至少约2mm，至少约3mm，至少约5mm，至少约7mm，至少约1cm，至少约1.5cm，至少约2cm，至少2.5cm，至少约3cm，至少约5cm，至少约7cm，至少约10cm的长度。所述第一通道可具有不超过约10cm，不超过约7cm，不超过约5cm，不超过约3cm，不超过约2.5cm，不超过约2cm，不超过约1.5cm，不超过约1cm，不超过约7mm，不超过约5mm，不超过约3mm，或不超过约2mm的长度。当提及所述第一通道的长度时，所述长度也包括其所有分支以及次级通道的长度。

所述第一通道的横截面面积可以是基本上恒定的，也可以有所变化。在一些实施方案中，所述第一通道的横截面面积随着流体流在所述第一通道中的位置而有所变化。所述第一通道的横截面面积可为平均至少约1,000μm²，至少约2,000μm²，至少约3,000μm²，至少约5,000μm²，至少约10,000μm²，至少约20,000μm²，至少约30,000μm²，至少约50,000μm²，至少约100,000μm²，至少约200,000μm²，至少约300,000μm²，至少约500,000μm²，至少约1,000,000μm²或更高。所述第一通道的横截面面积可为平均不超过约1,000,000μm²，不超过约500,000μm²，不超过约300,000μm²，不超过约200,000μm²，不超过约100,000μm²，不超过约50,000μm²，不超过约30,000μm²，不超过约20,000μm²，不超过约10,000μm²，不超过约5,000μm²，不超过约3,000μm²，or不超过约2,000μm²。这些横截面面积数值也可自由组合。

所述第一通道的横截面面积可沿着通道的长度方向有所变化。例如所述第一通道的横截面面积可在平均横截面面积约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。所述第一通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、环形、椭圆形、三角形、不规则形状、方形或矩形等。

所述第一通道可具有任何合适的最大横截面尺寸。最大横截面尺寸通常指可容纳于所述第一通道的横截面中的最大尺寸，其中所述横截面指与第一通道内流体流的平均方向正交的面。例如，所述最大横截面尺寸可为不超过1mm，不超过约800μm，不超过约600μm，不超过约500μm，不超过约400μm，不超过约300μm，不超过约250μm，不超过约200μm，不超过约100μm，不超过约75μm，不超过约50μm，不超过约25μm，不超过约10μm等。例如，所述最大横截面尺寸可为至少约5μm，至少约10μm，至少约25μm，至少约50μm，至少约75μm，至少约100μm，至少约200μm，至少约250μm，至少约300μm，至少约400μm，至少约500μm，至少约600μm，至少约800μm等。

所述第一通道可以与一个或多个第二通道流体联通。所述第二通道可为微流体装置。然而，在一些实施方案中，所述第一通道和/或第二通道不是微流体装置。

所述第二通道可以与第一通道相距相对恒定的距离。而且/或者，所述第一通道和第二通道可基本上彼此平行。在一些实施方案中，所述第一通道和第二通道相距两者平均距离的约75％至约125％，例如约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％。

在一些实施方案中，可存在多于一个第二通道。每个第二通道可以与所述第一通道流体联通。如果存在多于一个第二通道，每个第二通道可以与所述第一通道相距相同或不同的距离。此外，多个第二通道可具有相同或不同的长度、横截面面积或其他性质。所述第二通道亦彼此流体联通或彼此不流体联通。

所述第二通道可具有任何合适的形状。所述第二通道可为基本上直的。所述第二通道可具有一个或多个弯曲或弯折。所述第二通道可具有与所述第一通道基本上相同的形状使得例如所述第二通道可以与所述第一通道相距基本上恒定的距离。所述第二通道也可与所述第一通道具有不同的形状。

所述第二通道可具有任何合适的长度。例如，所述第二通道的长度可为至少约1mm，至少约2mm，至少约3mm，至少约5mm，至少约7mm，至少约1cm，至少约1.5cm，至少约2cm，至少2.5cm，至少约3cm，至少约5cm，至少约7cm，至少约10cm等。例如，所述第二通道的长度可为不超过约10cm，不超过约7cm，不超过约5cm，不超过约3cm，不超过约2.5cm，不超过约2cm，不超过约1.5cm，不超过约1cm，不超过约7mm，不超过约5mm，不超过约3mm，或不超过约2mm。所述第二通道的长度可包括其任何分支或次级通道的长度。

所述第二通道的横截面面积可以是基本上恒定的，也可以有所变化。在一些实施方案中，所述第二通道的横截面面积随着流体流在所述第二通道中的位置而有所变化。所述第二通道的横截面面积可为平均至少约1,000μm²，至少约2,000μm²，至少约3,000μm²，至少约5,000μm²，至少约10,000μm²，至少约20,000μm²，至少约30,000μm²，至少约50,000μm²，至少约100,000μm²，至少约200,000μm²，至少约300,000μm²，至少约500,000μm²，至少约1,000,000μm²或更高。所述第二通道的横截面面积可为平均不超过约1,000,000μm²，不超过约500,000μm²，不超过约300,000μm²，不超过约200,000μm²，不超过约100,000μm²，不超过约50,000μm²，不超过约30,000μm²，不超过约20,000μm²，不超过约10,000μm²，不超过约5,000μm²，不超过约3,000μm²，或不超过约2,000μm²。这些横截面面积数值也可自由组合。

在一些实施方案中，所述第二通道的横截面面积可有所变化。例如，所述第二通道的横截面面积可沿着通道的长度方向有所变化。例如所述第二通道的横截面面积可在平均横截面面积约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。所述第二通道的横截面面积可以与所述第一通道的横截面面积相同或不同。此外，所述第二通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、环形、椭圆形、三角形、不规则形状、方形或矩形等。所述第二通道的横截面形状可以与所述第一通道的横截面形状相同或不同。

所述第二通道可具有任何合适的最大横截面尺寸。最大横截面尺寸通常指可容纳于所述第二通道的横截面中的最大尺寸，其中所述横截面指与第二通道内流体流的平均方向正交的面。例如，所述最大横截面尺寸可为不超过1mm，不超过约800μm，不超过约600μm，不超过约500μm，不超过约400μm，不超过约300μm，不超过约250μm，不超过约200μm，不超过约100μm，不超过约75μm，不超过约50μm，不超过约25μm，不超过约10μm等。例如，所述最大横截面尺寸可为至少约5μm，至少约10μm，至少约25μm，至少约50μm，至少约75μm，至少约100μm，至少约200μm，至少约250μm，至少约300μm，至少约400μm，至少约500μm，至少约600μm，至少约800μm等。所述第二通道的最大横截面尺寸可以与所述第一通道的最大横截面尺寸相同或不同。

所述第一通道可包含主通道和多个次级通道。所述次级通道可在多个交叉位置与所述第二通道交叉。流自所述第一通道的主通道的水性流体可穿过一个或多个次级通道，以进入所述第二通道内所含的非水性流体。所述水性流体与所述非水性流体可以使基本上不可混溶的，并因此可形成包含于非水性流体内的水性流体的小液滴。在一些实施方案中，所述次级通道基本上具有相同的形状或尺寸，和/或其横截面面积实质上小于主通道或第二通道的横截面面积，使得对流体流的阻力(resistance)主要由次级通道的尺寸所影响，这可使得形成的小液滴基本上是单分散的。

在一些实施方案中，次级通道对流体流的平均阻力是第一通道和/或第二通道中的阻力的至少约3倍高，例如，至少约5倍高，至少约10倍高，至少约20倍高，至少约30倍高，至少约50倍高，至少约75倍高，至少约100倍高，至少约200倍高，至少约300倍高，至少约500倍高，或至少约1,000倍高。在一些实施方案中，次级通道对流体流的平均阻力不超过第一通道和/或第二通道中的阻力的约1,000倍高或500倍高。所述次级通道可具有基本上相同的平均阻力。例如，所述次级通道对流体流的平均阻力可在所有次级通道对流体流的平均阻力的约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。

在一些实施方案中，使用具有相对较小横截面面积或相对较小的最小或最大横截面尺寸的次级通道来产生对流体流的高阻力。或者，在一些实施方案中，除了控制所述横截面面积或横截面尺寸之外，使用其他技术产生高阻力，例如对所述次级通道进行涂覆和/或构建相对较蜿蜒的次级通道。相应地，所述次级通道可为基本上直的，或所述次级通道可包含一个或多个弯曲或弯折等。如果存在多个次级通道，这些次级通道可各自具有相同或不同的形状。例如，部分或所有的次级通道可以使基本上直的。此外，所述次级通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、环形、椭圆形、三角形、不规则形状、方形或矩形等。所述次级通道可独立地具有相同或不同的横截面形状。所述次级通道的横截面形状可以与所述主通道和/或第二通道的横截面形状相同或不同。

所述次级通道可具有任何合适的最大横截面尺寸。最大横截面尺寸通常指可容纳于所述次级通道的横截面中的最大尺寸，其中所述横截面指与次级通道内流体流的平均方向正交的面。例如，所述最大横截面尺寸可为不超过1mm，不超过约800μm，不超过约600μm，不超过约500μm，不超过约400μm，不超过约300μm，不超过约250μm，不超过约200μm，不超过约100μm，不超过约75μm，不超过约50μm，不超过约25μm，不超过约10μm等。例如，所述最大横截面尺寸可为至少约5μm，至少约10μm，至少约25μm，至少约50μm，至少约75μm，至少约100μm，至少约200μm，至少约250μm，至少约300μm，至少约400μm，至少约500μm，至少约600μm，至少约800μm等。所述次级通道的高度可以与所述第一或第二通道的高度相同或不同。

在一些实施方案中，次级通道内最小的横截面尺寸对最大的横截面尺寸的比例为至少约1:1.1，至少约1:1.5，至少约1:2，至少约1:3，至少约1:5，至少约1:7，至少约1:10，至少约1:15，至少约1:20，至少约1:25，至少约1:30，至少约1:35，至少约1:40，至少约1:50，至少约1:60，至少约1:70，至少约1:80，至少约1:90，至少约1:100等。例如，所述比例为可为不超过约1:100，不超过约1:90，不超过约1:80，不超过约1:70，不超过约1:60，不超过约1:50，不超过约1:40，不超过约1:35，不超过约1:30，不超过约1:25，不超过约1:20，不超过约1:15，不超过约1:10，不超过约1:7，不超过约1:5，不超过约1:3，不超过约1:2，不超过约1:1.5等。

所述次级通道可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，所述次级通道的长度由主通道和第二通道之间的距离决定。例如，所述次级通道的平均长度可为至少约10μm，至少约20μm，至少约30μm，至少约50μm，至少约100μm，至少约200μm，至少约300μm，至少约500μm，至少约1,000μm，或至少约2,000μm等。例如，所述次级通道的长度可为不超过约2,000μm，不超过约1,000μm，不超过约500μm，不超过约300μm，不超过约200μm，不超过约100μm，不超过约50μm，不超过约30μm，不超过约20μm，或不超过约10μm。所述次级通道的长度可为基本上相同的，或所述长度可在所有次级通道的平均长度(或所述第一通道和第二通道之间距离)的约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。

所述次级通道的横截面面积可为平均至少约20μm²，至少约30μm²，至少约50μm²，至少约75μm²，至少约100μm²，至少约300μm²，至少约400μm²，至少约500μm²，至少约750μm²，至少约1,000μm²，至少约1,600μm²，至少约2,000μm²，至少约3,000μm²，至少约4,000μm²，至少约5,000μm²，至少约6,000μm²，至少约6,400μm²，至少约7,000μm²，至少约8,000μm²，至少约9,000μm²，至少约10,000μm²等。所述次级通道的横截面面积可为平均不超过约10,000μm²，不超过约9,000μm²，不超过约8,000μm²，不超过约7,000μm²，不超过约6,400μm²，不超过约6,000μm²，不超过约6,000μm²，不超过约5,000μm²，不超过约4,000μm²，不超过约3,000μm²，不超过约2,000μm²，不超过约1,600μm²，不超过约1,000μm²，不超过约750μm²，不超过约500μm²，不超过约400μm²，不超过约300μm²，不超过约100μm²，不超过约75μm²，不超过约50μm²，不超过约30μm²，不超过约20μm²等。

在一些实施方案中，所述次级通道的横截面面积可在所有次级通道的平均横截面面积的约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。所述次级通道的横截面面积可为基本上恒定的或有所变化。例如，所述次级通道的横截面面积可沿着通道的长度方向有所变化。例如所述次级通道的横截面面积可在平均横截面面积约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。

在一些实施方案中，所述次级通道的体积可在所有次级通道的体积的约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。

在一些实施方案中，所述主通道和/或所述第二通道的横截面面积是所述次级通道的横截面面积中最小的横截面面积的至少约10倍高，例如至少约15倍高，至少约20倍高，至少约30倍高，至少约40倍高，至少约50倍高，至少约75倍高，至少约100倍高，至少约200倍高，至少约300倍高，至少约500倍高，至少约1,000倍高，至少约2,000倍高，至少约3,000倍高，或至少约5,000倍高。在一些实施方案中，所述主通道和/或所述第二通道的横截面面积是所述次级通道的横截面面积中最小的横截面面积的不超过约5,000倍高，不超过约3,000倍高，不超过约2,000倍高，不超过约1,000倍高，不超过约500倍高，不超过约300倍高，不超过约200倍高，不超过约100倍高，不超过约75倍高，不超过约50倍高，不超过约40倍高，不超过约30倍高，或不超过约20倍高。

可存在任何合适数量的次级通道。在一些实施方案中，大量的次级通道可用于以更高速率产生小液滴。此外，如果次级通道对流体流的阻力相对于第一和/或第二通道对流体流的阻力相对较大，则更多数量的次级通道可能不会实质上影响小液滴产生速率和/或小液滴的单分散性。因此，在一些实施方案中，存在相对较高数量的连接主通道和第二通道的次级通道。在一些实施方案中，存在至少5，至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少50，至少75，至少100，至少200，至少300，至少400，至少500，至少600，至少800，至少1,000，至少1,200，至少1,500，至少2,000，至少2,500个连接主通道和第二通道的次级通道。

所述多个次级通道相对于主通道和/或第二通道可以成任何合适的角度。例如，次级通道相对于主通道和/或第二通道可以成约90°的交叉角度。每个次级通道可以以基本上相同的角度与所述主通道和/或第二通道相交，或所述交叉角度可以独立地是相同或不同的。另外，主通道和第二通道之间的交叉角度也可以是相同或不同的。在一些实施方案中，所述次级通道每个均与所述主通道和/或第二通道成约45°至约135°、约45°至约100°、约70°至约100°、约80°至约100°、约85°至约95°、约88°至约92°的角度。在一些实施方案中，次级通道与主通道和/或第二通道成至少约10°，约15°，约20°，约25°，约30°，约35°，约40°，约45°，约50°，约55°，约60°，约65°，约70°，约75°，约80°，约85°，约90°，约95°，约100°，约105°，约110°，约115°，约120°，约125°，约130°，约135°，约140°，约145°，约150°，约155°，约160°，约165°，约170°的角度，或任何这些数值之间的范围的角度(例如约90°至约170°)。

所述次级通道在主通道和第二通道之间可以以任何合适的配置排列。例如，次级通道可以是等距排列的，使得相邻次级通道之间的距离基本上相同，或在所有相邻通道的平均距离的约75％至约125％，约80％至约120％，约90％至约110％，约95％至约105％，约97％至约103％或约99％至约101％的范围内变化。当次级通道的横截面面积是基本上恒定时，次级通道之间的间距可用于确定小液滴的大小。

芯片可包含多组第一通道、第二通道和多个交叉位置。例如，所述芯片可包含2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个第一通道和/或第二通道。每个第一通道可包含主通道和一个或多个次级通道。

交叉位置的数量可为2个或更多，3个或更多，4个或更多，5个或更多，10个或更多，15个或更多，20个或更多，25个或更多，30个或更多，35个或更多，40个或更多，50个或更多，60个或更多，70个或更多，80个或更多，90个或更多，100个或更多个。交叉位置可在第一通道的主通道与第二通道之间，第一通道的次级通道与第二通道之间，和/或第一通道的次级通道与主通道之间形成。多个交叉位置可以线性或非线性排列。例如，多个交叉位置可排列为二维阵列配置。

本发明的分区可为第一流体(例如水性流体)的分离部分，其完全有第二流体(例如非水性流体)所围绕。在一些实施方案中，分区是小液滴。分区(例如小液滴)可为任何形状，且并不必须是球形的。在非球形分区中，其直径为与所述非球形小液滴具有相同体积的完美数学球体的直径。

本发明的多个分区可以在第一流体(例如水性流体)的一部分由第二流体(例如非水性流体)围绕时形成。如本文所使用的，当可围绕第一流体画出闭合圈，且该闭合圈仅通过第二流体时，认为第一流体的一部分被第二流体“围绕”。当可在任何方向上围绕第一流体画出闭合圈，且该闭合圈仅通过第二流体时，认为第一流体的一部分被第二流体“完全围绕”。当可依赖于方向围绕第一流体画出闭合圈，且该闭合圈仅通过第二流体时，认为第一流体的一部分被第二流体“实质上围绕”。

如本文中所述，所述多个分区可在第一通道的主通道、第二通道和/或第一通道的次级通道之间形成的一个或多个交叉位置处形成。所述多个分区可以从它们所形成的多个交叉位置处通过一种或多种力驱离或引离，例如，施加于通道的一个或多个进口和/或出口的力。所述力例如可由泵、重力、毛细作用、表面张力、电渗透、离心力等施加，以将分区从它们所形成的多个交叉位置处驱离和/或引离。还可使用真空(例如通过真空泵或其他合适的真空源)。泵的非限定性实例包括注射泵、蠕动泵、压流泵等。在一些实施方案中，所述多个分区可在由第一通道的主通道和第一通道的多个次级通道之间形成。在一些实施方案中，所述多个通道位于所述第一通道的同一侧。

分区(例如小液滴)的平均尺寸可取决于流体的一种或多种性质(例如流速、粘度)和/或芯片的尺寸、配置或几何形状(例如通道的长度和宽度、相邻通道之间的间距、通道在交叉位置的孔径大小等)。

本发明的芯片可包含通道和多个交叉位置。在一些实施方案中一个或多个通道是微流体通道。在一些实施方案中，至少部分通道不是微流体装置。

所述芯片可包含任何数量的通道，包括微流体通道。所述通道可排列为任何合适的配置。所有的通道可以均相互连接，或可存在多于一个通道的网络。通道可以独立地是直的、弯曲的、弯折的等。在一些实施方案中，芯片内的通道(当加在一起)具有至少约100微米，至少约300微米，至少约500微米，至少约1mm，至少约3mm，至少约5mm，至少约10mm，至少约30mm，至少50mm，至少约100mm，至少约300mm，至少约500mm，至少约1m，至少约2m，或至少约3m的总长度。在一些实施方案中，本发明的芯片具有至少2个通道，至少3个通道，至少4个通道，至少5个通道，至少10个通道，至少20个通道，至少30个通道，至少40个通道，至少50个通道，至少60个通道，至少70个通道，至少80个通道，至少90个通道，至少100个通道等。

在一些实施方案中，所述芯片中的通道的至少一些是微流体通道。例如，所述芯片中的流体中的部分或全部的最大横截面尺寸为小于约2mm，在一些情况下，小于约1mm。在一些情况下，芯片中的所有流体通道是微流体通道。在一些实施方案中，所述芯片中的通道的最大横截面尺寸是小于约500微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约50微米，或小于约25微米。

芯片中的通道可以以任何合适的配置排列。可使用不同的通道排列来操控流体、分区(例如小液滴)和/或通道内的其它要素。例如，装置内的通道可配置为生成分区(例如离散的小液滴、单一乳液、双重乳液、多重乳液等)，将流体和/或分区或其它要素混合，筛选或分选流体和/或分区或其它要素，将流体和/或分区分开，导致反应发生(例如两个流体之间，或第一流体携带的物质和第二流体之间，或两个流体携带的两种物质之间的反应)等等。

可经由一个或多个流体源将流体递送入芯片内的通道。可使用任何合适的流体源，且在一些实施方案中，可使用多于一种流体源。可使用泵、重力、毛细作用、表面张力、电渗透、离心力等将来自流体源的流体递送入芯片中的一个或多个通道。还可使用真空(例如通过真空泵或其他合适的真空源)。泵的非限定性实例包括注射泵、蠕动泵、压流泵等。流体源可为包含相应流体的储库，且所述储库可与芯片中的一个或多个通道流体联通。储库可包含一个或多个出口，而芯片中的通道可包含一个或多个入口。所述出口和入口可彼此流体联通。在一些情况下，可在储库出口和/或通道入口处设置水动阻力器(hydrodynamicresistor)，例如阀、过滤器、筛、蛇形管等来控制流体流。所述水动阻力器可包含总长度为0.1mm，0.5mm，1mm，1.5mm，2mm，2.5mm的蛇形管通道。所述蛇形管通道可折回多次，例如，2，3，4，5，6，7，8次或更多次。

所述芯片可具有与之相联的任何数量的流体源，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个，或更多个流体源。所述流体源无需将流体递送入相同的通道。不同的流体源可将流体递送入不同的通道。例如，可将水性流体递送入第一通道，而将非水性流体递送入第二通道。

本发明还涉及当所述多个分区配置于收集区域之后，在所述多个分区中同时检测指示所述扩增产物存在与否的信号。所述收集区域可在多个交叉位置的下游。在一些实施方案中，在在所述多个分区中的所有分区或部分分区中同时检测指示所述扩增产物存在与否的信号。在一些情况下，所述收集区域包含多个区间，因此可在所述多个区间的给定区件同时检测所述信号。

本发明的方法还包括将所述多个分区引导至所述收集区域。例如可使用第三通道将所述多个分区从多个交叉位置引导至所述收集区域。所述第三通道的直径可大于所述多个分区中的每一个的横截面尺寸。

所述第三通道可以将一个或多个第一通道和/或第二通道与收集区域连接。本文中对第一通道和/或第二通道的描述和限定，除非明显矛盾，否则均适用于所述第三通道。

所述第三通道可以与一个或多个第一通道、第二通道、和/或所述收集区域流体联通。

所述收集区域可包含于所述芯片。或者，所述收集区域可以与所述芯片分开。当收集区域不包含于所述芯片时，其可与所述芯片流体联通。可将在多个交叉位置形成的多个分区通过所述芯片和/或所述收集区域包含的一个或多个通道引导至所述收集区域。

所述收集区域可具有合适的形状和/或配置。例如，所述收集区域可为基本上平面的。在一个实施方案中，所述收集区域具曲面。在一些实施方案中，所述收集区域可为环形的。在一些实施方案中，所述收集区域是倾斜的。所述收集区域可与芯片分离。所述收集区域可为可旋转的。

在一些实施方案中，可在可旋转的支撑结构(例如可旋转的对称圆盘)的一侧包含多个芯片。所述多个芯片中的每个芯片可包含通道(例如第一通道和第二通道)以供生成所述多个分区和收集区域。在一些实施方案中，所述可旋转的支撑结构包含多个收集区域(例如与芯片分开的收集区域)。该支撑结构的旋转可由能够调整旋转速率的马达驱动。所述多个芯片或多个收集区域可相对于所述支撑结构的中心对称放置。在一些实施方案中，所述多个芯片或所述多个收集区域插入或整合入所述旋转支撑结构中。

所述收集区域的尺寸可设置为在单一层内容纳所述多个分区。例如，所述收集区域的尺寸可设置为避免或不具有或几乎不具有所述多个分区的层叠的方式。在一些实施方案中，所述收集区域由两层平行的平面围绕，且所述两层平行的平面限定了收集区域的平均距离。在一些实施方案中，所述收集区域的高度为约或小于约生成的分区的平均直径。例如，所述收集区域的高度可为小于约2000μm，小于约1000μm，小于约750μm，小于约500μm，小于约400μm，小于约300μm，小于约200μm，小于约100μm，小于约90μm，小于约80μm，小于约70μm，小于约60μm，小于约50μm，小于约45μm，小于约40μm，小于约35μm，小于约30μm，小于约25μm，小于约20μm，小于约15μm，小于约10μm，小于约5μm，小于约1μm，小于约0.1μm，小于约0.01μm或更小。所述收集区域(或当施用时，所述收集区域包含的平面)的直径可为至少或约0.01μm，0.1μm，1μm，5μm，10μm，20μm，30μm，40μm，50μm，60μm，70μm，80μm，90μm，100μm，150μm，200μm，250μm，300μm，350μm，400μm，450μm，500μm，550μm，600μm，700μm，800μm，900μm，1mm，2mm，3mm，4mm，5mm，6mm，7mm，8mm，9mm，10mm，或更大。然而，在一些情况下，所述收集区域的尺寸亦可设置为在多个层中容纳所述多个分区。

所述收集区域可包含孔，所述孔的尺寸设定为容纳所述多个分区中的单个分区。每个孔的尺寸(例如宽度、长度、深度)可为少于所述多个分区中的给定分区的平均直径。例如，每个孔的尺寸可小于约500μm，小于约400μm，小于约300μm，小于约200μm，小于约100μm，小于约90μm，小于约80μm，小于约70μm，小于约60μm，小于约50μm，小于约45μm，小于约40μm，小于约35μm，小于约30μm，小于约25μm，小于约20μm，小于约15μm，或小于约10μm，或更小。

孔可容纳整个小液滴，或单个小液滴的一部分。或者，孔可容纳多个小液滴，如至少2，3，4，5或10个小液滴，或更多个。

在一些实施方案中，在收集区域，所述多个分区中的每个区域处于独自可寻址的位置。例如，所述多个分区中的每个分区可对应于限定的结构或空间，这些结构和空间以能够鉴定存在于任何此类限定的结构或空间中的分区的方式被编码、排列或排布。在一些实施方案中，限定的结构或空间可为其尺寸设置为容纳单个分区的孔。

可使用对于所述芯片是外部的热功率源对所述多个分区中的每个分区进行热循环。例如，所述热功率源可为红外功率源。在一些实施方案中，可使用整合在所述芯片内的热功率源对所述多个分区中的每个分区进行热循环。例如，所述热功率源是热电元件(例如peltier元件)或电阻加热元件。或者，所述热功率源可为感应加热元件。

在一些实施方案中，热电元件(例如peltier元件)附接于所述收集区域的一侧(例如下侧)。所述热电元件可与所述收集区域紧密接触，且其面积可大至覆盖至少整个收集区域。

在一些实施方案中，所述收集区域的一侧(例如底侧)可由热吸收材料制备，所述材料可将光能转换为热。例如，所述收集区域与由热吸收材料相对的一侧(例如顶侧)可由能够透射光的材料(例如透明材料)制成。因此，光(例如从位于所述收集区域上方的红外灯发射的光)可穿过该侧，并可用于提高收集区域的温度(例如，改变分区中的温度)。

在一些实施方案中，收集区域中可包含一个或多个温度传感器以监测温度(例如实时监测温度)。所述温度传感器可向控制所述功率源(例如所述ir灯)的控制系统提供反馈信息。从温度传感器接收信息之后，所述控制系统可继而由一个或多个单独或整体被编程为调整所述功率源的计算机处理器所控制。

当多个芯片或控制区域包含于或整合于所述可旋转支撑结构中时，所述功率源(例如一个或多个红外灯)可设置为使得所述多个芯片或收集区域随着所述支撑结构的旋转均匀地暴露于所述功率源(例如光源)，从而确保所述支撑结构上的不同芯片或收集区域被均匀加热。

所述芯片可包含一个或多个入口以及一个或多个出口。每个入口可与一个或多个储库流体联通。储库可填充有流体(水性流体或非水性流体)，所述流体待供应于一个或多个芯片中包含的通道。粗口可位于芯片和/或收集区域中包含通道的一个末端。可驱动一个或多个分区、流体或废物流经出口流至与所述出口流体联通的储库。在一些实施方案中，所述入口和/或出口可包含弹性环例如橡胶环或连接器例如橡胶管以在所述入口/出口和所述储库之间形成密封的连接。在一些情况下，可使用第一通道和/或第二通道与所述出口之间的压力降使得所述水性流体和非水性流体发生流动。所述压力降可为至少约0.1psi，至少约0.5psi，至少约1psi，至少约5psi，至少约10psi，至少约15psi，至少约20psi，至少约30psi，至少约40psi，至少约50psi，至少约60psi，至少约70psi，至少约80psi，至少约90psi，至少约100psi，至少约150psi，至少约200psi，至少约250psi，至少约300psi，至少约350psi，至少约400psi，至少约450psi，至少约500psi，至少约750psi或更大。所述压力降可为至多约750psi，至多约500psi，至多约450psi，至多约400psi，至多约350psi，至多约300psi，至多约250psi，至多约200psi，至多约150psi，至多约100psi，至多约90psi，至多约80psi，至多约70psi，至多约60psi，至多约50psi，至多约40psi，至多约30psi，至多约20psi，至多约15psi，至多约10psi，至多约5psi，至多约1psi，至多约0.5psi，至多约0.1psi或更小。在一些实施方案中，通过控制所述进口、所述第一通道和/或第二通道、和所述出口之间的压力降基本上恒定，产生了多个基本上为单分散的分区。

所述芯片和/或一个或多个所述储库可包含过滤器或富集装置以去除来自核酸样品的不期望的物质，和/或富集所述核酸样品中的期望的成分。过滤器或富集装置的非限定性实例包括过滤膜，例如硝酸纤维素、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚丙烯和聚偏二氟乙烯微孔膜，以及超滤膜(例如，由聚砜、聚偏二氟乙烯、纤维素制备的那些)。在一些实施方案中，驱动流自所述一个或多个储库的水性流体和/或非水性流体通过一个或多个过滤器以进入所述芯片的入口。在一些实施方案中，在单独的储库中收集滤过物。

为了在多个分区中同时检测指示所述扩增产物存在与否的信号，本发明所述的检测可进一步包括引导激发能量至所述多个分区，并检测从所述多个分区发射的信号。所述信号可使用与所述芯片整合的检测器检测。在一些情况下，所述信号可使用所述芯片外部的检测器检测。例如，所述检测器可为电荷耦合器件(ccd)相机。

所述激发能量可由与所述芯片整合的激发能量源提供。在一些情况下，所述激发能量可由所述芯片外部的激发能量源提供。例如，所述激发能量源可由发光二极管或激光提供。所述信号可为光学信号(例如荧光信号)、光化学信号、和/或静电信号。在一些实施方案中，在所述芯片的一侧(例如收集区域上方)提供了光学影像摄取装置(例如ccd相机)和伴随的荧光激发光源。

在本发明所述的检测中，所述多个分区流经所述收集区域的流速可小于约10ml/h，例如小于约9ml/h，小于约8ml/h，小于约7ml/h，小于约6ml/h，小于约5ml/h，小于约4ml/h，小于约3ml/h，小于约2ml/h，小于约1ml/h，小于约0.5ml/h，0.1ml/h，0.01ml/h或更小。在一些实施方案中，在本发明所述的检测中，所述多个分区基本上是静止的。

本发明的方法可进一步包括在进行了所述检测之后(例如，在检测了指示所述扩增产物的存在与否的信号之后)，引导所述多个分区离开所述收集区域，流向出口。所述出口可处于负压下。在一些情况下，所述负压可为小于或约-5巴，-4巴，-3巴，-2巴，-1巴，-0.9巴，-0.8巴，-0.7巴，-0.6巴，-0.5巴，-0.4巴，-0.3巴，-0.2巴，-0.1巴，-0.05巴，-0.04巴，-0.03巴，-0.02巴，-0.01巴，-0.005巴，-0.001巴，-0.0001巴，或更小。所述第一通道和/或第二通道可相对于所述出口处于正压下。在一些情况下，可使用第一通道和/或第二通道与所述出口之间的压力降使得所述水性流体、非水性流体和/或所述分区(例如小液滴)发生流动。所述压力降可为至少约0.1psi，至少约0.5psi，至少约1psi，至少约5psi，至少约10psi，至少约15psi，至少约20psi，至少约30psi，至少约40psi，至少约50psi，至少约60psi，至少约70psi，至少约80psi，至少约90psi，至少约100psi，至少约150psi，至少约200psi，至少约250psi，至少约300psi，至少约350psi，至少约400psi，至少约450psi，至少约500psi，至少约750psi或更大。所述压力降可为至多约750psi，至多约500psi，至多约450psi，至多约400psi，至多约350psi，至多约300psi，至多约250psi，至多约200psi，至多约150psi，至多约100psi，至多约90psi，至多约80psi，至多约70psi，至多约60psi，至多约50psi，至多约40psi，至多约30psi，至多约20psi，至多约15psi，至多约10psi，至多约5psi，至多约1psi，至多约0.5psi，至多约0.1psi或更小。

所述扩增产物可以以至少约90％的敏感度检测出。例如，所述扩增产物可以以至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的敏感度检测出。如本文所使用的，敏感度通常指被正确鉴定为阳性信号占阳性信号比例的量度。

所述扩增产物可以以至少约90％的特异性检测出。例如，所述扩增产物可以以至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或更高的特异性检测出。如本文所使用的，特异性通常指被正确鉴定为阴性信号占阴性信号比例的量度。

所述芯片或其组分(例如，所述通道、所述收集区域等)，可用多种材料和方法制备。例如，所述芯片或其组分可从固体材料形成，其中所述通道可通过微制造、薄膜沉积工艺如旋涂和化学蒸汽沉积、物理蒸汽沉积、激光制造、光刻技术、蚀刻方法(包括湿化学或等离子工艺)、电沉积等形成。多种制造工艺(例如软光刻、热模压、注射模塑、和激光消融)可用于产生芯片及其组分。

在一些实施方案中，所述芯片或其组分由聚合物制备。所述聚合物可为弹性聚合物如聚二甲基硅氧烷("pdms")、聚四氟乙烯("ptfe"或)等。例如，通道(例如微流体通道)可通过使用pdms或其它软光刻技术单独制造所述微流体系统来实现。其它潜在合适的聚合物的实例包括但不限于聚对苯二甲酸乙二酯(pet)、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、环烯共聚物(coc)、聚四氟乙烯、氟代聚合物、硅氧烷(如聚二甲基硅氧烷)、聚偏二氯乙烯、二苯并环丁烯(bcb)、聚酰亚胺、聚酰亚胺的氟代衍生物等。除此之外，还可包括上述聚合物的组合、共聚物或掺混物。

在一些实施方案中，所述芯片或其组分由聚合材料和/或柔性材料和/或弹性材料制备，并可方便地由可硬化的流体制备，以便于同构模塑来制造(例如复制模塑、注射模塑、浇注模塑等)。所述可硬化的流体基本上可为任何可被诱导固体化，或自发固体化为固体的流体，所述固体能够容纳或转运用于流体网络的流体。在一个实施方案中，所述可硬化的流体包含聚合物液体或液体聚合物前体(即前聚合物)。合适的聚合物液体包括，例如热塑性聚合物、热固性聚合物、蜡、金属，或其混合物或复合物，其被加热至熔点以上。在一些实施方案中，合适的聚合物液体包括一种或多种聚合物在合适的溶剂中的溶液，所述溶液在去除溶剂(例如通过蒸发)时形成固体聚合物。此类聚合物材料可从熔融状态或通过溶剂蒸发固体化。存在多种合适的聚合物材料用于形成模塑。此种聚合物材料的非限定性实例包括硅氧烷、环氧聚合物和聚丙烯酸酯。

本发明还涉及扩增核酸的方法。

在一个方面，本发明提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的方法。该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(dna)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)dna聚合酶，和(iii)针对靶rna的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶rna的扩增dna产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶rna。

在另一方面，本发明提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的方法。该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(dna)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶rna的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的扩增dna产物；(d)检测(c)的扩增dna产物的量；及(e)将关于扩增dna产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

在一个方面，本发明提供了一种扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法。该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。所述方法可包括：a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括：(i)在变性温度下孵育所述反应混合物少于或等于60秒的变性持续时间，接着(ii)在延伸温度下孵育所述反应混合物少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。所述扩增产物可为dna产物。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。所述方法可包括：a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和任选地，逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。所述生物样品可包含粪便样品。所述生物样品可包含乳汁样品。所述扩增产物可为dna产物。

在一个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的方法。所述方法可包括：a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和任选地，逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。所述生物样品可包含粪便样品。所述生物样品可包含乳汁样品。所述扩增产物可为dna产物。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述“孵育温度”可为高于约15℃，例如，在高于约20℃，高于约25℃，高于约30℃，高于约35℃，高于约40℃，高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃，高于约60℃，高于约65℃，高于约70℃，高于约75℃，高于约80℃，高于约85℃，高于约90℃，高于约91℃，高于约92℃，高于约93℃，高于约94℃，高于约95℃，高于约96℃，高于约97℃，高于约98℃，高于约99℃，高于约100℃的温度下进行孵育，或者，在约20℃至约90℃的温度下进行孵育，例如，在约25℃至约85℃、约30℃至约80℃、约40℃至约70℃、约40℃至约95℃、约45℃至约90℃、约50℃至约85℃、约55℃至约80℃、约60℃至约75℃、约65℃至约75℃、或约65℃至约70℃的温度下进行孵育。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述“孵育持续时间”可为不多于20分钟。例如，所述“孵育持续时间”可为不多于19分钟，不多于18分钟，不多于17分钟，不多于16分钟，不多于15分钟，不多于14分钟，不多于13分钟，不多于12分钟，不多于11分钟，不多于10分钟，不多于9分钟，不多于8分钟，不多于7分钟，不多于6分钟，不多于5分钟，不多于4分钟，不多于3分钟，不多于2分钟，不多于1分钟，不多于50秒，不多于40秒，不多于30秒，不多于20秒，不多于15秒，或不多于10秒。在一些实施方案中，所述孵育持续时间可为零，即不进行孵育。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述裂解缓冲液可包含nacl、pbs和/或hepes。常用的缓冲液可包括但不限于约0.9％的氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、乳酸化的林格氏溶液、醋酸化的林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲液、碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris缓冲液、组氨酸缓冲液、hepes缓冲液、mopos缓冲液、甘氨酸缓冲液、n-甘氨酰甘氨酸缓冲液等。

在本发明的多个方面中的任意方面，在将所述生物样品与所述裂解缓冲液混合之前，可将所述生物样品在溶液中悬浮，以获得包含所述生物样品的匀质制备物。所述溶液可为悬浮缓冲液。所述悬浮缓冲液可包含nacl、pbs和/或hepes。根据本发明可使用的缓冲液可包括但不限于约0.9％的氯化钠溶液、磷酸盐缓冲液、乳酸化的林格氏溶液、醋酸化的林格氏溶液、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲液、碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、tris缓冲液、组氨酸缓冲液、hepes缓冲液、mopos缓冲液、甘氨酸缓冲液、n-甘氨酰甘氨酸缓冲液等。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述匀质制备物可以在高于约40℃的温度下孵育，例如，可以在高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃，高于约60℃，高于约65℃，高于约70℃，高于约75℃，高于约80℃，高于约85℃，高于约90℃，高于约91℃，高于约92℃，高于约93℃，高于约94℃，高于约95℃，高于约96℃，高于约97℃，高于约98℃，高于约99℃，高于约100℃的温度下进行孵育。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述匀质制备物可以孵育不多于20分钟，例如，不多于19分钟，不多于18分钟，不多于17分钟，不多于16分钟，不多于15分钟，不多于14分钟，不多于13分钟，不多于12分钟，不多于11分钟，不多于10分钟，不多于9分钟，不多于8分钟，不多于7分钟，不多于6分钟，不多于5分钟，不多于4分钟，不多于3分钟，不多于2分钟，不多于1分钟，不多于50秒，不多于40秒，不多于30秒，不多于20秒，不多于15秒，或不多于10秒。

在一些实施方案中，在将所述生物样品与所述裂解缓冲液混合之前，可对所述生物样品进行离心，以获得包含生物样品的上清液和沉淀。在一些实施方案中，在所述生物样品与所述裂解缓冲液混合之前，可对所述生物样品进行离心，以获得上清液和包含生物样品的沉淀。

在一些实施方案中，在将所述生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育之后，可对所述混合物进行离心以获得上清液。所述上清液可包含生物样品。然后，可将所述上清液用作后续反应中的混合物。例如，可将所述上清液添加至包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器中。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，可使所述靶核酸分子经历一个或多个变性条件。所述一个或多个变性条件可选自变性温度分布和变性剂。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，可将所述生物样品在90℃至100℃的预热温度下预热不多于10分钟的预热持续时间。在一些实施方案中，所述预热持续时间不多于1分钟。

在本发明的多个方面中的任意方面，可在未进行dna或rna提取的情况下将所述生物样品与裂解缓冲液的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂。在一些情况下，可在未进行纯化的情况下将所述混合物添加至所述反应容器。在某些情况下，可在未进行dna或rna浓缩或富集的条件下将所述混合物添加至所述反应容器。

在本发明的多个方面中的任意方面，扩增了来自得自受试者的生物样品的核酸。在一些实施方案中，所述生物样品可以直接从来源获得。例如，所述生物样品可以直接从其来源获得，而未经预培养、非选择性富集、选择性富集、铺板于区分培养基、和/或预期性生物医学鉴定。“预培养”通常指在进行本发明的方法之前，对样品中的一种或多种靶物种(例如微生物)进行扩增，或增加其数量的方法。“非选择性富集”通常指非选择性地在混合群体中增加所有或大部分物种(例如微生物)的方法。“选择性富集”通常指在混合群体中增加一种或多种特定物种(例如微生物)的比例和/或量，而抑制其它物种的方法。这种抑制可以是由于培养基成分诸如化合物的选择性毒性，以及生物体利用培养基成分时作为微生物代谢终产物而产生的物质的选择性毒性。“区分培养基”通常指包括一种或多种添加的指示物，使得可以区分在生长过程中发生的特定化学反应的培养基。“预期性生物医学鉴定”通常指基于对诸如菌落特征、在初级分离培养基上生长、革兰氏染色结果等的观察而对微生物作出的初步鉴定。

在一些实施方案中，所述生物样品经培养增菌。例如，在与裂解缓冲液混合之前，可使生物样品在富集培养条件下经历培养持续时间。所述富集培养条件可包括在合适的培养基(例如胰酶大豆培养液(tbs)、改性胰酶大豆培养液、胰蛋白胨、营养培养液、溶菌培养液(lb)、革兰氏阴性培养液、蛋白胨、含酵母的胰酶大豆培养液、或沙门氏菌培养基)中在合适的温度下(例如，约23℃至约40℃，诸如约25℃、约30℃、约35℃、或约37℃等)在振荡或不振荡的条件下培养生物样品。在一些实施方案中，所述培养基是沙门氏菌培养基，其相对于其它细菌，更有利于沙门氏菌增殖。示例性的沙门氏菌培养基包括亚硫酸铋琼脂(bs)、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂(xld)、亚硒酸亮绿磺胺培养液(sbg)等，但不限于此。所述培养持续时间可为约0.5小时至10小时，例如，约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、或约10小时。在一些实施方案中，所述培养持续时间为不超过约7小时，例如，不超过约6.5小时、不超过约6小时、不超过约5.5小时、不超过约5小时、不超过约4.5小时、不超过约4小时、不超过约3.5小时、不超过约3小时、不超过约2.5小时、不超过约2小时、不超过约1.5小时、不超过约1小时、或不超过约0.5小时。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之前和/或之后，可对所述生物样品进行离心，以获得包含生物样品的上清液和沉淀。在一些实施方案中，所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之前和/或之后，可对所述生物样品进行离心，以获得上清液和包含生物样品的沉淀。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之后，可将所述生物样品与裂解缓冲液混合，而不经历选择性富集、铺板于区分培养基、和/或预期性生物医学鉴定。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之后，可将裂解缓冲液添加至所述混合物。所述裂解缓冲液可为碱性的。例如，所述裂解缓冲液可包含naoh。所述裂解缓冲液的ph可为约7至约14，诸如约8至约13，约9至约12，约10至约11。例如，所述裂解缓冲液的ph可为约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、或14。

在所述多个方面中的任意方面，本发明涉及从受试者获得生物样品。在一些情况下，该生物样品直接从受试者获得。直接从受试者获得的生物样品通常指这样的生物样品：其从受试者获得后，除了用于从受试者采集生物样品以供进一步处理的任意手段之外未进行进一步处理。例如，通过以下步骤直接从受试者获得血液：进入受试者的循环系统，从受试者中取出血液(例如，通过针)，并使取出的血液进入贮器中。该贮器可包含试剂(例如，抗凝血剂)，以使得血液样品可用于进一步的分析。在另一实例中，可使用拭子获取受试者的口咽表面上的上皮细胞。在另一实例中，可使用拭子获取受试者的粪便样品。在从受试者获得生物样品后，可使含有生物样品的拭子与流体(例如，缓冲液)接触，以从拭子上收集生物流体。

在一些实施方案中，所述生物样品是粪便样品。在一些实施方案中，所述粪便样品为固体粪便样品。在一些实施方案中，所述粪便样品为液体粪便样品。在一些实施方案中，所述固体状粪便样品可悬浮在适当的缓冲液中，成为悬液粪便样品。在一些实施方案中，所述液体状粪便样品可为水样腹泻物。

在一些实施方案中，所述生物样品通过拭子获得。例如，可用所述拭子刮取固体粪便样品表面，以获得粪便样品。或者，可将所述拭子浸入液体粪便样品或悬液粪便样品，以获得粪便样品。所述拭子可为无菌拭子。所述拭子可为无菌植绒拭子。

也可用其它方法获得粪便样品，例如，可使用移液管、微量进样器、注射器、吸量管、移液器等获得液体粪便样品或悬液粪便样品。例如，可使用小药匙、移液尖、镊子等获得固体粪便样品。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述生物样品的重量可为约50mg至约5g，例如，所述生物样品的重量可为约50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1.0g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g、或5.0g，或可为任意上述数值之间的任何值或范围。

在本发明的多个方面中的任意方面，所述液体生物样品或悬液生物样品的体积可为约50μl至约5ml，例如，所述生物样品的体积可为约50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl、550μl、600μl、650μl、700μl、750μl、800μl、850μl、900μl、950μl、1.0ml、1.1ml、1.2ml、1.3ml、1.4ml、1.5ml、1.6ml、1.7ml、1.8ml、1.9ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、或5.0ml，或可为任意上述数值之间的任何值或范围。

在一些实施方案中，生物样品在提供于反应容器中时尚未纯化。在一些实施方案中，当生物样品提供至反应容器中时，生物样品的核酸尚未提取。例如，当将生物样品提供至反应容器中时，生物样品中的rna或dna可能未从生物样品中提取。此外，在一些实施方案中，在将生物样品提供至反应容器中之前，存在于生物样品中的靶核酸(例如，靶rna或靶dna)可能未经浓缩。

在本发明的多个方面的任一个中，所述生物样品与所述裂解缓冲液的混合物可在未经历dna或核糖核酸(rna)提取的条件下添加至反应容器中。在一些情况下，所述混合物可在未经历纯化的条件下添加至反应容器中。在一些情况下，所述混合物可在未经历dna或rna浓缩的条件下添加至反应容器中。所述反应容器可为包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器。

例如，在如本文中其它部分所述将所述生物样品和所述裂解缓冲液的混合物孵育之后，可将所述混合物未经纯化添加至反应容器。例如，可将所述混合物未经dna或核糖核酸(rna)提取而添加至反应容器。例如，可将所述混合物未经dna或核糖核酸(rna)浓缩而添加至反应容器。所述反应容器可为包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器。

例如，可在将本文中所述的混合物进行离心以产生上清液之后，将所述上清液未经纯化添加至反应容器。例如，可在将本文中所述的混合物进行离心以产生上清液之后，将所述上清液未经dna或核糖核酸(rna)提取而添加至反应容器。例如，可在将本文中所述的混合物进行离心以产生上清液之后，将所述上清液未经dna或核糖核酸(rna)浓缩而添加至反应容器。所述反应容器可为包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器。

可从受试者获得包含核酸的任何合适的生物样品。生物样品可以是固体物质(例如，生物组织)，或者可以是流体(例如，生物流体)。通常，生物流体可包括与活生物体相关的任何流体。生物样品的非限制性实例包括从受试者的任何解剖学位置(例如，组织、循环系统、骨髓)获得的血液(或血液的成分—例如，白细胞、红细胞、血小板)、从受试者的任何解剖学位置获得的细胞、皮肤、心脏、肺、肾脏、呼出气、骨髓、粪便、精液、阴道液、来源于肿瘤组织的组织液、乳腺、胰腺、脑脊液、组织、咽喉拭子、活检物、胎盘液、羊水、肝脏、肌肉、平滑肌、膀胱、胆囊、结肠、肠、脑、腔液、痰、脓、微生物群(microbiota)、胎粪、乳汁、前列腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、泪液、眼部液体、汗液、粘液、耳垢、油、腺体分泌物、脊髓液、毛发、指甲、皮肤细胞、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、脐带血、淋巴液(lymphaticfluid)和/或其他排泄物或身体组织。

在其它情况下，所述生物样品可来自土壤或食物。例如，所述食物样品可为乳制品样品。在一些情况下，所述乳制品样品可包括乳汁。

可通过多种方法从受试者获得生物样品。用于直接从受试者获得生物样品的手段的非限制性实例包括：进入循环系统(例如，经注射器或其他针静脉内或动脉内进入)、收集分泌的生物样品(例如，粪便、尿液、痰、唾液等)、外科手术(例如，活检)、擦拭(例如，口腔拭子、口咽拭子、直肠拭子)、移液和呼吸。此外，可从受试者中期望的生物样品所处的任何解剖部位获得生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品可从其包装物获得，例如，包含食物(例如乳汁)或土壤的包装物。土壤可为矿物质、有机物质、气体、液体以及一些情况下生物体的混合物。

在所述多个方面中的任何方面，对靶核酸进行扩增以生成扩增产物。靶核酸可以是靶rna或靶dna。在靶核酸为靶rna的情况下，靶rna可以是任何类型的rna，包括本文其他地方所述的rna类型。在一些实施方案中，靶rna是病毒rna。在一些实施方案中，病毒rna可能对于受试者是致病性的。致病病毒rna的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒i(hivi)、人免疫缺陷病毒ii(hivii)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，h1n1、h3n2、h7n9或h5n1)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的rna-hcv病毒)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、eb病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、sars病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、肠道病毒(如柯萨奇病毒，例如柯萨奇病毒a16)、和诺如病毒(例如诺如病毒gi或诺如病毒gii)。

在靶核酸为靶dna的情况下，靶dna可以是任何类型的dna，包括本文其他地方所述的dna类型。在一些实施方案中，靶dna是病毒dna。在一些实施方案中，病毒dna可能对于受试者是致病性的。dna病毒的非限制性实例包括单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒、7型腺病毒)和水痘病毒(例如，禽痘)。

在一些情况下，靶dna可以是细菌dna。细菌dna可来自对受试者为致病性的细菌，例如，所述致病性细菌可为革兰氏阳性或革兰氏阴性致病性细菌。例如，所述致病性细菌可选自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、单核细胞增生利斯特菌(listeriamonocytogenes)、大肠杆菌(escherichiacoli)、阪崎肠杆菌(enterobactersakazakii)、副溶血弧菌(vibrioparahemolyticus)、志贺氏菌(shigellaspp.)和结核分枝杆菌——一种已知会引起肺结核的细菌。在一些情况下，靶dna可以是来自致病原生动物(例如，一种或多种可引起疟疾的疟原虫类型的原生动物)的dna。

在本发明的多个方面中的任意方面，当所述生物样品与所述悬浮缓冲液混合以获得匀质制备物时，所述生物样品对所述悬浮缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)至约1:500(wt/vol)，例如，约1:1(wt/vol)至约1:100(wt/vol)。例如，所述生物样品对所述悬浮缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)，约4:1(wt/vol)，约3:1(wt/vol)，约2:1(wt/vol)，约1:1(wt/vol)，约1:2(wt/vol)，约1:3(wt/vol)，约1:4(wt/vol)，约1:5(wt/vol)，约1:6(wt/vol)，约1:7(wt/vol)，约1:8(wt/vol)，约1:9(wt/vol)，约1:10(wt/vol)，约1:20(wt/vol)，约1:30(wt/vol)，约1:40(wt/vol)，约1:50(wt/vol)，约1:60(wt/vol)，约1:70(wt/vol)，约1:80(wt/vol)，约1:90(wt/vol)，约1:100(wt/vol)，约1:110(wt/vol)，约1:120(wt/vol)，约1:130(wt/vol)，约1:140(wt/vol)，约1:150(wt/vol)，约1:160(wt/vol)，约1:170(wt/vol)，约1:180(wt/vol)，约1:190(wt/vol)，约1:200(wt/vol)，约1:250(wt/vol)，约1:300(wt/vol)，约1:350(wt/vol)，约1:400(wt/vol)，约1:450(wt/vol)，或约1:500(wt/vol)。

在本发明的多个方面中的任意方面，当将裂解缓冲液添加至所述匀质制备物时，所述裂解缓冲液对所述匀质制备物的比例可为约50:1(vol/vol)至约1:50(vol/vol)，例如约5:1(vol/vol)至约1:5(vol/vol)。例如，所述裂解缓冲液对所述匀质制备物的比例可为约50:1(vol/vol)，40:1(vol/vol)，30:1(vol/vol)，20:1(vol/vol)，10:1(vol/vol)，9:1(vol/vol)，8:1(vol/vol)，7:1(vol/vol)，6:1(vol/vol)，5:1(vol/vol)，约4:1(vol/vol)，约3:1(vol/vol)，约2:1(vol/vol)，约1:1(vol/vol)，约1:2(vol/vol)，约1:3(vol/vol)，约1:4(vol/vol)，约1:5(vol/vol)，约1:6(vol/vol)，约1:7(vol/vol)，约1:8(vol/vol)，约1:9(vol/vol)，约1:10(vol/vol)，约1:20(vol/vol)，约1:30(vol/vol)，约1:40(vol/vol)，或约1:50(vol/vol)。

在本发明的多个方面中的任何方面，从受试者获得的生物样品或从本文中描述的生物样品衍生的混合物、上清液、悬液或匀质制备物与对于在反应容器中进行核酸扩增所必需的试剂一起提供以获得反应混合物。或者或另外，任何从生物样品获得的混合物、上清液、悬液或匀质制备物可与对于在反应容器中进行核酸扩增所必需的试剂一起提供以获得反应混合物。可使用任何合适的反应容器。在一些实施方案中，反应容器包括主体，该主体可包括内表面、外表面、开口端和相对的封闭端。在一些实施方案中，反应容器可包括盖。所述盖可被配置为在其开口端与主体接触，使得当进行接触时该反应容器的开口端封闭。在一些情况下，所述盖永久地与反应容器相关联，使得其在打开和闭合配置下保持附接至反应容器。在一些情况下，所述盖是可移除的，以便在反应容器打开时，盖与反应容器分离。在一些实施方案中，反应容器可被密封，在一些情况下为气密密封。

反应容器可具有不同的大小、形状、重量和配置。在一些实例中，反应容器可以是圆形或椭圆形的管状。在一些实施方案中，反应容器可以是矩形、正方形、菱形、圆形、椭圆形或三角形。反应容器可以是规则形状或不规则形状。在一些实施方案中，反应容器的封闭端可具有锥形、圆形或平的表面。反应容器类型的非限制性实例包括管、孔、毛细管、筒、皿、离心管或移液管头。反应容器可由任何合适的材料构造，此等材料的非限制性实例包括玻璃、金属、塑料及其组合。

在一些实施方案中，反应容器是反应容器阵列的一部分。反应容器阵列尤其可用于自动化方法和/或同时处理多个样品。例如，反应容器可以是由许多孔组成的微孔板的孔。在另一实例中，反应容器可容纳在热循环仪的热块的孔中，其中热循环块包括各自能够接纳样品容器的多个孔。由反应容器组成的阵列可包括任何适当数目的反应容器。例如，阵列可包括至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、35、48、96、144、384个或更多个反应容器。反应容器阵列的反应容器部分也可以由流体处理装置单独寻址，使得该流体处理装置可正确识别反应容器，并将适当的流体材料分配到反应容器中。流体处理装置可用于将流体材料向反应容器中的添加自动化。

在一些实施方案中，反应容器可包含多个热区。反应容器内的热区可通过使反应容器的不同区域暴露于不同的温度循环条件来实现。例如，反应容器可包括上部热区和下部热区。上部热区能够接收生物样品和对于获得用于核酸扩增的反应混合物所必需的试剂。该反应混合物随后可经历第一热循环方案。在期望数目的循环之后，例如，反应混合物可缓慢地但连续地从上部热区泄漏到下部热区。在下部热区，反应混合物随后经历与上部热区的方案不同的第二热循环方案的期望数目的循环。此等策略在采用巢式pcr扩增dna时可能特别有用。在一些实施方案中，热区可在反应容器内的热敏分层材料的辅助下在反应容器内产生。在此等情况下，可利用热敏分层材料的加热将反应混合物从一个热区释放到下一个热区中。在一些实施方案中，反应容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个热区。

在一些实施方案中，包含热区的反应容器可用于在核酸扩增前处理生物样品。例如，可在加入生物样品和对于核酸扩增所必需的试剂之前将裂解剂加入到反应容器的第一热区。当将生物样品和试剂加入到包含裂解剂的反应容器中时，获得能够裂解该生物样品内的种类(例如，细胞或病毒颗粒)的反应混合物。或者，可将裂解剂与生物样品和试剂同时加入到反应混合物的第一热区中。使第一热区经受适合于裂解剂作用的温度条件可用来在第一热区中裂解生物样品中的细胞和病毒颗粒，使得该生物样品中的核酸释放到反应混合物中。裂解之后，随后可使反应混合物进入反应容器的第二热区，以供使用本文所述的扩增方法对释放的核酸进行扩增。

所述裂解缓冲液可包含任何合适的裂解剂，包括可商购的裂解剂。裂解剂的非限制性实例包括tris-hcl，edta，去污剂(例如，tritonx-100、sds)，溶菌酶，葡萄糖酶(glucolase)，蛋白酶e，病毒内溶素，外溶素(exolysin)，消解酶(zymolose)，溶细胞酶(iyticase)，蛋白酶k，来自噬菌体的内溶素和外溶素，来自噬菌体pm2的内溶素，来自枯草芽孢杆菌(b.subtilis)噬菌体pbsx的内溶素，来自乳杆菌原噬菌体lj928、lj965、噬菌体15phiadh的内溶素，来自肺炎链球菌噬菌体cp-i的内溶素，无乳链球菌噬菌体b30的双功能肽聚糖溶素，来自原噬菌体细菌的内溶素和外溶素，来自李斯特菌(listeria)噬菌体的内溶素，穴蛋白(holin)-内溶素，细胞20裂解基因，holwmy沃氏葡萄球菌(staphylococcuswameri)m噬菌体varphiwmy，沃氏葡萄球菌m噬菌体varphiwmy的iy5wmy，tween20，peg，koh，nacl，及其组合。在一些情况下，缓冲液可包含裂解剂(例如，裂解缓冲液)。裂解缓冲液的一个实例是氢氧化钠(naoh)。在一些实施方案中，所述生物样品未经去污剂处理。例如，所述裂解缓冲液可不含任何去污剂。

所述裂解缓冲液的ph为约7至约14，诸如约8至约13，约9至约12，约10至约11。例如，所述裂解缓冲液的ph可为约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、或14。

在本发明的多个方面中的任意方面，当所述生物样品与所述裂解缓冲液混合以获得混合物时，所述生物样品对所述裂解缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)，例如，约1:1(wt/vol)至约1:10(wt/vol)。例如，所述生物样品对所述悬浮缓冲液的比例可为约5:1(wt/vol)，约4:1(wt/vol)，约3:1(wt/vol)，约2:1(wt/vol)，约1:1(wt/vol)，约1:2(wt/vol)，约1:3(wt/vol)，约1:4(wt/vol)，约1:5(wt/vol)，约1:6(wt/vol)，约1:7(wt/vol)，约1:8(wt/vol)，约1:9(wt/vol)，或约1:10(wt/vol)。

在一些实施方案中，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂。例如，所述试剂可包括进行逆转录扩增和/或脱氧核糖核酸(dna)扩增所需的试剂。

任何类型的核酸扩增反应均可用于扩增靶核酸并生成扩增产物。此外，核酸的扩增可以是线性的、指数式的或其组合。扩增可以是基于乳剂的或可以是非基于乳剂的。核酸扩增方法的非限制性实例包括逆转录、引物延伸、聚合酶链反应、连接酶链反应、解旋酶依赖的扩增、非对称扩增、滚环扩增和多重置换扩增(mda)。在一些实施方案中，扩增产物可以是dna。在对靶rna进行扩增的情况下，可通过rna的逆转录来获得dna并且可利用随后的dna扩增来生成扩增的dna产物。扩增的dna产物可以指示在生物样品中存在靶rna。在对dna进行扩增的情况下，可以使用多种dna扩增方法。dna扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(pcr)、pcr的变型(例如，实时pcr、等位基因特异性pcr、装配pcr、非对称pcr、数字pcr、乳液pcr、拨出pcr(dial-outpcr)、解旋酶依赖的pcr、巢式pcr、热启动pcr、反向pcr、甲基化特异性pcr、微引物pcr(miniprimerpcr)、多重pcr、巢式pcr、重叠-延伸pcr、热非对称交错pcr(thermalasymmetricinterlacedpcr)、递降pcr)以及连接酶链反应(lcr)。在一些情况下，dna扩增是线性的。在一些情况下，dna扩增是指数式的。在一些情况下，dna扩增采用巢式pcr来实现，其可改善检测扩增的dna产物的灵敏度。在一些实施方案中，本文中所述的扩增可指引物延伸反应。

在多个方面，本文所述的这些核酸扩增反应可平行进行。通常，平行的扩增反应是同时在同一反应容器内发生的扩增反应。平行的核酸扩增反应可以如下进行：例如，在反应容器中包括对于各个核酸扩增反应所必需的试剂以获得反应混合物，并且使该反应混合物经受对于各个核酸扩增反应所必需的条件。例如，逆转录扩增和dna扩增可如下平行地进行：在反应容器中提供对于这两种扩增方法所必需的试剂以形成并获得反应混合物，并使该反应混合物经受适于进行这两个扩增反应的条件。由rna的逆转录产生的dna可以平行地进行扩增以产生扩增的dna产物。任何合适数目的核酸扩增反应可以平行地进行。在一些情况下，平行地进行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核酸扩增反应。

平行进行核酸扩增反应的优点可包括耦合的核酸扩增反应之间的快速转换。例如，可在平行核酸扩增的加热阶段从生物样品中提取或释放靶核酸(例如，靶rna、靶dna)。在靶rna的情况下，例如，可加热包含靶rna的生物样品并使靶rna从生物样品中释放。所释放的靶rna可以立即开始逆转录(经由逆转录扩增)以产生互补dna。然后可立即扩增该互补dna，通常在数秒的量级上。靶rna从生物样品中释放与靶rna逆转录为互补dna之间的短时间间隔可有助于使生物样品中可能妨碍逆转录和/或dna扩增的抑制剂的影响最小化。

在这些多个方面中的任何方面，可使用针对靶核酸的引物组来进行核酸扩增反应。例如，所述进行核酸扩增所需的试剂可包括一个或多个引物组。引物组通常包含一种或多种引物。例如，引物组可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种引物。在一些情况下，引物组可包含针对不同的扩增产物或不同的核酸扩增反应的引物。例如，引物组可包含第一引物和与核酸链产物互补的第二引物，第一引物是生成与靶核酸的至少一部分互补的核酸产物的第一链所必需的，第二引物是生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物的第二链所必需的。

例如，引物组可针对靶rna。引物组可包含可用于生成与靶rna的至少一部分互补的核酸产物第一链的第一引物。在逆转录反应的情况下，核酸产物的第一链可以是dna。引物组还可包含可用于生成与核酸产物第一链的至少一部分互补的核酸产物第二链的第二引物。在与dna扩增平行进行的逆转录反应的情况下，核酸产物的第二链可以是与自rna模板产生的dna链互补的核酸(例如，dna)产物的一条链。

如有需要，可以使用任何合适数目的引物组。例如，可以使用约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个引物组。当使用多个引物组时，一个或多个引物组可各自对应于特定的核酸扩增反应或扩增产物。

在多个方面的任何方面中，所述试剂可包含正向引物。所述试剂可包含适于进行核酸扩增的任意量的正向引物。例如，所述试剂可包含约少于0.01μm，0.01μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、多于15.0μmdntp，或任意上述数值之间范围浓度的正向引物，例如，约0.01至10.0μm、0.05至5.0μm、0.05至4.0μm、0.05至3.0μm、0.05至2.0μm、0.05至1.0μm、0.05至0.5μm、0.1至5.0μm、0.1至4.0μm、0.1至3.0μm、0.1至2.0μm、0.1至1.0μm、0.1至0.9μm、0.1至0.8μm、0.1至0.7μm、0.1至0.6μm、0.1至0.5μm正向引物。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至1.0μm正向引物。

在多个方面的任何方面中，所述试剂可包含反向引物。所述试剂可包含适于进行核酸扩增的任意量的反向引物。例如，所述试剂可包含约少于0.01μm，0.01μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、多于15.0μmdntp，或任意上述数值之间范围浓度的反向引物，例如，约0.01至10.0μm、0.05至5.0μm、0.05至4.0μm、0.05至3.0μm、0.05至2.0μm、0.05至1.0μm、0.05至0.5μm、0.1至5.0μm、0.1至4.0μm、0.1至3.0μm、0.1至2.0μm、0.1至1.0μm、0.1至0.9μm、0.1至0.8μm、0.1至0.7μm、0.1至0.6μm、0.1至0.5μm反向引物。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至1.0μm反向引物。

在一些实施方案中，使用dna聚合酶。可以使用任何合适的dna聚合酶，包括可商购的dna聚合酶。dna聚合酶通常指能够以模板结合的方式将核苷酸掺入到dna链中的酶。dna聚合酶的非限制性实例包括taq聚合酶、tth聚合酶、tli聚合酶、pfu聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、ex-taq聚合酶、la-taq聚合酶、expand聚合酶、sso聚合酶、poc聚合酶、pab聚合酶、mth聚合酶、pho聚合酶、es4聚合酶、tru聚合酶、tac聚合酶、tne聚合酶、tma聚合酶、tih聚合酶、tfi聚合酶、platinumtaq聚合酶、hi-fi聚合酶、tbr聚合酶、tfl聚合酶、pfutubo聚合酶、pyrobest聚合酶、pwo聚合酶、kod聚合酶、bst聚合酶、sac聚合酶、klenow片段，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。对于某种热启动聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分钟至10分钟的变性步骤，这根据不同的聚合酶可能会改变热分布。

在一些实施方案中，所述进行核酸扩增所需的试剂可包括逆转录酶。在一些实施方案中，在本发明中所述的试剂可包含逆转录酶。例如，可使用任何合适的逆转录酶。逆转录酶通常指在与rna模板结合时能够将核苷酸掺入到dna链中的酶。逆转录酶的非限制性实例包括hiv-1逆转录酶、m-mlv逆转录酶、amv逆转录酶、端粒酶逆转录酶，以及它们的变体、修饰的产物和衍生物。许多本文中所述的或者本领域已知的dna和rna聚合酶能够在模板引导的引物延伸反应中利用核苷酸类似物。本领域已知广泛种类的核苷酸类似物。核苷酸类似物的非限定实例包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸类似物。通常，所述类似物包括腺苷、胸苷、尿苷、胞苷、尿苷及这些碱基的类似物。所述类似物可包括核苷三磷酸，或其还可包括额外的磷酸基团，例如四磷酸、五磷酸、六磷酸、七磷酸或更多。这些类似物中一些的示例描述于，例如公开的美国专利申请2003-0124576和2007-0072196，以及美国专利号7,223,541和7,052,839，其全文均就所有目的通过援引并入本文。

在多个方面，使用引物延伸反应来生成扩增产物。引物延伸反应通常包括以下的循环：将反应混合物在变性温度下孵育一段变性持续时间，以及将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸持续时间。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，可使所述靶核酸分子经历一个或多个变性条件。所述一个或多个变性条件可选自变性温度分布和变性剂。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，将所述生物样品在约90℃至约100℃的预加热温度下预加热不超过约10分钟的预加热持续时间。在一些实施方案中，所述预加热持续时间不超过1分钟。

变性温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性温度可为约80℃至约110℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约100℃。在一些实例中，变性温度可为约90℃至约97℃。在一些实例中，变性温度可为约92℃至约95℃。在另外其他的实例中，变性温度可为约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

变性持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，变性持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，变性持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸温度可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸温度可为约30℃至约80℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约72℃。在一些实例中，延伸温度可为约45℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约35℃至约65℃。在一些实例中，延伸温度可为约40℃至约60℃。在一些实例中，延伸温度可为约50℃至约60℃。在另外其他的实例中，延伸温度可为约35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

延伸持续时间可根据例如所分析的特定生物样品、生物样品中靶核酸的特定来源(例如，病毒颗粒、细菌)、所使用的试剂和/或所期望的反应条件而变化。例如，延伸持续时间可以少于或等于300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，延伸持续时间可以不超过120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

在所述多个方面中的任何方面，可进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。进行的循环数可取决于，例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的扩增dna产物)所必需的循环数(例如，循环阈值(ct))。例如，获得可检测的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的dna产物)所必需的循环数可以少于约或为约100个循环、75个循环、70个循环、65个循环、60个循环、55个循环、50个循环、40个循环、35个循环、30个循环、25个循环、20个循环、15个循环、10个循环或5个循环。此外，在一些实施方案中，可检测量的扩增产物(例如，指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的dna产物)可以以小于100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的循环阈值(ct)获得。

扩增产生指示存在所扩增的靶核酸的可检测量的扩增产物所需的时间可根据从中获得靶核酸的生物样品、将要进行的特定核酸扩增反应和所期望的扩增反应的特定循环数而变化。例如，靶核酸的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物。

在一些实施方案中，靶rna的扩增可在120分钟或更短、90分钟或更短、60分钟或更短、50分钟或更短、45分钟或更短、40分钟或更短、35分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、或者5分钟或更短的时段产生指示存在靶rna的可检测量的扩增dna产物。

在一些实施方案中，可使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括多个循环的特定引物延伸反应，该反应的特征在于，例如，如本文其他地方所述的特定的变性和延伸条件。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。例如，就斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个、四个或全部五个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。

例如，多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。

在多个系列的引物延伸反应中的每个系列中，可进行任何适当数目的循环。例如，在多个系列的引物延伸反应中的每个系列中进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。

进行多个系列的引物延伸反应的优点可能在于，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，多个系列的方法以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。与在相若的变性和延伸条件下的单一系列相比，使用多个系列的引物延伸反应可将此等循环阈值减少至少约或大约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方案中，斜变时间(即，热循环仪从一个温度转变至另一温度所花的时间)和/或斜变速率是扩增中的重要因素。例如，扩增产生指示存在靶核酸的可检测量的扩增产物所需的温度和时间可根据斜变速率和/或斜变时间而变化。斜变速率可影响用于扩增的温度和时间。

在一些情况下，斜变时间和/或斜变速率在循环之间可以是不同的。然而在一些情况下，循环之间的斜变时间和/或斜变速率可以是相同的。斜变时间和/或斜变速率可基于正在处理的样品进行调整。

在一些情况下，例如可以根据样品的性质和反应条件来确定不同温度之间的斜变时间。也可根据样品的性质和反应条件来确定精确的温度和孵育时间。在一些实施方案中，可使用多个热循环将单个样品处理(例如，使之经受扩增条件)多次，各个热循环在例如斜变时间、温度和/或孵育时间上不同。随后可为该特定样品选择最好或最佳的热循环。这提供了针对被测试的特定样品或样品组合裁量热循环的稳健而高效的方法。

在一些实施方案中，靶核酸可在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，靶核酸可在执行所述多个系列之前经受变性条件，或者可在所述多个系列之间经受变性条件。例如，靶核酸可在多个系列中的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此等变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。

进行多个系列的引物延伸反应的优点可能在于，与在相若的变性和延伸条件下的单一系列的引物延伸反应相比，多个系列的方法以较低的循环阈值产生指示在生物样品中存在靶核酸的可检测量的扩增产物。与在相若的变性和延伸条件下的单一系列相比，使用多个系列的引物延伸反应可将此等循环阈值减少至少约或大约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一些实施方案中，可在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预热温度)和持续时间(例如，预热持续时间)可根据例如所分析的特定生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其他的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。

在一些实施方案中，所述进行核酸扩增所需的试剂(包括对于进行平行核酸扩增所需的试剂)还可包括报告剂。所述报告剂可产生可检测信号。所述可检测信号可指示扩增产物是否存在。例如，可检测信号的存在或不存在可指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。例如，在通过平行地逆转录和扩增从逆转录获得的dna来扩增靶rna的情况下，对于这两个反应所必需的试剂还可包括可产生可检测信号的报告剂，该可检测信号指示扩增的dna产物和/或扩增的靶rna的存在。可检测信号的强度可与扩增的dna产物和/或扩增的原始靶rna的量成比例。报告剂的使用还使得实时扩增方法成为可能，包括用于dna扩增的实时pcr。

报告剂可通过共价或非共价相互作用与包括扩增产物在内的核酸相连接。非共价相互作用的非限制性实例包括离子相互作用、范德华力、疏水相互作用、氢键键合及其组合。在一些实施方案中，报告剂可与初始反应物结合，并且报告剂水平的变化可用于检测扩增产物。在一些实施方案中，报告剂可以仅在核酸扩增进行时是可检测的(或不可检测的)。在一些实施方案中，光学活性染料(例如，荧光染料)可用作报告剂。染料的非限制性实例包括sybr绿，sybr蓝，dapi，碘化丙啶(propidiumiodine)，hoeste，sybr金，溴化乙锭，吖啶，原黄素、吖啶橙，吖啶黄，荧光香豆素(fluorcoumanin)，玫瑰树碱，道诺霉素，氯喹，偏端霉素d，色霉素，胡米溴铵(homidium)，光辉霉素，多吡啶钌(rutheniumpolypyridyl)，安曲霉素(anthramycin)，菲啶和吖啶，溴化乙锭，碘化丙啶，碘化己啶(hexidiumiodide)，二氢乙锭，乙锭同型二聚体-1和乙锭同型二聚体-2，单叠氮化乙锭(ethidiummonoazide)和acma，hoechst33258，hoechst33342，hoechst34580，dapi，吖啶橙，7-aad，放线菌素d，lds751，羟茋巴脒(hydroxystilbamidine)，sytox蓝，sytox绿，sytox橙，popo-1，popo-3，yoyo-1，yoyo-3，toto-1，toto-3，jojo-1，lolo-1，bobo-1，bobo-3，po-pro-1，po-pro-3，bo-pro-1，bo-pro-3，to-pro-1，to-pro-3，to-pro-5，jo-pro-1，lo-pro-1，yo-pro-1，yo-pro-3，picogreen，oligreen，ribogreen，sybr金，sybr绿i，sybr绿ii，sybrdx，syto-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)，syto-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)，syto-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，syto-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)，荧光素，异硫氰酸荧光素(fitc)，四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)，罗丹明，四甲基罗丹明，r-藻红蛋白，vic，ned，pet，cy-2、cy-3、cy-3.5、cy-5、cy5.5、cy-7，德克萨斯红(texasred)，phar-red，别藻蓝蛋白(apc)，sybr绿i，sybr绿ii，sybr金，celltracker绿，7-aad，乙锭同型二聚体i，乙锭同型二聚体ii，乙锭同型二聚体iii，溴化乙锭，伞形酮，曙红，绿色荧光蛋白，赤藓红，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀绿，茋，荧光黄，级联蓝(cascadeblue)，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯，荧光镧系络合物(如那些包括铕和铽的络合物)，羧基四氯荧光素(tet)，5和/或6-羧基荧光素(fam)，5-(或6-)碘乙酰胺基荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰基巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(samsa-荧光素)，丽丝胺罗丹明b磺酰氯，5和/或6羧基罗丹明(rox)，5-和/或6-羧基四甲基罗丹明(tamra)，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(joe)，6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(hex)，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)，bodipy荧光团，8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，3,6-二磺酸-4-氨基-萘二甲酰亚胺，藻胆蛋白，alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，dylight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料，或其他荧光团。

在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。由于探针与扩增产物的序列特异性结合，寡核苷酸探针的使用可提高检测的特异性和灵敏度。探针可连接至本文所述的任何光学活性报告剂(例如，染料)，并且还可包括能够阻断相关联的染料的光学活性的猝灭剂。可用作报告剂的探针的非限制性实例包括taqman探针、taqmantamara探针、taqmanmgb探针或lion探针。

在一些实施方案中，报告剂可以是在与扩增产物杂交时具有阻断的光学活性的序列特异性寡核苷酸探针。在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针在断裂时显示光学活性。例如，所述报告剂可以是寡核苷酸探针，其包含光学活性染料(例如，荧光染料)和相邻地位于探针上的猝灭剂。染料与猝灭剂的紧密靠近可阻断染料的光学活性。探针可与待扩增的靶序列结合。一旦在扩增期间dna聚合酶的外切核酸酶活性使探针断裂，则猝灭剂与染料分离，而游离的染料重新获得其光学活性，该活性随后可被检测到。所述寡核苷酸探针可为rna寡核苷酸探针或dna寡核苷酸探针。

在一些实施方案中，报告剂可以是分子信标(molecularbeacon)。分子信标包括，例如，在发夹构象的寡核苷酸的一端上连接的猝灭剂。在该寡核苷酸的另一端是光学活性染料，例如，荧光染料。在发夹构型中，光学活性染料和猝灭剂足够紧密地接近，使得猝灭剂能够阻断染料的光学活性。然而，一旦与扩增产物杂交，该寡核苷酸即呈线性构象并与该扩增产物上的靶序列杂交。寡核苷酸的线性化导致光学活性染料与猝灭剂的分离，从而使得光学活性恢复，并且可被检测到。分子信标对扩增产物上的靶序列的序列特异性可改善检测的特异性和灵敏度。

在多个方面的任何方面中，所述试剂可包含一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。所述试剂可包含适于进行核酸扩增的任意量的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。例如，所述试剂可包含约少于0.01μm，0.01μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm、11.0μm、12.0μm、13.0μm、14.0μm、15.0μm、多于15.0μmdntp，或任意上述数值之间范围浓度的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标，例如，约0.01至10.0μm、0.05至5.0μm、0.05至4.0μm、0.05至3.0μm、0.05至2.0μm、0.05至1.0μm、0.05至0.5μm、0.1至5.0μm、0.1至4.0μm、0.1至3.0μm、0.1至2.0μm、0.1至1.0μm、0.1至0.9μm、0.1至0.8μm、0.1至0.7μm、0.1至0.6μm、0.1至0.5μm的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至0.5μm的一种或多种寡核苷酸探针或分子信标。

在一些实施方案中，报告剂可以是放射性种类。放射性种类的非限制性实例包括¹⁴c、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、tc99m、³⁵s或³h。

在一些实施方案中，报告剂可以是能够产生可检测信号的酶。可检测信号可通过酶对其底物，或在酶具有多个底物的情况下对特定底物的活性来产生。可用作报告剂的酶的非限制性实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、i²-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶和萤光素酶。

在平行进行的扩增反应中，可使用多种报告剂来检测多种扩增产物。所述多种报告剂中的每一种可产生可检测信号，而所述多种报告剂产生的可检测信号彼此不同。所述多种可检测信号中的每一种可指示其对应的扩增产物是否存在。所述多种可检测信号中的每一种的强度可与其对应扩增产物的量成比例。例如，一种扩增产物对应的可检测信号可为fam荧光，而另一种扩增产物对应的可检测信号可为rox荧光。平行检测不同的可检测信号可使得能够比较不同扩增产物的存在与否和量。或者或而且，平行检测不同的可检测信号可使得能够针对内部参考物确定扩增产物的量。

在多个方面的任何方面中，所述试剂可进一步包含mgcl2。所述试剂可包含适于进行核酸扩增的任意量的mgcl2。例如，所述试剂可包含约少于0.01mm，0.01mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm、10.0mm、11.0mm、12.0mm、13.0mm、14.0mm、15.0mm、多于15.0mmmgcl2，或任意上述数值之间范围浓度的mgcl2，例如，约0.01至15.0mm、0.05至14.0mm、0.1至13.0mm、0.2至12.0mm、0.3至11.0mm、0.4至10.0mm、0.5至9.0mm、0.6至8.0mm、0.7至7.0mm、0.8至6.0mm、0.9至5.0mm、1.0至4.0mm、1.1至3.0mm、1.2至2.5mm、1.3至2.0mm、1.4至1.6mmmgcl2。在一个方面，所述试剂可包含约1.5mmmgcl2。

在多个方面的任何方面中，所述试剂可包含dntp。所述试剂可包含适于进行核酸扩增的任意量的dntp。例如，所述试剂可包含约少于0.01mm，0.01mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、6.0mm、7.0mm、8.0mm、9.0mm、10.0mm、11.0mm、12.0mm、13.0mm、14.0mm、15.0mm、多于15.0mmdntp，或任意上述数值之间范围浓度的dntp，例如，约0.01至10.0mm、0.05至5.0mm、0.05至4.0mm、0.05至3.0mm、0.05至2.0mm、0.05至1.0mm、0.05至0.5mm、0.1至5.0mm、0.1至4.0mm、0.1至3.0mm、0.1至2.0mm、0.1至1.0mm、0.1至0.9mm、0.1至0.8mm、0.1至0.7mm、0.1至0.6mm、0.1至0.5mmdntp。在一个方面，所述试剂可包含约0.1至0.5mmdntp。

在多个方面，可检测扩增产物(例如，扩增的dna产物、扩增的rna产物)。扩增产物(包括扩增的dna)的检测可采用任何合适的检测方法来实现。所使用的检测方法的具体类型可取决于，例如，具体的扩增产物，用于扩增的反应容器的类型，反应混合物中的其他试剂，报告剂是否包括在反应混合物中，以及在使用报告剂时所使用的报告剂的具体类型。检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测、电化学检测等。光学检测方法包括但不限于荧光测定法和紫外-可见光吸收。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(nmr)波谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于在扩增产物的高效液相色谱分离后对扩增产物的电化学检测。

在一些实施方案中，可在所述引物延伸反应中检测扩增产物。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中检测扩增产物。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中的每个单个系列中检测扩增产物。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中的一些单个系列，但不在其它单个系列中检测扩增产物。例如，所述多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。可在第一系列中不检测扩增产物，而在第二系列中检测扩增产物。或者，可在第一系列中检测扩增产物，而在第二系列中不检测扩增产物。或者，可在第一系列和第二系列中均检测扩增产物，或在第一系列和第二系列中均不检测扩增产物。

在一些实施方案中，可在所述引物延伸反应中检测由报告剂产生的可检测信号。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中检测由报告剂产生的可检测信号。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中的每个单个系列中检测由报告剂产生的可检测信号。在一些实施方案中，可在多个系列的引物延伸反应中的一些单个系列，但不在其它单个系列中检测由报告剂产生的可检测信号。例如，所述多个系列的引物延伸反应可包括第一系列和第二系列。可在第一系列中不检测由报告剂产生的可检测信号，而在第二系列中检测由报告剂产生的可检测信号。或者，可在第一系列中检测由报告剂产生的可检测信号，而在第二系列中不检测由报告剂产生的可检测信号。或者，可在第一系列和第二系列中均检测由报告剂产生的可检测信号，或在第一系列和第二系列中均不检测由报告剂产生的可检测信号。

在所述多个方面中的任何方面，完成方法的要素所需的时间可根据该方法的具体步骤而变化。例如，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约120分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约60分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可为约5分钟到约30分钟。在其他实例中，用于完成方法的要素的时间量可以小于或等于120分钟，小于或等于90分钟，小于或等于75分钟，小于或等于60分钟，小于或等于45分钟，小于或等于40分钟，小于或等于35分钟，小于或等于30分钟，小于或等于25分钟，小于或等于20分钟，小于或等于15分钟，小于或等于10分钟，或者小于或等于5分钟。

在一些实施方案中，可将关于扩增产物(例如，扩增的dna产物)的存在和/或量的信息输出至接收者。关于扩增产物的信息可经由多种方法输出。在一些实施方案中，此等信息可口头提供给接收者。在一些实施方案中，此等信息可在报告中提供。报告可包括任何数目的所期望的元素，该元素的非限制性实例包括关于受试者(例如，性别、年龄、种族、健康状况等)的原始数据、经处理的数据(例如，图形显示(例如，图、图表、数据表、数据汇总)、确定的循环阈值、靶多核苷酸起始量的计算值)的信息，关于是否存在靶核酸的结论，诊断信息，预后信息，疾病信息，等等，及其组合。该报告可作为打印的报告(例如，硬拷贝)提供，或者可作为电子报告提供。在一些实施方案(包括其中提供电子报告的情况)中，此等信息可经由诸如监视器或电视、可操作地与用于获得扩增产物的单元连接的屏、平板计算机屏、移动装置屏等电子显示器(例如，电子显示屏)输出。打印的报告和电子报告均可分别存储于文件或数据库中，使得它们可被访问以供与以后的报告进行比较。

此外，可使用任何合适的通信介质(包括，例如，网络连接、无线连接或因特网连接)将报告发送至本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，可将报告发送至接收者的装置，诸如个人计算机、电话、平板或其他装置。该报告可在线观看、保存在接收者的装置上或打印。还可通过用于传送信息的任何其他手段传送报告，该手段的非限制性实例包括邮寄硬拷贝报告供接收和/或接收者查看。

此外，可将此等信息输出至各种不同类型的接收者。此等接收者的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医师、治疗受试者的医师、用于临床试验的临床监视器、护士、研究人员、实验室技术员、制药公司的代表、医疗保健公司、生物技术公司、医院、人类援助组织、医疗保健管理者、电子系统(例如，存储例如受试者的医疗记录的一台或多台计算机和/或一台或多台计算机服务器)、公共卫生工作者、其他医务人员和其他医疗设施。

在一个方面，本发明提供了一种实施根据本文所公开的任何方法的方法的系统。在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶rna的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(dna)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)dna聚合酶，和(iii)针对靶rna的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶rna的扩增dna产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ⅱ)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶rna；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于靶rna或dna产物的信息输出至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶rna的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：(i)在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含已经从受试者获得的生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(dna)扩增所必需的试剂，该试剂包含(1)逆转录酶，和(2)针对靶rna的引物组；及(ii)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的扩增dna产物；(iii)检测(iii)的扩增dna产物的量；及(iv)将关于扩增dna产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(i)-(iv)的时间量小于或等于约30分钟；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将所述信息传送至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统包括：(a)输入模块，其接收扩增生物样品中的靶rna的用户请求；(b)扩增模块，其响应于该用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂，该试剂包含(i)dna聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及，使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在生物样品中存在靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育该反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育该反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列；及(c)可操作地耦合至该扩增模块的输出模块，其中该输出模块将关于靶rna或dna产物的信息输出至接收者。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统。该系统可包括具有显示图形元素的用户界面的电子显示屏，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增生物样品中的靶核酸的扩增方案。该系统还可包括计算机处理器(包括如本文其他地方所述的具有计算机处理器的任何适宜的装置)，其耦合至该电子显示屏并被编程为在用户选择所述图形元素时执行该扩增方案。该扩增方案可包括：使包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成扩增产物。该扩增产物可指示生物样品中靶核酸的存在。此外，每个系列的引物延伸反应可包括两个或更多个如下的循环：在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物。就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列可不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

另外，对本发明的方法的任何限定和描述，除非明显相悖，否则也适用于本发明的系统。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。所述系统可包括：输入模块，其接收处理所述生物样品以检测所述靶核酸分子的用户请求；以及一个或多个与所述输入单元可操作连接的计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为进行本申请所述的任何方法。在一个方面，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和(ii)针对所述靶核酸分子的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸分子的扩增产物，每个循环包括：(i)在变性温度下孵育所述反应混合物少于或等于60秒的变性持续时间，接着(ii)在延伸温度下孵育所述反应混合物少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶核酸分子。所述扩增产物可为dna产物。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。所述系统可包括：输入模块，其接收处理所述生物样品以检测所述靶核酸分子的用户请求；以及一个或多个与所述输入单元可操作连接的计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为进行本申请所述的任何方法。在一个方面，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和任选地，逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。所述生物样品可包含粪便样品。所述生物样品可包含乳汁样品。所述扩增产物可为dna产物。

在一个方面，本发明涉及一种用于检测生物样品中的靶核酸分子的系统。所述系统可包括：输入模块，其接收处理所述生物样品以检测所述靶核酸分子的用户请求；以及一个或多个与所述输入单元可操作连接的计算机处理器。所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为进行本申请所述的任何方法。在一个方面，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地编程为a)将所述生物样品与裂解缓冲液混合以获得混合物；b)将所述混合物在高于15℃的孵育温度下孵育不多于约15分钟的孵育持续时间，或不进行孵育；c)将来自b)的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和任选地，逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组，以获得反应混合物；以及d)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。所述生物样品可包含粪便样品。所述生物样品可包含乳汁样品。所述扩增产物可为dna产物。

本发明的系统还可包括生物样品处理模块，其使得所述生物样品与所述裂解缓冲液混合以获得所述混合物。所述生物样品处理模块可包含所述混合物。所述生物样品处理模块可孵育所述混合物。例如，所述生物样品处理模块可包括加热块或孵育箱，所述加热块或孵育箱能够将所述生物样品与所述裂解缓冲液的混合物在高于约15℃，例如，在高于约20℃，高于约25℃，高于约30℃，高于约35℃，高于约40℃，高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃，高于约60℃，高于约65℃，高于约70℃，高于约75℃，高于约80℃，高于约85℃，高于约90℃，高于约91℃，高于约92℃，高于约93℃，高于约94℃，高于约95℃，高于约96℃，高于约97℃，高于约98℃，高于约99℃，高于约100℃的温度下进行孵育，或者，在约20℃至约90℃的温度下进行孵育，例如，在约25℃至约85℃、约30℃至约80℃、约40℃至约70℃、约40℃至约95℃、约45℃至约90℃、约50℃至约85℃、约55℃至约80℃、约60℃至约75℃、约65℃至约75℃、或约65℃至约70℃的温度下进行孵育。

所述生物样品处理模块可将所述生物样品与所述裂解缓冲液的混合物孵育不多于20分钟的孵育时间。例如，所述孵育持续时间可为不多于19分钟，不多于18分钟，不多于17分钟，不多于16分钟，不多于15分钟，不多于14分钟，不多于13分钟，不多于12分钟，不多于11分钟，不多于10分钟，不多于9分钟，不多于8分钟，不多于7分钟，不多于6分钟，不多于5分钟，不多于4分钟，不多于3分钟，不多于2分钟，不多于1分钟，不多于50秒，不多于40秒，不多于30秒，不多于20秒，不多于15秒，或不多于10秒。

所述生物样品处理模块可将所述匀质制备物在高于约40℃的温度下孵育，例如，可以在高于约45℃，高于约50℃，高于约55℃，高于约60℃，高于约65℃，高于约70℃，高于约75℃，高于约80℃，高于约85℃，高于约90℃，高于约91℃，高于约92℃，高于约93℃，高于约94℃，高于约95℃，高于约96℃，高于约97℃，高于约98℃，高于约99℃，高于约100℃的温度下进行孵育。

所述生物样品处理模块可将所述匀质制备物孵育不多于20分钟的孵育时间。例如，所述孵育持续时间可为不多于19分钟，不多于18分钟，不多于17分钟，不多于16分钟，不多于15分钟，不多于14分钟，不多于13分钟，不多于12分钟，不多于11分钟，不多于10分钟，不多于9分钟，不多于8分钟，不多于7分钟，不多于6分钟，不多于5分钟，不多于4分钟，不多于3分钟，不多于2分钟，不多于1分钟，不多于50秒，不多于40秒，不多于30秒，不多于20秒，不多于15秒，或不多于10秒。

本发明的系统还可包括与所述生物样品处理模块可操作地连接的扩增模块，其中所述扩增模块(i)从生物样品处理模块添加一定量的混合物至反应容器，以及(ii)使反应容器中的反应混合物经历引物延伸反应以生成扩增产物，所述扩增产物指示所述靶核酸分子的存在。

在一些实施方案中，所述扩增模块将来自生物样品处理模块的混合物添加至反应容器，所述反应容器包含进行核酸扩增所需的试剂，所述试剂包括：(i)脱氧核糖核酸(dna)聚合酶，和任选地，逆转录酶，和(ii)一个或多个引物组，每个引物组能够特异性结合靶核酸序列或其变体，以获得反应混合物；以及使所述反应容器中的所述反应混合物经历一个或多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸序列的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中当进行多个系列的引物延伸反应时，就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

或者，所述混合物可手动添加至所述反应容器，而所述扩增模块可使所述反应容器中的所述反应混合物经历一个或多个系列的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶核酸序列的扩增产物。

在一些实施方案中，一旦识别了与所述系统一同施用的试剂盒中包含的关于用于进行引物延伸反应的一个或多个相关参数的信息，所述扩增模块可自动使使所述反应容器中的所述反应混合物经历一个或多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述样品中存在所述靶核酸序列的扩增产物。所述信息可以由与所述扩增模块通信的识别模块识别，如本文中其它部分所述。

本发明的系统还可包括与一个或多个计算机处理器可操作地连接的输出模块，其中所述输出模块将关于所述靶核酸分子或所述扩增产物的信息输出至接收者。

在本发明的系统中，在将生物样品与裂解缓冲液混合之前，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将所述生物样品在溶液中悬浮，以获得包含所述生物样品的匀质制备物。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为对所述生物样品进行离心，以获得包含生物样品的上清液和沉淀，或获得上清液和包含生物样品的沉淀。

在一些实施方案中，在将所述生物样品与裂解缓冲液的混合物孵育之后，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为对所述混合物进行离心以获得上清液。所述上清液可包含生物样品。然后，可将所述上清液用作后续反应中的混合物。例如，可将所述上清液添加至包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器中。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使所述生物样品经培养增菌。例如，在与裂解缓冲液混合之前，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使生物样品在富集培养条件下经历培养持续时间。所述富集培养条件可包括在合适的培养基(例如胰酶大豆培养液(tbs)、改性胰酶大豆培养液、胰蛋白胨、营养培养液、溶菌培养液(lb)、革兰氏阴性培养液、蛋白胨、含酵母的胰酶大豆培养液、或沙门氏菌培养基)中在合适的温度下(例如，约23℃至约40℃，诸如约25℃、约30℃、约35℃、或约37℃等)在振荡或不振荡的条件下培养生物样品。在一些实施方案中，所述培养基是沙门氏菌特异性培养基，其相对于其它细菌，更有利于沙门氏菌增殖。示例性的沙门氏菌特异性培养基包括亚硫酸铋琼脂(bs)、木糖赖氨酸脱氧胆酸琼脂(xld)、亚硒酸亮绿磺胺培养液(sbg)等，但不限于此。所述培养持续时间可为约0.5小时至10小时，例如，约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时、约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、或约10小时。在一些实施方案中，所述培养持续时间为不超过约7小时，例如，不超过约6.5小时、不超过约6小时、不超过约5.5小时、不超过约5小时、不超过约4.5小时、不超过约4小时、不超过约3.5小时、不超过约3小时、不超过约2.5小时、不超过约2小时、不超过约1.5小时、不超过约1小时、或不超过约0.5小时。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之前和/或之后，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为对所述生物样品进行离心，以获得包含生物样品的上清液和沉淀，或获得上清液和包含生物样品的沉淀。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之后，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将所述生物样品与裂解缓冲液混合，而不经历选择性富集、铺板于区分培养基、和/或预期性生物医学鉴定。

在一些实施方案中，在所述生物样品在富集培养条件下经历了培养持续时间之后，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将裂解缓冲液添加至所述混合物。所述裂解缓冲液可为碱性的。例如，所述裂解缓冲液可包含naoh。所述裂解缓冲液的ph可为约7至约14，诸如约8至约13，约9至约12，约10至约11。例如，所述裂解缓冲液的ph可为约7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、或14。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使所述生物样品与所述裂解缓冲液的混合物在未经历dna或核糖核酸(rna)提取的条件下添加至反应容器中。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使所述混合物在未经历纯化的条件下添加至反应容器中。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使所述混合物在未经历dna或rna浓缩的条件下添加至反应容器中。所述反应容器可为包含用于进行核酸扩增所需的试剂的反应容器。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将从受试者获得的生物样品或如本文中所述从所述生物样品获得的混合物、上清液或匀质制备物与对于在反应容器中进行核酸扩增所需的试剂一起提供以获得反应混合物。所述反应容器可为本文中所述的任何反应容器。

在本发明的系统中，还可以包含识别模块，用于识别与本发明的系统一同使用的试剂盒所包含的信息。例如，所述试剂盒用独特标识符标记。所述独特标识符可为条形码。所述条形码可为一维条形码或二维条形码。所述条形码可允许通过扫描来提取关于所述试剂盒的信息。所述独特标识符可涉及无接触(contactless)技术。所述无接触技术允许通过将所述试剂盒置于无接触检测器附近来提取关于所述试剂盒的信息。所述无接触检测器可使用射频识别(rfid，radiofrequencyidentification)技术从所述试剂盒提取信息。在一些实施方案中，所述独特标识符可为rfid标记。

在一些实施方案中，所述识别模块可包含条形码扫描模块，用于扫描试剂盒上的条形码以提取信息。在一些实施方案中，所述识别模块可包含rfid模块(例如，无接触检测器)，用于使用射频识别技术从所述试剂盒提取信息。在一些实施方案中，所述识别模块包含所述条形码扫描模块和所述rfid模块两者。

所述识别模块可与本发明所述的一种或多种其它模块可操作地连接或通信，从而将所提取的信息传输给所述一种或多种其它模块。所述信息可为进行引物延伸反应的相关参数。例如，所述识别模块可与本发明所述的扩增模块通信，从而将所述扩增模块要执行的引物延伸反应的相关参数传输给所述扩增模块。一旦接收了所述参数，所述扩增模块可根据所述参数自动执行所述引物延伸反应。所述参数可为，例如所述引物延伸反应的系列数、每个系列的循环数、变性条件、延伸条件、一个或多个引物组、报告剂、寡核苷酸探针等，但不限于此。

在本发明的系统中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为检测所述扩增产物的量和/或存在与否。在一些情况下，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将指示所述扩增产物的量和/或存在与否的信息输出至接收者。

在本发明的系统中，还可以包含检测模块，用于检测扩增产物的量。所述检测模块可使用本文中所述的任何检测方法来检测扩增产物。例如，所述检测模块可检测扩增反应中产生的可检测信号。例如，所述检测模块可检测本文中所述的报告剂产生的可检测信号。所述可检测信号可指示扩增产物是否存在。例如，可检测信号的存在或不存在可指示扩增产物是否存在。可检测信号的强度可与扩增产物的量成比例。在一些情况下，当扩增产物由与最初扩增的靶核酸不同类型的核酸所生成时，可检测信号的强度可与最初扩增的靶核酸的量成比例。

在一些实施方案中，所述检测模块是光学检测模块。所述光学检测模块可检测扩增反应中产生光学信号。所述光学信号可为本文中所述的任何光学活性染料产生的光学信号。例如，所述光学信号可以是由于扩增产物产生而伴随的光学信号。例如，所述光学信号可以是由于寡核苷酸探针在断裂时产生的光学信号。例如，所述光学信号可以是分子信标与扩增产物杂交时产生的光学信号。

在一些实施方案中，所述光学信号可为荧光信号，而所述检测模块可为荧光检测模块。例如，所述荧光检测模块可检测本文中任何荧光染料产生的荧光信号。例如，所述荧光检测模块可检测一种或多种选自下组的荧光染料产生的荧光信号：fam，tet，rox，joe，hex，tamra，vic，ned，pet，德克萨斯红等。

在一些实施方案中，所述检测模块可平行检测多种可检测信号。例如，所述多种可检测信号是由多种报告剂产生的，而所述多种报告剂产生的可检测信号彼此不同。所述多种可检测信号中的每一种可指示其对应的扩增产物是否存在。所述多种可检测信号中的每一种的强度可与其对应扩增产物的量成比例。例如，所述检测模块可平行检测fam荧光和rox荧光。在此情况下，一种扩增产物对应的可检测信号可为fam荧光，而另一种扩增产物对应的可检测信号可为rox荧光，从而使得可平行检测不同的可检测信号。平行检测不同的可检测信号可使得能够比较不同扩增产物的存在与否和量。或者，平行检测不同的可检测信号可使得能够针对内部参考物确定扩增产物的量。

检测模块可以包括一个图像传感器或多个图像传感器。图像传感器可以能够进行光学检测。图像传感器可以包括电荷耦合器件(ccd)传感器，其包含冷却式ccd。图像传感器可以包括有源像素传感器(aps)，诸如coms或nmos传感器。检测模块可以包括激光传感器。检测模块可以包括光电二极管，诸如雪崩光电二极管。检测模块可以包括光电倍增管(pmt)。传感器可以包括单个传感器或者相同类型或不同类型的多个传感器。

检测模块可以对检测对象(诸如本文中其它部分所述的检测区域)进行成像。检测模块可以在一个视野中对所述检测对象的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％进行成像。检测模块可以在本文中其它部分所述的装置或系统(例如核酸扩增装置或系统)的操作之前、期间或之后对检测对象进行成像。检测模块可以在装置或系统正在操作时实时地成像，例如在利用热循环仪进行核酸扩增反应时实时地成像。

检测模块可以记录单个静态图像或者可以记录视频。检测模块可以每分钟采样至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、90、120、150、180、210、240、270或300次。检测模块可以每分钟采样至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、90、120、150、180、210、240、270或300次。检测模块可以每分钟采样约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、90、120、150、180、210、240、270或300次。检测模块可以按至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120hz的速率进行采样。检测模块可以按至多约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120hz的速率进行采样。检测模块可以按约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120hz的速率进行采样。

检测模块可以具有特定的分辨率或灵敏度。检测模块在一面上可以包括至少约100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个像素。检测模块可以包括至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50兆个像素。检测模块可以具有至少约10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.009mm、0.008mm、0.007mm、0.006mm、0.005mm、0.004mm、0.003mm、0.002mm、0.001mm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm或100nm的分辨率。检测模块可以具有至多约10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.009mm、0.008mm、0.007mm、0.006mm、0.005mm、0.004mm、0.003mm、0.002mm、0.001mm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm或100nm的分辨率。检测模块可以具有约10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm、0.05mm、0.04mm、0.03mm、0.02mm、0.01mm、0.009mm、0.008mm、0.007mm、0.006mm、0.005mm、0.004mm、0.003mm、0.002mm、0.001mm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、250nm、200nm或100nm的分辨率。

检测模块可以包括光源。可以将光源集成到检测模块壳体或电泳装置壳体中。光源可以包括灯，诸如白炽灯、卤素灯、荧光灯、气体放电灯、弧光灯或led灯。光源可以包括激光器。光源可以产生特定波长或波长范围，诸如uv。光源可以包括滤光器，用于控制一个或多个输出波长。光源可以包括相同或不同类型的多个光源，其可以单独地或组合地使用。光源可以由其自己的壳体或由电泳装置壳体封闭。

检测模块可以包括各种光学元件，包括但不限于滤光器、透镜、准直器、反光镜、反射器、分束器和漫射器。检测区域可以暴露于光，例如来自光源的光。光可以穿过光源与基质之间的一个或多个光学元件，或者光可以直接从光源行进到检测区域。检测模块可以接收来自检测区域的光。光可以穿过检测区域与检测模块之间的一个或多个光学元件，或者光可以直接从检测区域行进到检测模块。光可以是准直的。光可以均匀地分布在检测区域的一个或多个维度上。可以利用基本上相等强度的光对一个或多个维度进行照明。可以按基本上垂直于检测区域上表面的方式来引导光。也可以按照基本上不垂直于检测区域上表面的方式来引导光。光可以是多向的。光可以包括一个波长、窄带波长、宽带波长或全波段光谱。光可以包括可见光波长。光可以包括紫外线波长。光可以包括红外线波长。光可以由透镜聚焦。由检测模块产生的图像可以包括亮视野图像。由检测模块产生的图像可以包括暗视野图像。由检测模块产生的图像可以包括荧光图像。

检测模块可以包括一个或多个滤光器，包括但不限于波长滤光器(例如，滤色器、紫外线滤光器、红外线滤光器)、二向色滤光器和偏振滤光器。滤光器可以包括相同类型或不同类型的多个滤光器，其可以单独地或组合地使用。

检测模块可以包括一个或多个透镜。透镜可以是微距透镜或“近摄”透镜。透镜可以是变焦透镜。透镜可以是红外透镜。透镜可以是紫外透镜。透镜可以是广角透镜，包括不限于广角透镜、超广角透镜和鱼眼透镜。透镜可以包括相同类型或不同类型的多个透镜，其可以单独地或组合地使用。

检测模块可以包括用于移除图像畸变或像差的装置，诸如用于移除桶形畸变或鱼眼畸变、枕形畸变、胡须状畸变、单色像差(例如，活塞、倾斜、散焦、球面像差、彗差、像散、像场弯曲、图像畸变)或色差(例如，轴向的、纵向的、侧向的、横向的色差)的装置。这样的装置可以包括被编程为实现用于部分地或完全地校正图像畸变的指令的计算机系统。例如，可以使用布朗畸变模型(brown’sdistortionmodel)或布朗-康拉德模型(brown-conradymodel)来校正径向畸变和切向畸变。

检测模块可以包括通信设备，诸如有线(例如，usb)或无线(例如，wi-fi、蓝牙)通信设备。通信设备可以包括用于无线电的设备。通信设备可以包括用于自由空间光学(fso)通信的设备，诸如可见光通信或红外(ir)通信。通信设备可以包括用于有线通信的设备，包括但不限于通用串行总线(usb)、光纤、外设部件互连(pci)、pciexpress(pcie)或thunderbolt。通信设备可以包括用于wi-fi的设备，诸如ieee802.11a、b、g或nwi-fi。通信设备可以包括用于蜂窝数据服务的设备，诸如gsm、cdma、gprs、3g(例如，w-cdma、edge和cdma2000)或4g(例如，长期演进(lte)、移动wimax)。通信设备可以包括用于移动卫星通信的设备。通信设备可以包括用于蓝牙通信的设备。通信设备可以包括多种类型的通信设备，诸如usb和wi-fi，或者蓝牙和wi-fi。

通信设备可以传输来自检测模块的信息，诸如由检测模块记录的图像(例如，检测区域的图像)。通信设备可以实时地传输诸如图像之类的信息。通信设备可以与电泳装置和/或其控制系统通信。通信设备可以与远程计算机系统通信，所述远程计算机系统诸如为台式计算机、膝上型计算机、平板计算机、智能电话设备或服务器。通信设备可以与诸如手持式显示设备之类的显示设备通信。通信设备可以向位于单独位置或设施处的用户传输信息，诸如图像。

在一些实施方案中，所述检测模块可为任何已知的检测模块，包括但不限于本文中其它部分所述的检测器。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使所述靶核酸分子经历一个或多个变性条件。所述一个或多个变性条件可选自变性温度分布和变性剂。

在一些情况下，在进行所述引物延伸反应之前，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为将所述生物样品在约90℃至约100℃的预加热温度下预加热不超过约10分钟的预加热持续时间。在一些实施方案中，所述预加热持续时间不超过1分钟。

在所述多个方面中的任何方面，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为进行多个循环的引物延伸反应。可进行任何适当数目的循环。例如，进行的循环数可以少于约100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5个循环。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使反应混合物经历多个系列的引物延伸反应。所述多个系列中的单个系列可包括多个循环的特定引物延伸反应，该反应的特征在于，例如，如本文其它地方所述的特定的变性和延伸条件。通常，例如，就变性条件和/或延伸条件而言，每个单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其它单个系列。例如，就斜变速率、变性温度、变性持续时间、延伸温度和延伸持续时间中的任意一个、两个、三个、四个或全部五个而言，单个系列可不同于所述多个系列中的另一个单个系列。此外，多个系列可包括任何数目的单个系列，例如，至少约或约为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个单个系列。

例如，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为进行包括第一系列和第二系列的多个系列的引物延伸反应。第一系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第一系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约35℃至约65℃下孵育不超过约一分钟。第二系列，例如，可包括超过十个循环的引物延伸反应，其中第二系列的每个循环包括(i)将反应混合物在约92℃至约95℃下孵育不超过30秒，随后(ii)将反应混合物在约40℃至约60℃下孵育不超过约1分钟。在这一具体实例中，第一和第二系列在它们的延伸温度条件上不同。然而，该实例并非意在限制，因为可以使用不同延伸和变性条件的任意组合。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使靶核酸在引物延伸反应启动之前经受变性条件。在多个系列的引物延伸反应的情况下，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使靶核酸在执行所述多个系列之前经受变性条件，或者可在所述多个系列之间经受变性条件。例如，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为使靶核酸在多个系列中的第一系列与第二系列之间经受变性条件。此等变性条件的非限制性实例包括变性温度分布(例如，一个或多个变性温度)和变性剂。

在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器可单独地或总体地被编程为在进行引物延伸反应之前预加热生物样品。预加热生物样品的温度(例如，预加热温度)和持续时间(例如，预加热持续时间)可根据例如所分析的特定生物样品而变化。在一些实例中，可将生物样品预加热不超过约60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些实例中，可在约80℃至约110℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约100℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约90℃至约97℃的温度下预加热生物样品。在一些实例中，可在约92℃至约95℃的温度下预加热生物样品。在另外其它的实例中，可在约80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的温度下预加热生物样品。

在一些实施方案中，本发明的系统可包括具有显示图形元素的用户界面的电子显示屏，该图形元素可被用户访问，以执行用以扩增生物样品中的靶核酸的扩增方案。该系统还可包括计算机处理器(包括如本文其它地方所述的具有计算机处理器的任何适宜的装置)，其耦合至该电子显示屏并被编程为在用户选择所述图形元素时执行该扩增方案。该扩增方案可包括：使包含生物样品和对于进行核酸扩增所需的试剂的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成扩增产物。该扩增产物可指示生物样品中靶核酸的存在。此外，每个系列的引物延伸反应可包括两个或更多个如下的循环：在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物。就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列可不同于所述多个系列中的至少一个其它单个系列。

在一些实施方案中，靶核酸可与疾病相关。例如，该疾病可与rna病毒或dna病毒相关。病毒的实例在本文其他地方提供。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如，如疟疾中的疟原虫)(包括本文其他地方描述的此等病原体的实例)相关。在一些实施方案中，该扩增方案可指向基于扩增产物的存在来测定所述疾病的存在。

在一些情况下，用户界面可以是图形用户界面。此外，用户界面可包括一个或多个图形元素。图形元素可包括图像和/或文本信息，如图片、图标和文本。图形元素在用户界面上可具有不同的尺寸和方向。此外，电子显示屏可以是任何适宜的电子显示器，包括本文其他地方描述的实例。电子显示屏的非限制性实例包括监视器、移动装置屏、膝上型计算机屏、电视、便携式视频游戏系统屏和计算器屏。在一些实施方案中，电子显示屏可包括触摸屏(例如，电容式或电阻式触摸屏)，使得在电子显示屏的用户界面上显示的图形元素可经由用户触摸电子显示屏来选择。

在一些实施方案中，该扩增方案可进一步包括为靶核酸选择引物组。在此等情况下，引物组可以是为扩增靶核酸分子的一个或多个序列而特别设计的引物组。在一些实施方案中，该扩增方案可进一步包括选择对靶核酸分子的一个或多个序列具有特异性的报告剂(例如，包含光学活性种类的寡核苷酸探针或本文其他地方所述的其他类型的报告剂)。此外，在一些实施方案中，该试剂可包括如本文其他地方所述的对于核酸扩增所必需的任何适宜的试剂，例如脱氧核糖核酸(dna)聚合酶、针对靶核酸的引物组以及(任选的)逆转录酶。

在一些实施方案中，用户界面可显示多个图形元素。每个图形元素可与多个扩增方案中的给定扩增方案相关联。所述多个扩增方案中的每个方案可包括系列引物延伸反应的不同组合。然而，在一些情况下，用户界面可显示与同一扩增方案相关联的多个图形元素。在一些实施方案中，每个图形元素和/或可与疾病相关联，并且所述多个扩增方案中的给定扩增方案可指向测定受试者的疾病的存在。因此，在此等情况下，用户可选择图形元素以便运行一个扩增方案(或一系列的扩增方案)从而分析特定的疾病。在一些实施方案中，该疾病可与病毒(例如，任何rna病毒或dna病毒，包括本文其他地方描述的此等病毒的实例)相关。病毒的非限制性实例包括人免疫缺陷病毒i(hivi)、人免疫缺陷病毒ii(hivii)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，h1n1病毒、h3n2病毒、h7n9病毒或h5n1病毒)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，具甲的rna-丙型肝炎病毒(rna-hcv))、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、eb病毒、单核细胞增多症病毒、巨细胞病毒、sars病毒、西尼罗热病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒(adv55)、7型腺病毒(adv7))和水痘病毒。在一些实施方案中，该疾病可与致病细菌(例如，结核分枝杆菌)或致病原生动物(例如，疟疾中的疟原虫)(包括本文其他地方描述的此等病原体的实例)相关。

在多个方面，所述系统包括输入模块，该输入模块接收扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核酸(例如，靶rna、靶dna)的用户请求。可使用能够接收此等用户请求的任何合适的模块。该输入模块可包括，例如，包含一个或多个处理器的装置。包含处理器(例如，计算机处理器)的装置的非限制性实例包括：台式计算机、膝上型计算机、平板计算机(例如，ipad、galaxytab)、蜂窝电话、智能电话(例如，iphone、支持的电话)、个人数字助理(pda)、视频游戏控制台、电视、音乐播放设备(例如，ipod)、视频播放设备、寻呼机和计算器。处理器可与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关联，或者在需要时植入固件中。如果在软件中实施，则例程(或程序)可存储于任何计算机可读存储器如ram、rom、闪速存储器、磁盘、激光盘或其他存储介质中。同样地，该软件可经由任何已知的传送方法输送到装置，该方法包括，例如，经通信信道，如电话线、因特网、本地内联网、无线连接等，或者经由便携式介质，如计算机可读磁盘、闪盘驱动器等。各个步骤可作为各种区组、操作、工具、模块或技术来实施，后者又可以在硬件、固件、软件或其任意组合中实施。当在硬件中实施时，这些区组、操作、技术等中的一些或全部可在例如定制集成电路(ic)、专用集成电路(asic)、现场可编程逻辑阵列(fpga)、可编程逻辑阵列(pla)等中实施。

在一些实施方案中，输入模块被配置成接收进行靶核酸扩增的用户请求。输入模块可直接地(例如，通过输入设备，诸如由用户操作的键盘、鼠标或触摸屏)或间接地(例如，通过有线或无线连接，包括经因特网)接收用户请求。输入模块可经由输出电子器件向扩增模块提供用户的请求。在一些实施方案中，输入模块可包括用户界面(ui)，如图形用户界面(gui)，该用户界面被配置成能够使用户提供扩增靶核酸的请求。gui可包括文本、图形和/或音频成分。gui可在电子显示器上提供，该电子显示器包括含有计算机处理器的装置的显示器。此等显示器可包括电阻式或电容式触摸屏。

用户的非限制性实例包括从中获得生物样品的受试者、医务人员、临床医生(例如，医生、护士、实验室技术员)、实验室人员(例如医院实验室技术人员、研究科学家、药学科学家)、临床试验的临床监视者，或医疗保健行业中的其他用户等。

在多个方面，所述系统包括扩增模块，该扩增模块用于响应于由输入模块接收的用户请求而对靶核酸或其部分进行核酸扩增反应。该扩增模块可以能够执行本文所述的任何方法，并且可以包括流体处理装置、一个或多个热循环仪、用于接纳一个或多个反应容器(例如，热循环的热块的孔)的装置、能够检测扩增产物的检测器(例如，光学检测器、光谱检测器、电化学检测器)以及用于向接收者输出关于扩增产物(扩增的dna产物)的存在和/或量的信息(例如，原始数据，经处理的数据或本文所述的任何其他类型的信息)的装置中的任何装置。在一些情况下，该扩增模块可包括具有如本文其他地方所述的计算机处理器的装置，并且还可以能够在适宜软件的辅助下分析自检测获得的原始数据。此外，在一些实施方案中，该扩增模块可包括从输入模块接收指令所必需的输入电子器件并且可包括与输出模块进行通信所必需的输出电子器件。

在一些实施方案中，向反应容器提供材料、扩增核酸、检测扩增产物和输出信息的一个或多个步骤可由扩增模块自动化操作。在一些实施方案中，自动化操作可包括使用一个或多个流体处理器和相关联的软件。可采用若干市售的流体处理系统来运行此等过程的自动化操作。此等流体处理器的非限制性实例包括来自perkin-elmer、caliperlifesciences、tecan、eppendorf、apricotdesign和velocity11的流体处理器。

在一些实施方案中，扩增模块可包括实时检测仪器。此等仪器的非限制性实例包括实时pcr热循环仪、abi7000序列检测系统、abi7700序列检测系统、appliedbiosystems7300实时pcr系统、appliedbiosystems7500实时pcr系统、appliedbiosystems7900ht快速实时pcr系统(均来自appliedbiosystems)；lightcycler^tm系统(rochediagnosticsgmbh)；mx3000p^tm实时pcr系统、mx3005p^tm实时pcr系统和多重定量pcr系统(multiplexquantitativepcrsystem)(stratagene,lajolla,calif.)；以及智能循环仪系统(smartcyclersystem)(cepheid，由fisherscientific分销)。在一些实施方案中，扩增模块可包括另一种自动化仪器，例如，ampliprep/系统(rochemolecularsystems)、tigrisdts系统(hologicgen-probe,sandiego,ca)、panther系统(hologicgen-probe,sandiego,ca)、bdmax^tm系统(bectondickinson)、genexpert系统(cepheid)、(biofirediagnostics)系统、icubate系统、idbox系统(luminex)、encompassmdx^tm(rheonix)系统、liat^tmaanlyzer(iquum)系统、biocartis的moleculardiagnosticplatform系统、ml系统(enigmadiagnostics)、系统(t2biosystems)、系统(nanosphere)、greatbasin的diagnosticsystem、unyvero^tm系统(curetis)、pannat系统(micronics)或spartan^tmrx系统(spartanbioscience)。

在各个方面，所述系统包含可操作地连接至扩增模块的输出模块。在一些实施方案中，该输出模块可包含具有如上所述的用于输入模块的处理器的装置。该输出模块可包括如本文所述的输入设备，并且/或者可包括用于与扩增模块通信的输入电子器件。在一些实施方案中，该输出模块可以是电子显示器，在一些情况下，该电子显示器包括ui。在一些实施方案中，该输出模块是可操作地耦合至计算机网络如因特网的通信接口。在一些实施方案中，该输出模块可使用任何合适的通信媒介(包括计算机网络、无线网络、本地内联网或因特网)将信息至传送至处于本地或远程位置的接收者。在一些实施方案中，该输出模块能够分析从扩增模块接收到的数据。在一些情况下，该输出模块包括能够生成报告并将报告传送至接收者的报告生成器，其中该报告包含如本文其他地方所述的关于扩增产物的量和/或存在的任何信息。在一些实施方案中，该输出模块可响应于从扩增模块接收到的信息自动地传送信息，例如以原始数据或由包含在扩增模块中的软件进行的数据分析的形式。或者，该输出模块可在接收用户指令后传送信息。由输出模块传送的信息可以经电子方式进行查看或者由打印机打印出来。

输入模块、生物样品处理模块、识别模块、检测模块、扩增模块和输出模块中的一种或多种可包含在同一装置中，或者可包含一种或多种相同的组件。例如，扩增模块也可包含输入模块、生物样品处理模块、识别模块、检测模块、输出模块，或其中的一种或多种。在其他实例中，包含处理器的装置既可包含在输入模块中也可包含在输出模块中。用户可使用该装置来请求对靶核酸进行扩增，并且也可将该装置用作将关于扩增产物的信息传送至接收者的工具。在一些情况下，包含处理器的装置可包含在全部六种模块中，使得该包含处理器的装置也可用于控制包含在扩增模块或任何其他模块中的仪器(例如，热循环仪、孵育器、检测器、流体处理装置)，对该仪器提供指令，并接收从该仪器返回的信息。所述六种模块的每一种可进一步包含本文中所述的一种或多种计算机处理器，和/或可执行所述一种或多种计算机处理器被编程为执行的功能。

用于根据本文所述方法扩增靶核酸的示例性系统示于图1中。该系统包括既可充当输入模块的一部分又可充当输出模块的一部分的计算机101。用户将包含准备进行核酸扩增的反应混合物的反应容器102放入扩增模块104中。该扩增模块包括热循环仪105和检测器106。输入模块107包括计算机101和相关的输入设备103(例如，键盘、鼠标等)，输入设备103可以接受用户对反应混合物中的靶核酸进行扩增的请求。输入模块107将用户的请求通信至扩增模块104，并且核酸扩增在热循环仪105中开始。随着扩增进行，扩增模块的检测器106对扩增产物进行检测。关于扩增产物的信息(例如，由检测器获得的原始数据)从检测器106传送回计算机101，计算机101也充当输出模块108的组件。计算机101接收来自扩增模块104的信息，对该信息进行任何额外的操作，随后生成包含经处理的信息的报告。一旦报告生成，计算机101随后经由计算机网络接口110通过计算机网络(例如，内联网、因特网)、经由打印机111以硬拷贝形式或者经由可操作地连接至计算机101的电子显示器112将报告传送至其最终接收者109。在一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个处理器执行时，实施根据本文公开的任何方法的方法。在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的方法，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(dna)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)dna聚合酶，和(iii)针对靶rna的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶rna的扩增dna产物，每个循环包括(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶rna。

在另一方面，本发明提供了一种包含机器可执行代码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的方法，该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(dna)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶rna的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶rna的可检测量的扩增dna产物；(d)检测(c)的dna产物的量；及(e)将关于dna产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。

在一方面，本发明提供了一种包含机器可执行码的计算机可读介质，其被一个或多个计算机处理器执行时，实施扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(rna)的方法，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)dna聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对靶核酸的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个系列的引物延伸反应以由靶核酸生成扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育反应混合物，其中就变性条件和/或延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。

计算机可读介质可采取许多形式，包括但不限于，有形(或非暂时性)存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等等，例如可用于实施计算步骤、处理步骤等。易失性存储介质包括动态存储器，如计算机的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括计算机系统内包含总线的导线。载波传输介质可采取电信号或电磁信号或者声波或光波如射频(rf)和红外(ir)数据通信过程中产生的那些的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括，例如：软盘、柔性盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光学介质、穿孔纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、ram、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储芯片或匣盒、传输数据或指令的载波、传送此等载波的电缆或链路(link)、或计算机可从中读取程序代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可参与将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。

实施例

实施例1：病毒储备样品和生物样品中的核酸的扩增和检测

pcr试剂从卡尤迪生物科技(北京)有限公司获得(coyoteone-steppcrreagent)。使用数字pcr和qpcr在人工合成的仿制临床样品中检测病毒。所述样品包含血清和hbv类似物(卡尤迪生物科技(北京)有限公司)。部分仿制临床样品使用qiagenqiaampdnaminikit进行核酸纯化，其它仿制临床样品未经核酸纯化。经纯化的样品在本实验中用作对照。

将经核酸纯化和未经核酸纯化的仿制临床样品(10iu/反应)置于不同试管中与coyoteone-steppcrreagent混合。反应混合物根据本说明书中记载的方法形成小液滴。具体而言，在本领域已知的使用hfe7500和表面活性剂的制剂的基础上，添加了tween60，以及任选的fluorinertfc-70(sigmaaldrich)用于形成小液滴。所述小液滴内侧为包含所述反应混合物(包含hbv病毒)的水性溶液，外侧由油层包裹。

在形成小液滴之后，用定量pcr和数字pcr对所述小液滴进行分析。用pcr扩增直接检测hbv的方法如本说明书所述，其中变性温度可高至100℃，循环数可高至80个循环。

实验结果显示于图2-3。图2a-d显示了使用本发明的方法制备的小液滴，其分别对应于使用下述制剂制备的小液滴：2％tween60，hfe7500，2％乙醇酸聚氧乙基月桂醚(a)；0.1％tween60，hfe7500，2％乙醇酸聚氧乙基月桂醚(a)；fc-70，hfe7500，2％乙醇酸聚氧乙基月桂醚(c)；以及fc-70，hfe7500，2％乙醇酸聚氧乙基月桂醚(d)。

如图可见，使用含tween60的制剂制备的小液滴具有不良的小液滴稳定性和小液滴彼此之间的均匀性。相反，使用含fc-70的制剂制备的小液滴具有良好的小液滴稳定性和小液滴彼此之间的均匀性。

在试剂中进一步添加tween20，和任选地接着进行涡旋，使得小液滴更加稳定(数据未显示)。

使用这些小液滴进行了定量pcr和数字pcr反应，发现这些小液滴在高温下(100℃)保持稳定，并能够耐受较长的循环时间(高至80个循环)，而未发生变形或小液滴彼此之间的合并。

使用这些小液滴进行的定量pcr和数字pcr反应成功地检测出了仿制临床样品中的血清中含有的hbv。图3显示了含有不同效价的hbv(a：高效价hbv；b：中等效价hbv；c：低效价hbv；d：阴性对照)的小液滴的荧光检测结果。结果显示使用这些小液滴进行的扩增反应可以灵敏地检测出病毒。对照样品(经纯化的核酸样品)也通过类似的方法使用定量pcr和数字pcr检测出了病毒(结果未显示)。

因此，将one-steppcrreagent与本发明的包含电子液体(如fc-70)和/或基于单硬脂酸酯的乳化剂(如tween60)的新颖制剂组合能够简化通过pcr方法(如定量pcr和数字pcr)进行的传染病检测的流程。

尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅仅是以示例的方式提供的。本领域技术人员在不背离本发明的情况下，现将想到大量变化、改变和替代。应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。目的在于，用以下权利要求限定本发明的范围，由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。