核酸的定量、高度多重检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在多重单腔室反应中检测和定量样品中靶核酸的方法。提供了整合经优化腔室以降低高效阵列附近的信号背景的耗材，及其使用方法。本发明的特征是设置以使用所述耗材来实施所述方法的装置和系统。
【专利说明】核酸的定量、高度多重检测
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年2月17日提交的美国专利申请号13/399,872的优先权，其要 求2011年2月18日提交的美国临时专利申请号61/463,580和2011年11月17日提交的 美国临时专利申请号61/561，198的优先权，各所述专利申请通过引用全文纳入本文以用 于所有目的。
[0003] 联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
[0004] 本发明在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府可享有 本发明的某些权利。 发明领域
[0005] 本发明属于实时DNA扩增、检测和定量领域，以及相关耗材（consumable)、装置和 系统（包括阵列）领域。
[0006] 发明背景
[0007] 实时PCR常规用于对生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述参见，例如Μ Tevfik Dorak(编）（2006) Real-time PCR(Advanced Methods)(《实时 PCR(高级方法）》）， TF 公司（Taylor & Francis)，第一版 ISBN-10 :041537734X ISBN-13 :978-0415377348, 和 Logan 等（编）（2009)Real_Time PCR :Current Technology and Applications(《实 时PCR :新编技术和应用》），Caister学术出版社，第一版ISBN10 :1904455395, ISBN-13 : 978-1904455394。其他细节还可参见例如 Gelfand 等，"Homogeneous Assay System Using The Nuclease Activity ofA Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的 均勻分析系统），'USP5, 210, 015 ;Leone 等，（1995) " Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA(分子信 标探针与NASBA扩增的结合能均匀实时检测RNA) " Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; 以及 Tyagi 和 Kramer(1996) "Molecular beacons ：probes that fluoresce upon hybridization (分子信标：基于杂交的突光探针），^NatureBiotechnologyl4 :303_308。传 统上，用于在单一反应容器（如多孔板的孔）中检测多于一种靶核酸/样品的单孔多重技 术（multiplexing)利用对各扩增子具有特异性的自淬灭PCR探针（诸如TAQMAN?或分子 信标探针的）来实现。在与溶液中的扩增子结合后，或在PCR过程中的探针降解后，所述探 针不淬灭（unquench)，生成可检测信号。所述探针用不同波长的荧光团标记，从而允许单 个"单罐式"反应中至多约5个靶标的多重技术能力。由于实际光谱范围和标记物发射的 限制，很难实现超过约5个探针/反应。这严重限制了单一反应的多重化，进而严重限制了 能被筛选的靶标数量/样品，并提高了检测多种感兴趣靶标的成本和设备复杂性。
[0008] 核酸阵列代表另一种使扩增产物的检测多重化的方法。最常见地，对样品进行扩 增反应，然后在核酸阵列上分别检测扩增子。例如Sorge "Methods for Detection of a Target Nucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二级 结构的探针检测靶核酸的方法）"US6, 350, 580提出了通过从扩增混合物纯化探针并随后 检测该探针来捕获扩增后释放的探针。这种生成和检测扩增子的多步法使对于扩增混合物 的实时分析变得不切实际。
[0009] 也提出了在捕获核酸存在下扩增反应物的多种方法。例如，Kleiber等 "Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids(扩 增和检测核酸的综合方法与系统）"US6, 270, 965提出了通过逐渐消失（evanescence)诱 导的突光来检测扩增子。相似地，Alexandre 等"Identification and Quantification of a Plurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多种（微）生物 体或其成分的鉴定和定量）"US7, 829, 313,提出了在阵列上检测扩增子。在另一个示例 中，通过检测作为扩增结果生成的探针片段来检测靶多核苷酸，所述检测例如通过结合至 电极，然后进行电化学检测。参见，例如Aivazachvilli等，"Detection of Nucleic Acid Amplification(核酸扩增的检测）"US2007/0099211 ;Aivazachvilli 等，"Systems and Methods for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的系统和方法）"US2008/0193940,和 Scaboo 等，"Methods And Systems for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的方法和系 统）"US2008/0241838。
[0010] 所有这些方法均受到限制其用于多重靶核酸检测的实践限制。例如 Kleiber(US6270, 965)依靠逐渐消失（evanescence)诱导的突光以检测阵列表面处的扩增 子的荧光，并且需要复杂和昂贵的镜片和阵列。Alexand re(7,829,313)提出在阵列上检测 扩增子；如Kleiber所述，这显著增加了阵列成本，因为各阵列必需个体化设计以检测各扩 增子。如Alexandre所述，实践中，对于阵列上的不同扩增子可能难以实现相似的杂交动力 学，特别是当扩增子相对较大时。另外，本领域对于如何在其中有同样包含高水平信号背景 的伴随溶液相的阵列上或者在通过原位热循环保持稳定的阵列上检测信号几乎没有提供 引导。
[0011] 本发明克服了本领域中这些问题和其他问题。通过完整阅读以下内容可以更完整 地理解本发明。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了允许高度多重检测感兴趣核酸的方法及相关装置、系统和耗材，例 如用于检测病毒、细菌、痕原虫（Plasmodium)属、真菌或生物样品中的其他病原体。所述耗 材包含信号优化的腔室，所述信号优化的腔室在该腔室内表面具有高效热稳定核酸检测阵 列。所述阵列被设置以检测多至约1〇〇种或更多种不同通用标记的探针。所述方法在感兴 趣核酸部分的扩增过程中产生带标记的通用探针（如"探针片段"），所述扩增反应在腔室 中进行。所述通用探针在少数扩增循环后与阵列杂交，并随后进行选择的扩增循环，允许对 样品中的一种或多种感兴趣核酸进行实时检测和定量。
[0013] 因此，在第一个方面，提供了检测靶核酸的方法。该方法包括提供检测腔室，所述 检测腔室在该腔室的至少一个表面上具有至少一个高效核酸检测阵列。所述高效阵列通常 包含非速率限制数量的捕获核酸，其允许增加对腔室中反应生成的可检测探针片段的捕获 速率，并且所述捕获核酸被设置以捕获相对小的探针核酸，这也增加阵列效率。对于探针与 阵列的结合的检测优选在选择或设置以降低所述阵列附近的背景信号水平（如由未结合 的游离探针所产生）的条件下进行。例如，在某些实施方式中，设置腔室本身以降低阵列附 近的信号背景，例如，通过使腔室成型来降低背景（如通过使阵列附近的腔室相对薄，如所 述腔室通常是阵列之上约500 μ m或更薄）。较薄的腔室也具有较少的热质量，从而相较较 厚的腔室，其温度循环更快且更有效。下文详细讨论了其中设置所述系统和方法以降低背 景号水平的其他方式。
[0014] 将具有待检测靶核酸的一个或多个拷贝的样品加载到该检测腔室中。使扩增引物 和带标记的探针与一种或多种靶核酸拷贝杂交。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增至少一 种或多种靶核酸拷贝的至少一部分。扩增反应导致带标记的探针的切割，这例如归因于扩 增酶的核酸酶活性。这造成带标记的探针片段的释放，其待由所述阵列检测。使带标记的 探针片段与高效阵列杂交（通常在进行少数扩增循环以扩增腔室中释放的探针片段的量 之后）。然后检测由带标记的探针片段和阵列结合生成的标记物信号，从而检测靶核酸。
[0015] 所述检测腔室的确切构造是可以改变的。选择所述构造以降低阵列附近的腔室中 的信号背景。通常，腔室中信号的至少1%，和常常约5%或更多在阵列区域中的阵列处集 中（如约6%、8%或甚至10%或更多）。尽管常希望更低的水平，可使总体信号99%或更 少的背景通过系统标准化。在本文所述的典型实施方式中，通过对阵列附近的腔室构造进 行优化来达到95%或更小的总体背景水平。例如，通过将阵列上方的腔室深度保持至最小 值来实现这种构造优化。在典型实施方式中，所述阵列附近的腔室深度或其他维度上小于 约1mm，更典型地在所述阵列附近的至少一个维度上是约500 μ m或更小，优选约250 μ m或 更小，例如约10 μ m-约200 μ m，并且在一些实施方式中，所述阵列附近的腔室在某一维度 上是约150 μ m。在本文一个实例中，所述阵列之上的所述腔室的深度为约142 μ m。在本文 另一个实例中，所述腔室深度为约l〇〇ym。相应的腔室维度取决于检测系统的信号检测路 径，例如当光通过阵列生成信号，其中一些光从阵列溢出阵列并进入阵列之上的液体中时， 所述相应维度是阵列上腔室的深度。除了降低检测到的背景信号水平以外，减小腔室厚度 也有利于减小背景噪音成分的影响，例如，与阵列点信号的特异性检测无关的检测器响应 和来自反应流体的背景信号。特别地，一个主要的噪音来源是所用检测器的散射噪音，其通 常随着检测到的信号总量的平方根而增加，其进而与反应腔室的厚度成比例。因而，通过减 小反应腔室的厚度，降低背景噪音，并因而增加整体系统的信号-背景噪音之比（SNR)。其 他可能的噪音来源包括对过量的光（如未过滤的激发光、不希望的环境光、散射荧光、系统 组分的自发荧光等）的检测。很多这些噪音来源可以通过传统方法减轻，例如通过使用合 适的光学过滤器（如消除或降低过量激发光）、在检测器处降低或防止环境光的封闭的光 学系统，和通过设置阵列点的大小和位置以降低或消除检测器上的信号交互作用。在特别 优选的方面，本发明测定方法和系统的SNR通常是2. 5或更大，优选大于3、大于4、大于5、 大于10,并且在一些不例中大于20或更大。
[0016] 用于设置本发明系统和方法以降低背景信号的替代或其他方法也可与本发明装 置和方法联用。例如，可以使用全内反射荧光显微镜（"TIRF"）构造来设置本发明装置和系 统以向捕获阵列提供激发光照，其中将激发光导向捕获阵列下面的基材上，从而其完全内 反射（参见 M.Tokunaga 等，Biochem.and Biophys.Res.Comm.235,47(1997)和 P.Ambrose， Cytometry，36, 244 (1999))。尽管如此，在阵列的基材-液体界面生成渐消波，所述渐消波 离开表面后指数衰减，这造成临近该表面（如100nm深度）的有效光照，而没有激发剩余溶 液中的荧光团。
[0017] 在另一个替代性或其他方案中，设置本发明分析方法中使用的反应物以降低相对 于实际探针/阵列结合信号的背景信号。例如，可以通过在捕获阵列探针和带标记的探针 片段上使用协同荧光团（如FRET构建物）来降低背景信号。具体而言，可使具有第一激发 光谱和第一发射光谱的供体荧光团与捕获探针或带标记的探针片段之一偶联。使具有与供 体发射光谱重叠且不同于供体激发光谱的激发光谱的受体荧光团与其他探针偶联。当捕获 探针和带标记的探针片段杂交时，所述供体和受体被带至足够近以供能量转移，生成对应 于受体荧光团发射光谱的不同的荧光信号。通过设置光学系统以仅在供体激发光谱中激 发，并且过滤供体的发射光谱，能选择性检测杂交后由来自受体的能量转移信号生成的信 号。之前已经描述了多种FRET标记物对（参见例如Waggoner的美国专利号6, 008, 373和 Lee 等的 7,449,298)。
[0018] 在一种替代性设置中，采用相互作用的标记基团来进一步减少可能的背景信号。 具体地，在本发明的一个方面，由荧光团标记捕获探针，使得产生信号的标记物连接至阵列 的表面。在该内容中，带标记的探针和带标记的探针片段携带与荧光团互补的猝灭剂基团， 艮P，其能够猝灭捕获探针标记物的荧光团。所述带标记的探针片段的某一位置上具有猝灭 齐IJ，从而当与捕获探针杂交时，其足够靠近捕获探针上的荧光团以猝灭荧光信号。例如，当 所述带标记的探针在其5'端用猝灭剂标记时，捕获探针将在3'处或其他互补位置上荷 带荧光团。在本发明的试验内容中，靶序列的扩增导致产生带标记的探针片段，当其与带标 记的捕获探针杂交时猝灭来自阵列的荧光信号，产生指示靶标信号存在的负信号事件。具 体地，阵列上的捕获探针在未杂交状态下产生信号。靶序列扩增之后，释放荷带猝灭剂的探 针片段以与阵列上的互补捕获探针杂交，淬灭来自其相关荧光团的信号，并导致阵列上比 未杂交的阵列位置颜色深的位置。通过提供在试验检测条件下不产生荧光信号的猝灭剂基 团，消除了任何来自未切割的探针或未结合的带标记探针片段的背景荧光。
[0019] 应理解，本发明中可以使用多种方法来降低相对于从结合的带标记的探针片段检 测到的信号而言的反应溶液中来自未结合的完整带标记探针的信号或背景信号的影响，例 如包括设置反应腔室以集中检测器焦面内的信号，使用在溶液中结合阵列对比未被结合时 具有不同发射光谱的相互反应标记技术，或者在相同完整探针中存在时对比切割的探针片 段中分离时荧光减少的自淬灭探针。
[0020] 如本文所述，阵列通常包含非速率限制数量的捕获核酸，所述捕获核酸与带标记 的探针片段杂交。这意味着所述扩增反应在扩增过程中产生许多探针片段，这导致反应混 合物中探针片段的浓度不使阵列上可用于结合探针片段的位点数量（如可用的互补捕获 核酸）饱和。再次声明，阵列上结合位点的数量保持过量，并且优选过量很多，可在扩增反 应中生成的探针片段浓度饱和。因为阵列上位点的数量是非速率限制性的，因而优化了阵 列上探针片段与溶液中背景探针片段的比例。典型阵列密度是约350fm 〇l/cm2或更大，如 约 2000fmol/cm2 或更大、2500fmol/cm2 或更大、3000fmol/cm2 或更大、4000fmol/cm2 或更 大、4500fmol/cm2或更大，或者5000fmol/cm2或更大。在一些实施方式中，阵列上结合探针 的位点数量是是可能在扩增中产生的探针片段浓度中饱和的位点数量的至少1倍，并且任 选5倍、10倍、50倍或更多。所述比例将随着扩增循环数量和生成的探针量而变化。所述 阵列效率也与待捕获的探针片段长度呈函数关系。尽管所述探针确实需要足够长以在杂交 过程中的给定T m下结合，但较短片段通常显示更有效的杂交。通常待由阵列捕获的探针片 段的长度为约50个核苷酸或更短；所述阵列包含具有对应的互补捕获核酸序列（所述捕 获核酸也可任选地包含其他序列，例如，以隔开表面上的互补位点，例如，以降低表面影响） 的位点。更典型地，所述探针和捕获序列的长度为约40个核苷酸或更短，如长度为约30、约 20或约15个核苷酸或更短。
[0021] 在一些示例中，选择用于给定分析的所述捕获阵列探针和互补性带标记探针片 段，从而提供覆盖阵列的所有成员的窄范围Tm。特别地，为了确保与捕获阵列的最优和稳定 的杂交，给定阵列中的捕获探针将各自具有该阵列各其他成员的约l〇°C内的T m，并且优选 该阵列的各其他探针约7°C、5°C或：TC内的Tm。这样窄的Tm范围使得杂交稳定，并且所得 信号生成涵盖阵列的所有成员。
[0022] 在典型的实施方式中，杂交温度低于扩增反应的温度，所以捕获核酸的探针片段 Tm可低于该探针的分子内Tm(例如，当探针包含淬灭剂以降低背景时），和/或低于靶核酸 探针的^。即，在典型热循环实施方式中，在高于杂交步骤的温度下进行扩增反应；因此，通 常探针对于靶核酸具有高于探针片段对于阵列的T m。带标记的探针通常包含不与靶核酸互 补的第一正交折翼；该折翼从所述带标记探针上切下以产生带标记的探针片段。所述带标 记的探针任选地包含第二正交折翼，例如与淬灭剂部分偶联的第二正交折翼，该第二正交 折翼与第一折翼至少部分互补（例如，以提供第一折翼上标记物的基于邻近的淬灭）。当第 二折翼结合第一折翼的T m高于第一折翼结合阵列的Tm时，背景降低。在这种设置中，延伸 反应在第一温度下发生，即低于靶核酸的完整探针的T m，但是高于完整探针的分子内Tm以 及阵列上捕获探针的探针片段的^。延伸后，随着反应温度降低，其低于探针的分子内T m， 允许形成探针的二级结构，并且造成荧光团的淬灭。进一步冷却到低于探针片段对捕获探 针的Tm，允许探针片段与阵列杂交和对其相关的荧光团的检测。因为所述完整探针已经先 形成了其二级结构，其结合至捕获探针和淬灭的可能较小，因而减少了对完整探针的不希 望的捕获并降低了溶液中完整探针上存在的荧光团的背景信号（或其可能已经结合至捕 获探针阵列）。尽管在某些方面，在本发明的完整探针上使用淬灭剂，在某些实施方式中，令 人惊讶地确定探针上不需要淬灭剂，因为甚至当背景因省略探针的淬灭剂而增加时，优化 的腔室设计和高效阵列能实现对阵列信号和背景的区分。
[0023] 在其他实施方式中，设计或选择高于延伸反应温度（如高10度或更多）的带 标记探针片段及其互补性捕获核酸。因此，当例如在55°C?60°C下进行延伸反应时，带标 记的探针片段和捕获核酸的T m通常是例如71°C。这种示例中，带标记的探针片段与阵列上 捕获核酸的杂交在与延伸反应相同的温度下进行，因而无需进一步降低温度以与阵列杂交 并检测所得信号。结果，可以使用两步温度法而不是三步法。
[0024] 就完整的带标记的探针而言，正交带标记的探针片段相对于结合靶序列探针部分 的方向是可以变化的。特别地，释放的带标记探针片段可以与阵列上的捕获探针杂交，以从 所述探针的靶标特异性部分切割的末端处于捕获探针偶联到阵列表面位点的近端或远端 的方向进行所述杂交。在一些示例中，例如，通过确保任何完整探针仅以一定方向结合至捕 获探针（所述结合方向使探针的靶标特异性部分朝向阵列表面），能够随后利用对该结合 的潜在表面干扰来进一步减少所述阵列对完整探针的不需要的捕获的可能。这种方法在阵 列上固体表面的情况中（例如二氧化硅基材等）特别有用。
[0025] 根据耗材的确切设置，可通过任何不同机制将样品载入腔室。在一个方便的应用 中，通过与腔室可操作连通的至少一个端口或流体通道来加载样品。例如，可在耗材的顶表 面制造端口，所述端口引导进入所述腔室。这使加载简化，例如通过移液管或其他液体递送 装置加载。或者，流体或微流体通道、毛细管等可用于样品递送。
[0026] 所述方法可用于检测样品中感兴趣核酸和/或对核酸定量（例如实时定量）。因 此，一方面，在检测信号前于多个扩增循环中任选地扩增靶核酸，信号检测后额外扩增靶核 酸部分（即在带标记的探针的其它拷贝存在下）。然后，所得的释放的带标记的探针片段与 阵列杂交并且被检测，检测的信号强度与样品中存在的靶核酸的存在和/或量相关联。通 常，所述样品在初始检测前扩增超过1轮循环，以通过增加由扩增释放的探针片段数量来 增加信号水平。例如，在检测来自阵列的信号之前，任选扩增靶核酸至少例如2、3、4、5轮或 更多轮扩增循环。
[0027] 带标记的探针通常包含荧光或发光标记物，尽管也可使用诸如量子点的其他标记 物。在一个优选实施方式中，所述标记物是荧光染料。由探针片段产生的信号通常是光学 信号。带标记的探针任选地包含标记物和标记淬灭剂；带标记的探针的切割造成所述标记 物和淬灭剂的分离，从而不淬灭该标记物。然而，如上述，在本发明的实践中不需要淬灭剂。
[0028] 通常通过检测对应于探针或探针片段上的光学标记物的一种或多种光学信号波 长来检测信号。因为阵列上探针片段的结合位置能用于区分不同探针，所以不需要在不同 探针上采用不同标记物以区分多重扩增反应（在样品中存在超过一种的靶标时，设计以扩 增多种靶核酸的扩增反应）中的探针。然而，可以使用多种探针标记物来增强多重能力。当 使用多种探针时，检测信号可包括检测来自由多种不同标记物（如不同探针上的不同荧光 染料部分）生成的多种信号的多种光学信号波长。
[0029] 虽然以与结合阵列的探针片段相连的标记物基团（例如，带标记的探针片段）的 方式进行一般描述，但应理解可以使用不需要使用预先标记的探针的其他检测方案。例如， 在一些实施方式中，可以使用插入染料。插入染料通常在整合到或插入到双链核酸之后产 生可检测信号事件。在本发明的内容中，经切割的探针片段与阵列上互补性探针的杂交在 阵列表面处产生双链体，该双链体可以纳入插入染料，并且提供指示该杂交的独特信号。插 入染料为本领域熟知，并且包含描述于如Gudnason等，Nucleic Acids Research, (2007)， 第35卷，第19, el27中的那些，其通过引用纳入以用于所有目的。相似地，虽然特别优选 光学信号检测方法，通常也可以使用非光学标记和/或检测方法来进行探针设计和测试方 法，例如使用电化学检测方法，例如ChemFETS、ISFETS等，任选地与电化学标记物基团联 用，例如具有大带电基团以在检测器表面或其附近扩增探针片段与阵列探针杂交的检测。
[0030] 可就阵列的一个或多个区域来检测局部背景，通过针对所述背景进行校正来使信 号强度测量值标准化。通常，所述标准化的信号强度小于总体信号的10%，如总体信号的约 1-约10%。在实施方式的一类示例中，所述标准化的信号强度是总体信号的约4-约7%。 通常，当约1%或更多信号定位于阵列时，例如当约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%或更多信号定位于腔室某一区域的阵列上时，可以区分背景和阵列信号。能够区 分相对于背景的甚至更低水平的信号，但这一般不是优选的。所述方法也可包括通过对阵 列上捕获核酸斑点差异进行校正（如通过校正斑点大小和/或斑点密度）、或对阵列不同区 域的不均匀视野进行校正，来使信号强度标准化。
[0031] 同时检测样品中多种靶核酸的能力代表了本发明的优选方面。样品可以具有一种 或多种靶核酸，而阵列包含能够检测超过一种靶标/样品的多种捕获核酸类型。捕获核酸 类型在阵列上空间分隔，不需要使用多种标记物（虽然，如上所述，可以使用多种标记物）。 在多重方案中，使各自对不同核酸靶标具有特异性的多种扩增探针与样品一起孵育，所述 样品可包含一种或多种靶核酸。例如，可以存在约5-约100种或更多种捕获核酸类型。待 检测的各可能靶标也会采用不同的探针，例如在扩增反应中任选地存在约5-约100种或更 多种带标记的探针类型，其各自对可能的感兴趣靶标具有特异性。阵列包含相应的捕获核 酸，例如，约5-约100种或更多种捕获核酸类型。这允许通过阵列检测和处理相应的大量 信号。例如，在探针片段与阵列杂交后，可以根据阵列上信号位置检测约5-约100种或更 多种不同的信号。应理解，通常在单个反应体积内多重化的不同扩增反应的数量能指示阵 列上捕获探针类型的数量。然而，也能在一些情况中使用具有较大数量不同捕获探针（如 大于100、大于1000、10000种或更多种捕获探针类型）的捕获阵列，例如，当扩增反应被汇 集用于通过阵列的研究时。
[0032] 本发明的优势是，一种捕获阵列设置可以用于多种不同的靶核酸序列组。具体地， 第一组的探针集将包含具有对组中靶标有特异性的第一靶标特异性部分和与捕获阵列上 单一探针互补的第二捕获部分的探针。第二个不同组（部分重叠或完全不同）的探针集将 包含供于该组的靶标特异性部分，而捕获部分将与第一组的探针集相同。再次声明，对任何 靶标组而言，探针集将包含供于该组的探针的半固定部分，其总与捕获阵列的成员互补。所 述探针也将包含就靶核酸特定组选择的可变部分。例如，在分析过程中，使用第一探针集， 其中该第一个集中的各探针具有对应于捕获探针阵列上不同捕获探针的第一固定部分。各 探针也包含与第一组中给定靶序列互补的靶标特异性部分。就第二组而言，使用第二探针 集，其中该集中的各探针包含相同第一固定部分，但具有对组中靶标有特异性的第二靶标 特异部分。
[0033] 参照图1A，带标记探针的部分A对应可变部分，而部分B可以对应将与阵列上探针 互补的固定部分。使用通用的或常见的捕获阵列和捕获探针集允许更有效且以更低成本制 备本发明所用的耗材。
[0034] 因此，在一个样品包含多种靶核酸的实施方式中，所述方法包括将各自对不同靶 核酸具有特异性的多种带标记的探针与靶核酸孵育。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增 至少部分靶核酸导致多种带标记的探针类型的切割，从而导致释放多种带标记的探针片 段类型。多种探针片段类型与阵列杂交。不同的探针片段类型各自分别与空间上分离的 捕获核酸类型杂交。检测标记物信号包括检测来自多个空间上分离的区域的多种标记物 信号，所述多个区域对应于阵列上空间上分离的捕获核酸。任选地，在数个优选实施方式 中，所述带标记探针类型包含相同的标记物部分，但是其他多重化和/或不同对照或对准 (registration)探针的应用可包括使用多种不同的标记物部分。通常，带标记的探针类型 可以包含一种或多种不同的标记物部分，而不同标记物部分的数量小于带标记的探针类型 的数量。
[0035] 用于进行所述方法的装置和系统是本发明的特征。所述装置或系统可包含检测腔 室，所述检测腔室包含在该腔室的至少一个表面上的至少一个高效核酸检测阵列。如关于 所述方法所述，设置该腔室以降低相对于从阵列检测到的信号的背景信号。所述装置或系 统通常包含可操作联接到所述检测腔室的热调节模块，其在装置运行过程中调节腔室内温 度。光学系统检测所述装置运行过程中阵列上产生的信号。
[0036] 任选地对该装置应用关于该方法所述的用以降低背景的所述腔室的所有维度特 性。例如，所述装置在所述阵列附近在至少一个维度上的深度小于约500μπι，例如，在所述 阵列附近的至少一个维度上的深度为约10 μ m-约200 μ m。所述阵列形成的腔室表面能由 任何合适材料组成，例如陶瓷、玻璃、石英或聚合物。在如使用落射荧光的数个实施方式中， 所述表面至少部分透明。
[0037] 如关于该方法所述，装置操作中所述阵列上的捕获核酸通常以非速率限制性的密 度存在。该阵列任选地包含多种捕获核酸类型，例如，定位于空间上不同的阵列区域。例如， 该阵列上可以存在5种或更多种不同捕获核酸类型，如多至约100种或更多种不同类型。任 选地使捕获核酸联接至腔室表面的热稳定涂层，以促进阵列的热循环。示例性涂层可任选 地包括：化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝 基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮 或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的 活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。
[0038] 热调节模块任选地包含促进热循环的结构（feature),例如热电模块、Peltier装 置、冷却风扇、散热器、设置以与所述腔室外表面部分匹配的金属板。通常，该热调节模块具 有反馈控制系统，其可操作地连接到计算机，该计算机控制该模块或是该模块的一部分。
[0039] 所述光学系统可包含落射荧光检测系统或可操作地连接到落射荧光检测系统。典 型的光学系统组件包括下列任何组件：激发光源、弧光灯、汞弧光灯、LED、透镜、光学过滤 器、棱镜、相机、光检测器、CMOS相机、和/或CCD阵列。该装置也可以包含或联接至阵列读 取模块，该模块使阵列上信号位置与待检测的核酸相关联。
[0040] 所述装置或系统可以包含或可操作地偶联至系统指令，例如在计算机或计算机可 读介质中执行的系统指令。该指令可以控制该装置或系统的任何方面，例如将信号强度的 一个或多个测量值与热调节模块进行的许多扩增循环相关联，以确定由该装置检测的靶核 酸的浓度。
[0041] 系统可以包含例如可操作地连接到计算机的装置。该计算机可以包含，例如通过 控制热调剂模块控制热循环和/或指定光学系统何时成像或读图的指令，和/或可将图片 信息转化成随时间变化的信号强度曲线，确定由所述装置分析的靶核酸的浓度的指令等。 该计算机可以包含使信号强度针对背景标准化的指令，例如，用于检测阵列的一个或多个 区域的局部背景，和用于通过校正该背景来使阵列信号强度测量值标准化。相似地，该计算 机可以包含通过对阵列上捕获核酸点样差异、或对阵列不同区域的视野不均进行校正等来 使信号强度标准化的指令。
[0042] 本发明一方面包括核酸检测耗材，例如用于本发明装置和系统的例如以用于实践 本发明的方法的核酸检测耗材。该耗材可以包含，例如深度小于约500 μ m的薄腔室，其中 该腔室包含光学透明的窗，该窗在窗内表面设置有高效捕获核酸阵列。所述耗材还可包含 至少一个试剂递送端口，例如，与所述腔室流控联接的试剂递送端口。通常，该耗材被设置 以允许该腔室内的流体热循环。
[0043] 同样对所述耗材应用关于本发明的装置、系统和方法内容中所述的阵列和腔室的 所有特征（反之亦然）。例如，该核酸阵列可以包含多种不同捕获核酸类型，该类型位于阵 列的不同空间区域上。捕获核酸的密度可以约为，例如2000fmol/cm2或更大、2500fmol/cm2 或更大、3000fmol/cm2 或更大、4000fmol/cm2 或更大、4500fmol/cm2 或更大，或者 5000fmol/ cm2或更大。
[0044] 相似地，所述腔室可以包含第一上表面和透明底表面，所述第一上表面包含试剂 递送端口，所述透明底表面包含窗，例如，其中该顶表面和底表面通过压敏粘合材料形成的 侧壁接合。也可以使用接合该顶表面和底表面以形成腔室的其他结构。例如，顶表面和底 表面可以通过上表面和/或下表面上的衬垫或成形结构接合在一起。该衬垫或结构任选地 融合或附着至上表面和/或下表面的相应区域。在一些实施方式中，所述衬垫或结构引导 紫外线可固化粘合剂的流动，其中粘合剂在上表面和下表面之间流动并且暴露于紫外光， 从而使上表面和下表面接合。在其他实施方式中，上表面和下表面可以通过超声融合在一 起，采用衬垫或结构划定融合区域的界限。在另一个实例中，该结构是上表面或下表面上的 透明区域以及相关上表面或下表面上的对应阴影区域。在这个实施方式中，所述上表面或 下表面可通过引导激光穿过透明区域并到阴影区域上来激光焊接在一起。
[0045] 通常使捕获核酸阵列联接至窗上的热稳定涂层。例如，该涂层可以包含：化学反应 基团、未电基团、NHS醋、四氣苯基醋或五氣苯基醋、单硝基苯基醋或_硝基苯基醋、硫醋、异 氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮或包含乙烯酮或马 来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二 烯、炔烃、叠氮化物或其组合。该窗本身可以包含，例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明 材料。
[0046] 将上文关于所述方法、系统和装置所述的的所有特征应用于所述耗材中腔室设 置。例如，腔室的深度可以是约10 μ m-约200 μ m,例如深度为约140 μ m。该腔室可在其他 尺寸上明显更宽，如平均直径约1mm-约50mm。在一个特定的实施方式中，所述腔室的平均 直径为约l〇mm-约20mm。
[0047] 本发明包括试剂盒，所述试剂盒如包含本发明的耗材。所述试剂盒还可包含包装 材料、实施所述方法的说明书、对照试剂（如结合到耗材阵列的对照位点上的例如对照模 板、探针或引物）。
[0048] 所述方法、系统、装置、耗材和试剂盒也可以组合使用以实施本发明的方法，如所 述试剂盒提供了在本发明系统或装置中使用的耗材。除非另有表述，本发明步骤可选有所 述系统、装置、耗材或试剂盒中相应的结构特性，并且反之亦然。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1A和1B是本发明PCR探针的示意图。
[0050] 图2是本发明PCR腔室的示意图。
[0051] 图3显示了三步扩增反应的拷贝数滴定的基于阵列的实时PCR曲线。
[0052] 图4显示了由溶液等分试样生成的基于溶液的实时PCR曲线。
[0053] 图5显示了用未淬灭探针生成的基于阵列的实时PCR曲线。
[0054] 图6显示了多重扩增的实时PCR曲线。
[0055] 图7显示了无靶标添加的10重反应的基于阵列的实时PCR曲线。
[0056] 图8显示了 10重的组和各自以104个拷贝存在的3种靶标的基于阵列的实时PCR 曲线。
[0057] 图9显示了 5'折翼模拟杂交的实时动力学。
[0058] 图10A和10B显示了本发明的方面的示意图。
[0059] 图11是系统示意图。
[0060] 图12显示了两步扩增反应的拷贝数滴定的基于阵列的实时PCR曲线。
[0061] 图13显示了反应腔室厚度与信号-背景之比的关系。
[0062] 图14显示了本发明的移动基材实施方式的整体检测系统。
[0063] 图15是使用荷带猝灭剂的探针的实时PCR的曲线图，其在反应过程中荧光信号衰 减。
[0064] 发明详述
[0065] 进行靶核酸扩增、检测和实时定量的方法是本发明的特点。在该方法中，靶核酸的 扩增释放与阵列杂交的靶标特异性的带标记探针片段；该阵列在发生扩增的腔室中分布。 从所述阵列检测信号，提供了对靶核酸的检测和实时定量。
[0066] 本发明还提供反应腔室，通常的形式是在腔室中包含核酸检测阵列的耗材，以及 与所述耗材相互作用的装置和系统。
[0067] 方法
[0068] 本发明提供了用于实时检测和定量样品中的一种或多种靶核酸的方法。所述方法 高度适合多重技术，该方法能够用一个腔室反应和检测的特异性检测和定量不同靶核酸， 所述不同靶核酸的数量比采用现有基于溶液的实时核酸检测方法所能实现的数量更大。这 是因为本发明使用基于阵列的分析物检测（阵列与分析物接触），而不是溶液相光谱检测。 相较于例如溶液中不同染料标记物的区分能力而言，通过阵列位置区分的核酸检测阵列分 辨分析物的能力明显更强。通过比较，能够构建同时检测数千种不同分析物的阵列，而通常 在溶液中不可能检测超过约5种带不同标记的荧光团。
[0069] 图10A提供了该方法的部分概况。如图所示，引物102与模板或靶序列100与带 标记的探针104 -起杂交。探针104包含与靶标或模板序列100互补的部分104a，和不与 模板互补的正交序列l〇4b ( "折翼"），其联接至标记物部分106。该正交序列104b或探针 片段在扩增反应（如PCR扩增循环）过程中被切割。在一个方便的方法中，利用聚合酶的 天然核酸酶活性来切割折翼-在这个方法中，通过聚合酶的引物延伸导致折翼l〇4b被该聚 合酶的核酸酶作用切割，因为该酶遇到折翼l〇4b和模板100之间的连接。这释放该折翼为 带标记的探针片段l〇4b，然后，其杂交至荷带与释放的探针片段104b互补的捕获探针112 的阵列110,例如，在将温度调节至允许特异性杂交的条件下进行所述杂交。对阵列上标记 物的检测提供对模板的实时检测和定量。
[0070] 通常，待测试一种或多种靶核酸是否存在的样品经过扩增反应。该反应可易于用 多重形式在单个反应腔室中对约10-约100种或更多种不同核酸进行扩增、检测和定量。例 如，单个扩增/检测腔室中可以检测约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约 90或约100种或更多种核酸。下文显示了在反应/检测腔室中同时扩增、检测和定量10种 不同靶核酸的工作实施例。这个实施例和本方法的容量超过传统光谱限制的、基于溶液的 多重检测的容量。
[0071] 在这个方法中，使用至少一种、一般两种扩增引物来特异性地扩增待检测的各靶 核酸（与单一引物相比，使用两种引物增加反应的特异性，并且加速产物形成的速率）。引 物通常与样品中的靶核酸特异性杂交，并且例如在标准聚合酶链反应（PCR)中使用聚合酶 来延伸。按照已知方法来设计和构建可用于扩增感兴趣的靶核酸的扩增引物。关于PCR 引物设计的细节，参见例如 Anton Yuryev(编者）（2007)PCR Primer Design(Methods in Molecular Biology)《PCR引物设计（分子生物学方法）》[精装书]Humana出版公司；第 1 版，ISBN-10 :158829725X，ISBN-13 :978-1588297259,以及下面引用的参考文献。
[0072] 可以使用合适的反应条件来实施在靶核酸上使用引物的PCR扩增，所述条件包 括使用标准的扩增缓冲液、酶、温度和循环次数。对于PCR技术的概述，包含杂交条件、缓 冲液、试剂、反应循环次数等，参见，例如Yuryev(上述），van Pelt-Verkuil等，（2010) Principles and Technical Aspects of PCR Amplification(《PCR 扩增的原理和技 术方面》）Springer 出版社；第 1 版，ISBN-10 :9048175798, ISBN-13 :978-9048175796 ; Bustin(编）（2009)The PCR Revolution :Basic Technologies and Applications (《PCR 革命：基础技术和应用》），剑桥大学出版社（Cambridge University Press);第1 版，ISBN-10 :0521882311, ISBN-13 :978-0521882316 ;Viljoen 等，（2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook (《分子诊断PCR手册》），施普林格出版社（Springer), ISBN1402034032;Kaufman 等，（2003)Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine (《生物学和医学中分子和细胞方法手册》）第2版，Ceske (编） CRC 出版社（Kaufman) ;The Nucleic Acid Protocols Handbook(《核酸方法手册》）Ralph Rapley (编）（2000)冷泉港实验室出版社，Humana出版社公司（Rapley) ;Chen等（编）PCR Cloning Protocols (《PCR 克隆方案》），第 2 版（Methods in Molecular Biology (分子生 物学方法），第 192 卷）胡马纳出版社（Humana) ;PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (《PCR方案：方法和应用手册》）（Innis等编），加利福尼亚州圣地亚哥市学术 出版社公司（1990) (Innis)。可用于实时PCR方法的扩增条件、引物设计和其他细节描述于 例如 Logan 等（编）（2009)Real-Time PCR:Current Technology and Applications(《实 时PCR :新编技术与应用》），凯斯特学术出版社（Caister)，第1版，ISBN-10 :1904455395, ISBN-13:978-1904455394,和 M Tevfik Dorak(编者）（2006) Real-time PCR (Advanced Methods)(《实时 PCR(高级方法）》）TF 公司（Taylor & Francis),第 1 版，ISBN-10 : 041537734X ISBN-13 :978-0415377348。
[0073] 使对样品中各靶核酸有特异性的带标记的探针和扩增引物一起与靶核酸杂交。所 述扩增反应切割杂交模板的带标记探针以释放带标记探针片段。然后使该带标记片段在反 应腔室中与阵列杂交，如图10A所示。
[0074] 图1A示意性显示用于本发明的方法的探针。该探针包含与靶核酸互补的区域A。 该探针也包含不与靶核酸互补的"折翼" B。使标记物E连接到折翼B。在末端位置显示标 记E，但是实际上该标记物可被安排在沿折翼B的任何位点上。例如，任何不同的核苷酸可 以被标记，并且用于标准或稍微改良的核酸合成方法中以在探针的任何所需位置上提供标 记物。
[0075] 图1A中，包含标记物淬灭剂D的任选区域C与折翼B的部分互补。在合适的溶液 条件下，区域C与折翼B碱基配对，把标记物E引到淬灭剂D附近，由此淬灭标记物E。这 降低了反应/检测腔室中的溶液相的信号背景，但是探针淬灭对于本发明的实践不是必需 的。本发明一个令人惊讶的方面是能够特异性地检测结合到阵列的探针片段，甚至当阵列 附近的溶液中有未淬灭的探针时。本文描述了这个实施方式的一个工作实施例。通常，反应 /检测腔室中使用设置以降低溶液相背景的高效阵列允许在本发明的方法、耗材、装置和系 统的溶液中区分阵列处信号和信号背景。
[0076] 根据实验设置，可采用多种不同标记物基团来标记带标记的探针。如上所述，这 种标记物通常包含荧光标记基团，所述荧光标记基团可以包含单个荧光团或相互作用的染 料对或组，如FRET对，以及供体/淬灭剂对。适于标记核酸探针的不同突光标记基团的范 围描述于，例如Molecular Probes Handbook(《分子探针手册》），第11版（生命技术公司 (Life Technologies, Inc. ))〇
[0077] 尽管本文的很多讨论是关于基于PCR的扩增，但可用其他扩增反应来替代。例 如，可使用包含与扩增反应结合的切割反应的多酶系统，例如包含易切断的键的切割的那 些（参见，例如 US5, 011，769 ;US5, 660, 988 ;US5, 403, 711 ;US6, 251，600)和叉状核酸结构 (US7, 361，467 ;US5, 422, 253 ;US7, 122, 364 ;US6, 692, 917)的那些。也可以使用与 TaqMan 样切割结合的解旋酶依赖性扩增（Tong，Y等，2008BioTechniques45 :543-557)。可以使 用基于核酸序列的扩增（NASBA)或连接酶链式反应（LCR)。在NASBA方法中，探针可以和 扩增引物一起与模板杂交，如PCR中的那样。探针可以通过逆转录酶或加入的内切核酸 酶的核酸酶作用切割，以与由PCR中聚合酶释放相似的方式释放探针片段。NASBA的一个 潜在优势是不需要热循环。这简化了整体装置和系统的要求。对NASBA的描述参见，例 如，Compton(1991) " Nucleic acid sequence-based amplification(基于核酸序列的 扩增）"Nature350(6313):91-2。对于使用NASBA来检测例如致病性核酸，参见，例如 Keightley 等（2005) "Real-time NASBA detection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reverse transcription-PCR(实时 NASBA 检测 SARS 相 关的冠状病毒及与实时逆转录PCR的比较）"，Journal of Medical Virology77(4) :602-8。 当使用LCR型反应时，可以使用内切核酸酶切割探针，而不是依赖于扩增酶的核酸酶活性。
[0078] 本文所述的方法中，提供了一种检测腔室，所述检测腔室在其至少一个内表面上 有至少一个高效核酸检测阵列。该高效阵列通常具有非速率限制数量的捕获核酸，其允许 有效捕获通过腔室中的扩增反应产生的探针片段。所述捕获核酸被设置以捕获相对小的探 针核酸，这也增加了阵列效率。该腔室被设置以降低该阵列附近的信号背景，如通过使所述 腔室成形以降低背景。例如，通过使所述阵列（如上方或下方）处的腔室薄（浅）来降低 背景；例如，通常在阵列上方或下方的所述腔室为约500 μ m或更薄，尽管在深至1_或更深 的腔室中也能进行检测。参照该方法中使用的耗材，下面描述了关于反应腔室和阵列的其 他细节。
[0079] 检测由阵列捕获的信号并测量信号强度。信号强度与样品中靶核酸的存在和/或 量相关联。通常，样品在初始检测之前扩增超过1轮循环，以通过增加由扩增释放的探针片 段的数量来增加信号水平。例如，从阵列检测信号之前，可任选地将靶核酸扩增至少，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10轮或更多轮扩增循环。
[0080] 图10B提供了本发明试验的替代性设置。如图所示，同样提供了具有正交折翼部 分104b的靶标特异性探针，如上述图10A所示。然而，与图10A中用荧光标记部分106标 记产生荧光信号不同，折翼l〇4b含有猝灭剂基团116。相反，用相应的荧光基团114标记阵 列110上的捕获探针112,即该荧光基团由折翼104b上的猝灭剂基团116猝灭。当折翼部 分104b在靶序列100的扩增后从全长探针104上切割并释放时，折翼能够与捕获探针112 杂交并且猝灭来自其相关的荧光团114的信号。结果，感兴趣的靶序列的存在导致该序列 的扩增并且从探针104上切割下猝灭剂-折翼104b，其继而能够与阵列110上的捕获探针 112杂交，导致位于阵列上的给定捕获探针的荧光信号降低或缺失。通过将猝灭剂和荧光团 分别定位于折翼或探针片段和捕获探针的互补部分，可以确保这些基团足够靠近来传输能 量并猝灭。
[0081] 可以联接至折翼和捕获探针的荧光团-猝灭基团对为本领域熟知，例如，诸如黑 洞粹灭剂 2/Cy3 和 Iowa Black RQ/Cy3。
[0082] 应理解，之前的猝灭剂探针试验设置消除了液体荷带的荧光组分以及因而可能从 液体中产生的任何背景荧光信号。相反，信号事件是归因于表面结合的荧光团的猝灭的荧 光信号缺失。
[0083] 在一个典型的实施方式中，扩增反应期间，以选定的时间、温度和扩增循环间隔从 阵列捕获荧光或其他光学图像。分析这些图像以确定靶核酸是否在样品中存在，并且提供 对样品中起始靶核酸浓度的定量。结合使用平均灰度强度测量值、背景校正和基线调整来 分析图像。可以对阵列中的各斑点局部测量背景。通过测量感兴趣阵列区域（例如，阵列 点）周围溶液的同心环的图像强度来计算背景。然后校正各个区域的信号以计算该区域的 局部背景。还可以使来自各区域的经校正的信号进一步标准化以计算视野中的斑点以及不 均匀光照的变化。从前几轮循环（通常5-15轮循环）中获得的经校正强度测量值的平均 值用于调整基线并对来自各区域的测量值标准化。
[0084] 关于基于扩增后信号强度测量值定量核酸方法的其他细节可以在上文所述的 参考文献和如下文献中找到：Jang B. Rampal (编者）（2010)Microarrays(微阵列）：第 2 卷，Applications and Data Analysis(应用和数据分析）（Methods in Molecular Biology (分子生物学方法））胡马纳出版社；第2版，ISBN-10 :1617378526, ISBN-13 : 978-1617378522 ;Stephen A.Bustin(编者）（2004)A-Z of Quantitative PCR(定量 PCR 大全）（IUL Biotechnology (IUL 生物技术），第 5 卷）（IUL 生物技术系列）International University Line ;第 1 版，ISBN-10 :0963681788, ISBN-13 :978-0963681782 ;和 Kamberova 和 Shah(2002)DNA Array Image Analysis :Nuts & Bolts (DNA 阵列图像分析：基本要 点）（Nuts & Bolts series (基本要点系列））DNA 出版社；第 2 版，ISBN-10 :0966402758, ISBN-13 :978-0966402759〇
[0085] 在其他设置中，可任选地使捕获探针联接到移动基材（例如珠、树脂、颗粒等（一 般与本文中的"珠"互换使用）），而不是静态基材。例如，如本文其它地方所述，可以使用 平面基材来提供阵列的捕获探针，其与样品材料中的一个或多个靶核酸序列的扩增中产生 的经切割的探针片段杂交。通过检测阵列上哪个捕获探针位点与探针片段杂交来检测给定 靶核酸序列的存在。因为各探针片段对特定靶序列具有特异性，如果该探针片段存在，其指 示靶标存在并且被扩增。在移动相基材中，使给定分析中的各不同类型的捕获探针偶联到 同样含有唯一标记物的不同移动基材上。然后使所述移动基材通过检测通道以鉴定珠并隐 含地鉴定捕获探针，以及该带标记的探针片段是否存在。如果在对应特定捕获探针的给定 珠上检测到带标记的探针，则指示了与探针片段（和互补捕获探针）相关联的靶序列在样 品中存在并且被扩增。本发明的这个方面可以在如完成整体扩增反应之后的终点检测中使 用，但是也可以在定量分析中使用，例如，一轮或多轮扩增循环后用虹吸管从扩增混合物中 吸出珠部分，并从珠上测量带标记的探针片段信号强度。
[0086] 给定珠上捕获的带标记的探针片段的浓度提供了检测通道中足够高的信号-背 景比，从而不需要将珠与反应混合物分开。另外，有基于阵列的基材时，在完整探针和/或 任选的淬灭剂基团中纳入二级结构使得不论是在溶液中还是无意结合到移动基材上均更 能区别探针片段和完整探针背景信号。在一些示例中，也期望完整探针二级结构的特性在 移动基材上结合捕获探针时生成位阻，造成一些情况中完整探针结合珠的可能性降低。 [0087] 多种不同珠类型可以与本发明这个方面联用。例如，可以使用聚苯乙烯、纤维素、 丙烯酸、乙烯、二氧化硅、顺磁或其他无机颗粒、或任意各种其他类型的珠。如所述，珠通常 用独特标记特征分别标记。再者，可以使用多种不同标记物类型，包含有机荧光标记物、无 机突光标记物（如量子点）、发光标记物、电化学标记物等。大量的这种标记物市售可得，并 且设置以易于偶联到合适的活性珠上。在荧光标记基团的情况中，可以通过2、3、4种或更 多种不同空间荧光标记基团和不同水平的各种标记物的不同组合来提供大量的标记物信 号，从而提供不使用宽的激发辐射光谱就能提供宽范围的独特标记物信号，如多重激光。 [0088] 所述方法通常使用本文所述的装置、系统、耗材和试剂盒来进行。能提供所述装 置、系统和耗材的所有特征以实践本文所述方法，并且本文所述方法可与所述装置、系统、 耗材和试剂盒联用。
[0089] 耗材
[0090] 设置本发明的单罐式反应腔室以降低信号背景。在该腔室的至少一个内表面上形 成高效阵列。在该方法的扩增和阵列杂交步骤过程中，阵列通常与扩增反应物和产物接触。 这允许用户进行一轮或多轮扩增反应循环，通过实时监测来自阵列的信号来检测结果，然 后另进行一轮或多轮扩增反应，再检测。因此，阵列的信号强度可以用于实时检测和定量感 兴趣核酸。
[0091] 本发明的耗材包含腔室和该腔室内表面上的高效阵列。该腔室通常较薄（浅），如 深度小于约1_。通常，腔室越薄，阵列上的溶液越少，这降低了来自溶液中带标记的探针或 探针片段的信号背景。通常所需腔室深度的范围是约1 μ m-约500 μ m。就耗材制造的容易 性而言，该腔室在阵列之上的深度范围通常是约10 μ m-约250 μ m,例如,深度约100 μ m-约 150 μ m。该腔室可以包含具有试剂递送端口的表面，例如用于通过手工或自动移液器递送 样品。
[0092] 图2提供了示例性耗材的放大（blow-up)示意图。在这个实施例中，底表面层1 和上表面层2通过中间层3接合。在组装层1、2和3后切口 4形成腔室。端口 5形成便利 通道以将缓冲液和试剂递送到组装成的腔室中。可以切口顶表面或底表面形成的区域的顶 层或底层上形成高效阵列。在一个方便的实施方式中，当采用落射荧光检测来检测结合到 阵列的标记物时，在下表面上制造阵列，设置耗材以通过定位于下表面下的本发明装置和 系统的检测光学器来观察。通常，顶表面和/或底表面会包含窗口，检测光学器可以通过该 窗口观察到阵列。
[0093] 中层3可以根据待使用的耗材组装方法采用任何不同形式。在一个方便的实 施方式中，顶表面和底表面1和2通过压敏粘合材料形成的层3来结合。压敏的粘合层 (例如，带）是熟知的并且广泛可用。参见，例如，Benedek和Feldstein(编者）（2008) Handbook of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (《压敏粘合剂和产品手 册》）：卷 1 :Fundamentals of Pressure Sensitivity (压敏的基本原理），卷2 :Technology of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (压敏粘合剂和产品技术），卷3: Applications of Pressure-Sensitive Products (压敏产品的应用），CRC 出版社；第1 版， ISBN-10 :1420059343, ISBN-13 :978-1420059342。
[0094] 也可以使用用于接合顶表面和底表面以形成腔室的其他制造方法。例如，顶表面 和底表面可以通过顶表面和/或下表面上的衬垫或成形结构接合在一起。所述衬垫或结 构任选地融合或附着到上表面和/或下表面的相应区域。硅和聚合物芯片制造方法可用 于形成顶表面或底表面的结构。对结构制造（包含微结构制造）方法的介绍，参见，例如 Franssila(2〇10) Introduction to Microfabrication(《微制造介绍》），Wiley 出版社；第 2 版，ISBN-10 :0470749830, ISBN-13 :978-0470749838 ;Shen 和 Lin(2009) "Analysis of mold insert fabrication for the processing of microfluidic chip (〈〈用于微流体芯 片处理的模塑插入制造的分析》）"，聚合物工程和科学出版社，塑料工程协会公司（Polymer Engineering and Science Publisher ：Society of Plastics Engineers, Inc.),卷 49, 第 1 期，第 104(11)页；Abgrall(2009)Nanofiuidics(《纳米流体》）ISBN-10 :159693350X, ISBN-13 :978-1596933507 ；Kaajakari(2009)Practical MEMS ：Design of microsystems, accelerometers, gyroscopes, RF MEMS, optical MEMS, and microfluidic systems(《实 践MEMS :设计微系统、加速度计、陀螺仪、RF MEMS、光学MEMS和微流体系统》），小齿轮 出版社（Small Gear Publishing)，ISBN-10:0982299109, ISBN-13 :978-0982299104 ; Saliterman(2006)Fundamentals of BioMEMS and Medical Microdevices(《BioMEMS 和医 学微型装置的基本原理》），SPIE 出版社，ISBN-10 :0819459771, ISBN-13 :978-0819459770 ; Madou (2002)Fundamentals of Microfabrication ：The Science of Miniaturization(《微 制造的基本原理：小型化的科学》），第2版，CRC出版社；ISBN-10 :0849308267, ISBN-13 : 978-0849308260。这些制造方法可用于基本形成顶表面或底表面所需的任何结构，消除了 对中间层的需要。例如，在所述顶表面和/或底表面形成下陷，并将这两个层接合，由此形 成腔室。
[0095] 在一些实施方式中，所述衬垫或结构引导紫外线或辐射可固化的粘合剂的流动。 这种粘合剂在上表面和下表面之间流动，并且接受紫外光或辐射（如电子束或"EB"福射）， 从而使上表面和下表面彼此接合。可用的粘合剂（包含UV和可辐射固化的粘合剂）的 描述，参见，例如 Ebnesajjad(2010)Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology,Applications and Manufacturing(《粘合剂和表面制备手册：技术、应用和生 产》），威廉姆斯安德鲁出版社（William Andrew);第 1 版，ISBN-10 :1437744613, ISBN-13 : 978-1437744613 ;Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers (《聚合物的福射技 术》），第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10 :1420094041, ISBN-13 :978-1420094046。
[0096] 在其他实施方式中，所述上表面和下表面可通过超声融合在一起，而衬垫或表面 结构划定耗材中融合的区域和待产生的腔室或其他构造结构。用于融合材料的超声焊接和 相关技术在如下文献中有描述，例如Astashev和Babitsky(2010)，Ultrasonic Processes and Machines ：Dynamics, Control and Applications(Foundations of Engineering Mechanics)(《超声处理和机械：动力学、控制和应用（工程机械的基础）》），Springer出版 社；第 1 版，ISBN-10 :3642091245, ISBN-13 :978-3642091247 ;和 Leaversuch (2002) "How to use those fancy ultrasonic welding controls (怎样使用那些奇特的超声焊接控 制），'Plastics Technology48 (10) :70_76。
[0097] 在另一个实例中，所述结构是上表面或下表面上的透明区域，和相应的上表面或 下表面上的对应阴影区域。在这个实施方式中，上表面或下表面可通过引导激光通过透 明区域并且到阴影区域上由激光焊接在一起。激光焊接方法在如下文献中有描述：例如 Steen 等，（2010) Laser Material Processing (《激光材料处理》）Springer 出版社；第 4 版， ISBN-10 :1849960615, ISBN-13 :978-1849960618 ;Kannatey-Asibu(2009)Principles of Laser Materials Processing(Wiley Series on Processing of Engineering Materials) (《激光材料处理原理（Wiley工程材料处理系列）》），Wiley出版社，ISBN-10 :0470177985, ISBN-13 :978-0470177983 ;和 Duley (1998) Laser Welding (《激光焊接》）韦利科学公司， ISBN-10 :0471246794, ISBN-13 :978-0471246794。
[0098] 通常使捕获核酸阵列偶联到窗上的热稳定涂层上。窗本身可以包含，例如玻璃、 石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。可购得适用于涂覆该窗的多种涂层。通常，基于以下 因素选择涂层：与阵列基材的相容性（例如，阵列连接的腔室表面是玻璃还是聚合物），衍 生或处理以包含适于连接阵列成员的活性基团的能力和与处理条件的相容性（例如，热 稳定性、光稳定性等）。例如，该涂层可以包含：化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯 基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠 氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化 物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组 合。对表面涂层和其用于生物分子和表面连接的描述，参见，例如，Plackett (编者）（2011) Biopolymers :New Materials for Sustainable Films and Coatings(《生物聚合物：可持 续膜和涂层的新材料》），Wiley 出版社，ISBN-10 :0470683414, ISBN-13 :978-0470683415 ; Niemeyer (编者）（2010)，Bioconjugation Protocols :Strategies and Methods (Methods in Molecular Biology)(《生物偶联方案：策略和方法（分子生物学方法）》），Humana出 版社；第 1 版，ISBN-10 :1617373540, ISBN-13 :978-1617373541 ;Lahann(编者）（2009)， Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science (《生物技术和材料 科学的点击化学》），Wiley 出版社，ISBN-10 :0470699701, ISBN-13 :978-0470699706 ; Hermanson (2008)，Bioconjugate Techniques (《生物偶联技术》），第2版，学术出版社； 第 2 版，ISBN-10 :0123705010, ISBN-13 :978-0123705013 ;Wuts 和 Greene (2006) Greene ' s Protective Groups in Organic Synthesis (《有机合成中的保护基团》），韦利科学公 司（Wiley-Interscience);第 4 版，ISBN-10 :0471697540, #ISBN-13 :978-0471697541 ; Wittmann (编者）（2006), Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(《芯片上DNA的固定II (现代化学专题）》），Springer出版社，第1版， ISBN-10 :3540284362, ISBN-13 :978-3540284369 ；Licari (2003), Coating Materials for Electronic Applications ：Polymers,Processing,Reliability,Testing(Materials and Processes for Electronic Applications)(《电子应用的涂层材料：聚合物、处理、可靠 性、测试（电子应用的材料和处理）》），威廉姆斯安德鲁出版社，ISBN-10 :0815514921, ISBN-13 :978-0815514923 ；Conk(2002), Fabrication Techniques for Micro-Optical Device Arrays Storming Media(微型光学阵列基质的制造技术），ISBN-10 :1423509641, ISBN-13 :978-1423509646,以及石油和颜色化学协会（Oil and Colour Chemists' Association) (1993), Surface Coatings-Raw materials and their usage (《表面涂 层-原材料及其应用》），第3版，Springer出版社；第3版，ISBN-10 :0412552108, ISBN-13 : 978-0412552106。
[0099] 制造核酸阵列的方法是现有的并且能通过在内腔室表面上形成阵列来适用于本 发明。可以用于在内腔室表面形成阵列的核酸微阵列形成技术描述于，例如，Rampal(编 者),Microarrays ：Volume I ：Synthesis Methods(Methods in Molecular Biology) (《微阵列》：卷I:合成方法（分子生物学方法）），胡马纳出版社；第2版，ISBN-10: 1617376639, ISBN-13 :978-1617376634 ;MUller 和 Nicolau(编者）（2010)，Microarray Technology and Its Applications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(《微阵列技术及其应用（生物和医学物理、生物医学工程）》），施普林格 出版社；第 1 版，ISBN-10 :3642061826, ISBN-13 :978-3642061820 ;Xing 和 Cheng (编者） (2010)Biochips ：Technology and Applications(Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(《生物芯片：技术和应用（生物和医学物理、生物医学工 程）》），施普林格出版社；第 1 版，ISBN-10 :3642055850, ISBN-13 :978-3642055850 ; Dill 等（编）（2010)Microarrays :Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications(Integrated Analytical Systems)(《微阵列：制备、微 流体、检测方法和生物应用（集成分析系统）》），施普林格出版社，ISBN-10 :1441924906, ISBN-13 :978-1441924902 ；Whittmann(2010)Immobilisation of DNA on Chips II(Topics in Current Chemistry)(《芯片II上DNA的固定（现代化学专题）》），Springer出版 社；第 1 版，ISBN-10 :3642066666, ISBN-13 :978-3642066665 ;Rampal (2010)，DNA Arrays : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (《DNA 阵列：方法和方案（分子 生物学方法）》），胡马纳出版社；第 1 版，ISBN-10 :1617372048, ISBN-13 :978-1617372049 ; Schena (作者，编者）（2007)，DNA Microarrays (Methods Express)(《DNA 微阵列（方 法表达）》），Scion 出版社；第 1 版，ISBN-10 :1904842151, ISBN-13 :978-1904842156 ; Appasani (编者）（2007)，Bioarrays :From Basics to Diagnostics (《生物阵列：从基础到 诊断》），胡马纳出版社；第 1版，ISBN-10 :1588294765，ISBN-13 :978-1588294760 ;和 Ulrike Nuber (编者）（2007)，DNA Microarrays (Advanced Methods)(《DNA 微阵列（高级方法）》） TF 公司（Taylor & Francis)，ISBN-10 :0415358663, ISBN-13 :978-0415358668。把 DNA 连 接到表面以形成阵列的技术可包含任何不同斑点法、使用化学反应表面或涂层、光导向的 合成、DNA印刷技术，和很多本领域可用的其他方法。
[0100] 定量阵列密度的方法在上面引用的参考文献以及Gong等 (2006) "Multi-technique Comparisons of Immobilized and Hybridized Oligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray SI ides (商业胺反应性微阵列载玻片上固定和杂交寡核苷酸表面密度的多技术比 较）"Anal. Chem. 78 :2342-2351 中描述。
[0101] 耗材可以在容器中包装，或包装材料以形成试剂盒。该试剂盒也可以包含可用于 使用该耗材的组分，例如，对照试剂（例如，对照模板、对照探针、对照引物等）、缓冲液等。
[0102] 装置和系统
[0103] 使用耗材和/或实践本发明的方法的装置和系统也是本发明的特点。装置或系 统可以包含耗材的特征，例如，反应腔室和阵列（以耗材形式或者装置的专用部件）。最典 型地，该装置通常具有接收器，例如安置上述耗材的平台，以及用于监测阵列的检测光学器 件，用于热循环腔室的模块，和具有控制热循环、检测和信号后处理的系统指令的计算机。
[0104] 示例性系统的示意图示于图11。如图所示，耗材10安置在平台20上。环境控制 模块（ECM) 30 (例如，包括Peltier装置，冷却风扇等）提供环境控制（例如，温度的热循 环）。由光源40 (如灯、电弧灯、LED、激光等）提供照明光。光学系统50将光从光源40导 向耗材10。由光学系统监测来自耗材10的信号，并且将信号信息传递给计算机60。计算 机60也任选地控制ECM30。可以由计算机60来处理信号信息，并且输出至用户可观察的显 示器70和/或打印机。可将ECM30安置在耗材10的上方或下方，并且可以包含其他观察 光学器件80 (位于平台20的上方或下方）。
[0105] 设置平台/接收器以安置用于热循环和分析的耗材。该平台可以包含与耗材的相 应特性件匹配的对准（registration)和对齐结构，例如对齐臂、扳手、孔、栓等。该平台可 包含接收和定向耗材的盒，将其以与其他装置元件可操作连接的方式放置，尽管这在很多 实施方式中不是必需的，例如将耗材直接安置在平台上的情况中。设置装置元件以操作耗 材，并且装置元件可包含用于向耗材递送缓冲液和试剂的流体递送系统、热循环或其他温 度控制或环境控制模块、检测光学器件等。在所述腔室制于装置内而不是整合到耗材中的 实施方式中，通常设置装置元件以在腔室上或腔室附近处操作。
[0106] 可以通过该装置或系统来对耗材进行流体递送，或可以在将耗材加载到该装置或 系统中之前来进行所述流体递送。流体处理元件可被整合到该装置或系统上，或可以配置 成与该装置或系统分开的单独处理器。流体处理元件可以包含将试剂或缓冲液（手工或自 动化）递送到耗材中端口的移液器，或可以包含毛细管、微制造的装置通道等。可用于加载 所述耗材的手工和自动化移液器和移液器系统可从各种来源购得，所述来源包括赛默科技 公司（Thermo Scientific)(美国）、Eppendorf 公司（德国）、Labtronics 公司（加拿大） 等。一般来说，可购得各种流体处理系统，并且可将其整合到本发明的装置和系统中。参见， 例如，Kirby (2010)Micro-and Nanoscale Fluid Mechanics transport in Microfiuidic Devices(《微米级和纳米级流体力学：微流体装置中的运输》），ISBN-10 :0521119030, ISBN-13 :978-0521119030 ；Bruus (2007)Theoretical Microfluidics(Oxford Master Series in Physics)(《理论微流体》（牛津物理大师丛书），美国牛津大学出版社，ISBN-10 : 0199235090, ISBN-13 :978-0199235094 ；Nguyen(2006)Fundamentals And Applications ofMicrofluidics (《微流体的基础和应用》），第2版，（Integrated Microsystems (整合的微 系统）），ISBN-10:1580539726, ISBN-13 :978-1580539722 ;Wells(2003)High Throughput Bioanalytical Sample Preparation :Methods and Automation Strategies(Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis)(《高通量生物分析样品制备：方法和 自动策略（药学和生物医药分析中的进展）》），埃尔斯威尔科学公司；第1版，ISBN-10 : 044451029X，ISBN-13 :978-0444510297。耗材任选地包含设置以与递送系统匹配的端口，例 如，用于通过移液器或毛细管递送装置进行加载的合适尺寸的端口。
[0107] ECM或热调节模块可以包含促进热循环的结构，诸如热电模块、Peltier装置、冷 却风扇、散热器、设置以与所述腔室的外表面部分匹配的金属板、流体浴等。很多这种热调 节组件可用于整合到本发明的装置和系统中。参见例如Kennedy和Oswald(编者）（2011) PCR Troubleshooting and Optimization :The Essential Guide(《PCR 解决问题和优 化：基本手册》），凯斯特学术出版社，ISBN-10 :1904455727 ;ISBN-13 :978-1904455721 ; Bustin(2009)The PCR Revolution :Basic Technologies and Applications (《PCR 革命：基本技术和引用》），剑桥大学出版社；第1版，ISBN-10 :0521882311, ISBN-13 : 978_〇52l8823l6;Wittwer 等（编者）（2〇〇4)Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications(《快速循环实时PCR方法和应用》），施普林格出版社；第1版， ISBN-10 :3540206299, ISBN-13 :978-3540206293 ；Goldsmid(2009)Introduction to Thermoelectricity(Springer Series in Materials Science)(〈〈热电性介绍 (Springer材料科学系列）》），施普林格出版社；第1版，ISBN-10 :3642007155, ISBN-13 : 978-3642007156 ;Rowe(编者）（2005)Thermoelectrics Handbook :Macro to Nano(《热电手 册：宏观到纳米》），CRC 出版社；第 1 版，ISBN-10 :0849322642, ISBN-13 :978-0849322648。 热调节模块例如可以被制成接收耗材的盒的形式，或可以被安置在与耗材可操作附近处的 平台上。
[0108] 通常，ECM或热调节模块具有反馈控制系统，该系统可操作地连接到计算机，该 计算机控制该模块或是该模块的一部分。计算机指导的反馈控制是仪器控制的现有方 法。参见，例如，Tooley(2005)PC Based Instrumentation and Control(《基于 PC 的 仪器和控制》），第 3 版，ISBN-10 :0750647167, ISBN-13 :978-0750647168 ;Dix 等（2003) Human-Computer Interaction(《人-计算机互动》）（第3版），普伦蒂斯?霍尔出版社 (Prentice Hall)，第 3 版，ISBN-10:0130461091，ISBN-13:978-0130461094。通常，通过 计算机实施系统控制，计算机可以使用例如作为输入的脚本文件以生成目标温度和循环时 程，以及指定何时检测光学器件观察/拍摄图像。图像通常在反应过程中的不同时间点拍 摄，并且通过计算机分析以生成强度与时间关系的曲线，由此得到靶标的浓度。
[0109] 所述光学系统可以包含任何典型光学系统组件，或可以可操作地连接至此类 组件。该光学系统将光导向耗材，例如，集中到耗材阵列或阵列区域上。该光学系统还 可以检测从阵列发射的光（例如，荧光或发光信号）。可任选的现有光学组分的描述 参见，例如，Kasap 等（2009)Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics(《剑桥光电子和光子图不手册》），剑桥大学出版社；第1版，ISBN-10 : 0521815967, ISBN-13 :978-0521815963 ;Bass 等（2009) Handbook ofOptics (《光学手册》）， 第 3 版，卷 I :Geometrical and Physical Optics, Polarized Light, Components and Instruments (set)(几何和物理光学，偏振光、组分和仪器（组）），MHP公司（McGraw-Hill Professional);第 3 版，ISBN-10 :0071498893, ISBN-13 :978-0071498890 ;Bass 等 (2009) Handbook of Optics (《光学手册》），第 3 版，卷 II :Design，Fabrication and Testing, Sources and Detectors, Radiometry and Photometry(设计、制造和测试，来 源和检测，辐射度学和光度测定法），MHP公司；第3版，ISBN-10 :0071498907, ISBN-13 : 978-0071498906 ;Bass 等（2009) Handbook ofOptics (《光学手册》），第 3 版，卷 III : Vision and Vision Optics (视觉和视觉光学），MHP 公司，ISBN-10:0071498915，ISBN-13: 978-0071498913 ;Bass 等（2009) Handbook of Optics (《光学手册》），第 3 版，卷 IV : Optical Properties of Materials, Nonlinear Optics, Quantum Optics(光学属性材 料，非线性光学、量子光学），McGraw-Hill Professional，第 3 版，ISBN-10 :0071498923, ISBN-13 :978-0071498920 ;Bass 等（2009)Handbook ofOptics(《光学手册》），第 3 版，卷 V ：Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray and Neutron Optics (大气光 学、调节剂、光纤、X-射线和中子光学），MHP公司；第3版，ISBN-10 :0071633138, ISBN-13 : 978-0071633130 ;以及 Gupta 和 Ballato (2006) The Handbook ofPhotonics (《光子手册》）， 第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10 :0849330955, ISBN-13 :978-0849330957。典型的光 学系统组件包含任何下列组件：激发光源、弧光灯、萊弧光灯、LED、透镜、光学过滤器、棱镜、 相机、光检测器、CMOS相机和/或CCD阵列。在一个理想的实施方式中，使用落射突光检测 系统。该装置也可以包含或联接至阵列读取模块上，该模块使阵列中信号的位置与待检测 的核酸相关联。
[0110] 在本发明的移动基材实施方式的内容中，在某些方面，所述反应容器可以直接联 接到检测通道，例如，在整合的微流体通道系统内，或通过扩增混合物和检测通道之间的合 适流体界面。或者，可以在检测通道上提供例如传统流式细胞仪中存在的流体界面，以从扩 增反应混合物中取样。该检测通道通常设置以在给定时间基本上仅允许单个珠穿过通道的 尺寸。该检测通道通常包含检测窗，该检测窗允许对珠的激发，并且收集从珠发出的荧光信 号。在很多示例中，采用融合的二氧化硅或玻璃毛细管或其他透明微流体通道作为检测通 道。
[0111] 本发明的光学检测系统通常包含能够递送一种或多种激发波长的激发光的一种 或多种激发光源。也包含了设置为收集从检测通道发出的光并且过滤来自荧光信号的激发 光的光学系统。所述光学系统也通常包含其他分离元件，用于传送荧光信号，以及用于将从 珠发出的荧光信号成分与从捕获的探针片段发出的信号成分分开。
[0112] 图14提供了整体检测系统1400的示意图。如图所示，该系统包含第一和第二激 发光源，诸如激光1402和1404,其各自提供不同波长的激发光。或者，可以使用单个宽光谱 光源或多个窄光谱光源以在一个或多个合适波长范围内递送激发光以激发样品中的可检 测标记物，例如，与珠相关联的那些和与带标记的探针片段相关联的那些。
[0113] 实线箭头指示来自各激光的激发光束被导向检测通道1408,例如，通过使用定向 光学器件（如分色镜1406)进行所述导向。通过收集光学器件例如物镜1412收集检测通道 1408中的珠1410发出的光。然后使收集的光通过滤镜1414,该滤镜被设置以使虚线箭头 所示的发出的荧光通过，但排除收集的激发辐射。收集的荧光包括由第一发射光谱处的捕 获的探针片段上的标记物发出的荧光，以及取决于珠中使用的标记物的数量的由一种或多 种不同发射光谱处的珠标记物信号发出的荧光信号。然后使收集的荧光通过分色镜1416， 该分色镜将来自捕获的探针片段的荧光反射到第一检测器1420。然后，使来自珠的剩余荧 光信号经历进一步的分离，该分离通过使该信号通过第二分色镜1418来进行（其将第一珠 信号组分反射到第二检测器1422)，并且使第二珠信号组分通过到达第三检测器1424。该 检测器通常联接至合适的处理器或计算机上以存储与经检测的珠相关联的信号数据，并分 析信号数据以确定珠的特性，以及因而的捕获探针和相关靶核酸序列的特性。另外，该处 理器或计算机可以包含对定量信号数据编程和对靶序列拷贝数量的发信，其中进行时程实 验，如在整体扩增反应中一轮或多轮扩增循环后对珠取样。
[0114] 该装置或系统可以包含或可操作地联接到如在计算机或计算机可读介质中实施 的系统指令。该指令可以控制该装置或系统的任何方面，例如，将信号强度的一个或多个测 量值与由热调节模块实施的多个扩增循环相关联，以测定由装置检测到的靶核酸的浓度。
[0115] 系统可以包含可操作地联接至其他装置组件的计算机，例如，通过合适的配线或 通过无线连接。该计算机可以包含如下指令，例如由热调节模块控制热循环的指令（例如 使用上述反馈控制），和/或指定何时由光学系统拍摄或观察图片的指令。该计算机可以接 收或将图像信息转化成数字信息和/或信号强度与时间的关系曲线，测定由该装置分析的 靶核酸的浓度等。该计算机可以包含用于使信号强度标准化来计算背景的指令，例如就阵 列的一个或多个区域检测局部背景，并通过针对所述背景校正来使阵列信号强度测量值标 准化。相似地，该计算机可以包含通过对阵列捕获核酸斑点上的差异、或对阵列不同区域的 视野不均进行校正，来使信号强度标准化的指令。
[0116] 其他定义
[0117] 在进一步详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定装置或生 物系统，因为它们当然可能变化。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方 式而不是限制性的。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包 括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如，关于本文所讨论的耗材腔室的"一 个表面"，任选地包含两个或多个表面的结合等。
[0118] 除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的 通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发 明，但下面描述了优选的方法和材料。在说明和要求保护本发明的过程中，将依据以下定义 使用以下术语。
[0119] "扩增引物"是可以在模板依赖性扩增反应中延伸的部分（例如，分子）。最典型 地，所述引物会包含或是在扩增条件下结合到模板的核酸。通常，所述引物会包含通过聚合 酶（如通过聚合酶链反应中的热稳定聚合酶）或通过（如连接酶链反应中的）连接酶延伸 的末端。
[0120] "检测腔室"是部分或全部封闭的结构，其中分析样品或检测靶核酸。所述腔室可 完全封闭，或可包含流控偶联到所述腔室的端口或通道，例如用于递送试剂或反应剂。所 述腔室的形状可根据本发明和可用的系统设备而变化。当其尺寸上成形以降低信号背景， 例如通过在阵列附近处包含的较窄尺寸（例如，腔室深度）（从而降低靠近阵列处的溶液 生成的信号的量）时，或者当另外设置腔室以降低背景，例如通过使用涂层（例如，光学涂 层）或结构（例如，挡板或靠近所述阵列的其他形状结构）时，腔室被"设置以在阵列附近 降低信号背景"。通常，设置该腔室以在阵列附近具有某一尺寸（例如，深度），从而溶液中 的信号足够低以允许检测阵列处的信号差异。例如，在一个实施方式中，该腔室在阵列之上 的深度小于约1mm ;理想地，腔室深度小于约500 μ m。通常，该腔室在阵列之上深度小于约 400 μ m，小于约300 μ m，小于约200 μ m，或小于约150 μ m。在本文提供的一个实施例中，该 腔室深度为约142 μ m。
[0121] "高效核酸阵列"是在杂交条件下与探针或探针片段高效杂交的捕获核酸的阵列。 在典型的实施方式中，阵列被设置在反应/检测腔室的内表面上。该阵列可以通过从斑点 法到化学或光化学合成的任何传统阵列技术在表面上形成。通过控制捕获探针的区域长度 (较短的探针比较长的探针更有效地杂交，小到供于杂交条件的最小杂交长度），并通过控 制各阵列区域中捕获核酸的数量来实现高效。可以通过在捕获位点和表面之间包含连接序 列或结构来产生供于杂交的更高效/更有用的捕获位点（因而在距离表面的选择距离上形 成捕获位点，其可以降低表面对杂交的影响）。例如，可以使用核酸序列和/或聚乙二醇接 头。捕获核酸的数量在各阵列区域中分布，从而对典型扩增反应产生的给定探针或片段而 言，可用于杂交的位点数量是非速率限定的。如上所述，这意味着可用于结合在扩增反应中 产生的带标记的探针片段的位点数量是过量的，并且优选位点数量明显过量，该位点数量 在扩增反应后的反应混合物中可以由探针片段的浓度所饱和。
[0122] "带标记的探针"是分子或化合物，其在扩增条件下与靶核酸特异性杂交，并且包 括可检测的部分或可以变得可检测的部分。最通常地，带标记的探针是包含光学标记物的 核酸，所述光学标记物例如荧光团、染料、发光团、量子点等。标记物可以是可直接检测的， 或可以处于淬灭状态，例如探针包含淬灭剂部分的情况。在本文的很多实施方式中，在靶核 酸扩增中切割带标记的探针以释放包含可检测标记物的探针片段。例如，带标记的探针可 以包含荧光团和淬灭剂，例如，其中扩增反应造成探针切割以释放带标记的探针片段。最典 型地，探针包含"折翼"区域。这种折翼区域在杂交中不与靶碱基配对，并且通过核酸酶（如 聚合酶的核酸酶活性）从探针的其余部分切下，因而形成探针片段。 实施例
[0123] 提供以下实施例用于说明而非限制本发明的权利要求。应理解，本文所述的实施 例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它 们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。
[0124] 示例性检测系统
[0125] 这个实施例的检测系统能进行对靶核酸的单腔室、多重、实时PCR检测。该系统扩 大了实时PCR的多重性容量，该扩大通过从传统的光谱区分变化为基于阵列的空间区分以 生成对正扩增的各靶标具有特异性的实时信息来实现。
[0126] 传统上，通过使用对各扩增子具有特异性的PCR探针（诸如TAQMAN?)和用不同波 长荧光团标记的PCR探针来实现单孔多重性。由于染料释放光谱和光谱窗的限制，这种方 法将单个反应多重性容量限制在最多约5个靶标。
[0127] 在这个实施例中描述的方法使用带标记的PCR探针，该PCR探针作为扩增子的代 替在该过程中将关于扩增进展的信息转移到表面结合的阵列上。保留了关于扩增的动力学 信息，从而允许根据循环数量阀值方法来获得检测和定量信息。
[0128] 在PCR循环的延伸步骤中，Taq聚合酶的5' -3'核酸酶活性切割PCR探针以释放 折翼核酸，然后该折翼核酸可以优先与阵列表面上的捕获探针杂交。各折翼和相应的捕获 探针对于测试组中的潜在靶标是唯一的。
[0129] 反应腔室深度
[0130] 进行实验以评价腔室厚度与给定阵列中信号与背景噪音之比的关系。基材用不同 深度的腔室机械加工，并且用官能化的聚合物被覆。测量腔室的实际深度。所述基材然后 用捕获探针点样，并且使用紫外线固化环氧树脂组装成封闭的反应腔室。将含有45nM的与 阵列上各捕获探针互补的带标记的探针片段的合成模拟和255nM的相应完整探针（以模拟 15%切割）用移液器转移到各封闭反应腔室中，并且在30°C下杂交3分钟后测量所述信号 对比背景信号。一项试验的结果示于图13。如图所示，反应腔室的厚度从600微米减小到 小于200微米显示出信号与背噪之比的显著增加，最优比率是厚度小于300微米的情况下， 并且优选小于200微米厚度。
[0131] PCR腔室和阵列
[0132] 大部分实验中使用的PCR腔室示于图2。如图所示，该腔室由含有与PCR探 针折翼序列互补的捕获寡核苷酸的阵列的底表面组成。捕获探针由整合DNA技术公司 (Integrated DNA Technologies Inc)(爱荷华州克拉威尔）合成，并且具有共价连接到形 成PCR腔室底部的基材的5'端氨基基团，以及连接化学和寡核苷酸序列之间的聚乙二醇接 头。序列长度与对应的PCR探针折翼相同。从市售可得的载玻片形成PCR腔室的底部。这 种载玻片具有含有活性NHS酯的聚合物涂层，该涂层用于捕获探针的后续连接物。载玻片 包含用聚合物被覆的玻璃和塑料基材。两种类型的载玻片得到相似的实验数据。根据标准 方法，使用SP0TB0T TM(Arrayit技术公司（加利福尼亚州萨尼维尔））方案来辨认捕获探针。 该捕获探针斑点直径通常是100 μ m，点之间中心与中心的距离是200 μ m。在对该捕获探针 进行定点测定和洗涤之后，使用压敏粘合剂（PSA)和具有如图2所示的进端口和出端口的 聚碳酸酯顶部部件组装成PCR腔室。该腔室具有142 μ Μ的最终深度/厚度（或高度）和 15mm的直径。该腔室装载约45uL体积的PCR试剂。
[0133] 热循环仪和光学线路板。
[0134] 热循环仪和光学检测系统包含落射荧光、单通道检测系统，该系统包含（1)激发 光源（例如，汞弧光灯或LED)，（2)用于激发光和发射光的干扰光学过滤器，从而检测荧光 团的特定组合，如Cy3、Cy5等，和（3)光检测器，其为C⑶或CMOS照相机。
[0135] 该系统还包含热循环组件，诸如一对热电模块、金属板、散热器和强力冷却风扇， 这些组件用于将封闭的耗材（例如，上述的阵列和腔室）快速热循环至需要的温度并持续 所需时间。通过使用反馈控制系统来控制热电模块至特定的温度持续特定的时间，该系统 使用靠近耗材的热敏电阻器作为控制系统的反馈。
[0136] 通过计算机进行系统控制，其使用作为输入的脚本文件来生成靶标温度和时间， 并且指定何时通过光探测器拍摄图像。并且通过计算机分析在热反应中的不同时间点拍摄 的所得图像来生成强度与时间的关系曲线，从而得到靶标浓度。
[0137] 在热反应过程中的不同时间和温度下捕获单通道荧光图像。然后分析这些荧光图 像以生成对起始靶核酸浓度的定量。使用平均灰度强度测量值、背景校正和基线调整的组 合来分析荧光图像。在阵列中对各点局部测量背景。通过测量感兴趣点的周围溶液的同心 环的荧光强度来计算背景。然后校正来自各斑点的信号以计算局部背景。进一步标准化来 自各斑点的经校正的信号以计算视野中的斑点以及不均匀光照中的变化。然后将从前几轮 循环（通常5-15轮循环）中获得的经校正的强度测量值的平均值用于调整基线和对各斑 点测量值的标准化。
[0138] 实施例1 :三步扩增反应
[0139] 扩增试剂混合物包含标准PCR试剂，该试剂包含对扩增的各靶标有特异性的两条 PCR扩增引物，以及对扩增的各靶标具有特异性的PCR探针。典型探针的结构示于图1A。如 图所示，图1A探针区域（A)表示与靶标扩增子互补的探针的核酸区域，使用如通常对传统 实时PCR探针（例如，在TAQMAN?探针中）相同的规定来设计。探针区域（B)表示与相应 捕获探针（下文讨论）互补但是不与靶核酸互补的正交核酸"折翼"序列。为了说明，在一 个实施例中设计该序列以具有40°C -461：的Tm，尽管能用其他探针设计来取代。在一个实 施例中，序列长度是约13或14个碱基。探针区域（C)表示具有与核酸区域（B)的序列的 部分互补的序列的核酸。设计该序列以促进形成全长探针的二级结构，例如具有47?51°C 的^。淬灭剂（D)表示任选的淬灭剂分子。标记物（E)表示荧光团或其他任选的可检测标 记物。荧光团Cy3用于下文显示的数据。
[0140] 对这个实施例中的数据而言，用下列试剂制剂进行PCR:200nM引物，IX FAST START1"1 PCR 缓冲液（可购自罗氏公司（Roche))，2-6mM MgCl2,0.5mg/mL BSA，0.2 单位/uL FAST START1"1 Taq聚合酶（罗氏公司）和150nM PCR探针。
[0141] 使用上述制剂制备lOOuL PCR反应物。
[0142] 用于这个实施例的PCR探针序列是：
[0143] NN NMNNNNMNM NNCCTGTTGCCAATTTCAGAGTGTTTTGCTTAAC NNNNNNNNN GAT(SEQ ID NO ：1)〇
[0144] 5'和3'折翼用下划线/双下划线表示，而传统TaqMan序列用黑体表示。双下 划线序列表示设计形成二级结构的同源区域。二级结构的预测融合温度是51°C，如由 mFold(idtdna. com)使用PCR缓冲液条件所测定。用5' Cy3荧光团和黑洞猝灭物（Black Hole Quencher) 2部分在3'端标记PCR探针。
[0145] 连接到PCR腔室的底表面的捕获探针序列是：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :2)， 使用PCR缓冲液条件的Tm是42°C。
[0146] 将包含靶序列的DNA质粒以ΙΟ6、104和10 2拷贝/uL的浓度加入到各PCR反应中。 然后所述溶液通过加热到95°C脱气。脱气后，加入聚合酶，并且将所述反应用移液器加载到 PCR腔室中。剩余溶液加入应用生物系统（Applied Biosystems)7500用于平行分析。
[0147] 用于基于PCR的阵列的循环条件如下：
[0148] 温度 时间 目的 95 °C 120 秒 FAST START 酶激活 95 °C 15秒 变性 60 °C 60秒 聚含Si延仲 30Γ 120秒 折翼杂交和光学读取
[0149] (变性和延伸进行5轮循环，然后变性/延伸/折翼杂交和光学读数重复8轮循 环）。
[0150] ABI7500的循环条件如下：
[0151] 温度 时_ __ 951： 120 秒 FAST START _激活 951： 15秒 变性 60V 60秒 聚介陶延仲和光，速収
[0152] 变性/延伸和读数进行40轮循环。
[0153] 对基于PCR阵列的拷贝数量滴定的结果示于图3,溶液相PCR的结果示于图4。如 图所示，结果是相当的，得到相似的滴定表现。
[0154] 实施例2 :二步扩增反应
[0155] 如上述实施例1，扩增试剂混合物含有标准PCR试剂，该试剂包含与扩增的各靶标 互补的两条PCR引物（200nM)和具有与扩增的各靶标互补的序列的PCR探针（300nM)。典型 探针的结构示于图1B。如图所示，带标记的探针还包含与靶标扩增子互补的核酸片段（A)， 使用如通常对传统实时PCR探针（例如，TaqMan)相同规则设计。还包含与捕获阵列上相 应捕获探针互补的正交核酸"折翼"序列（B)。该探针还包含偶联到折翼部分B上的荧光标 记物（C)和偶联到靶标特异性部分（A)上的淬灭剂部分（D)。
[0156] 对两步扩增而言，该正交折翼（B)包括设计以具有与捕获阵列上的互补物的70°C 的^的序列。序列长度通常是25?27个碱基。如上述实施例1，设计整体探针，从而最稳 定的二级结构在用于PCR的缓冲液条件下具有不高于比延伸和测量温度低10°C的温度的 Tm。使用www. idtdna. com上可用的unafold软件设计寡核苷酸。用于这个实施例的下面 PCR探针序列是：
[0157] KNN NNN NMM NNM NNN NNN N/Cv3/MN NNN NNN ATG GCC GTT AGC TTC AGT CAA TTC AAC AG/BHQ_2/(SEQ ID NO ：40)
[0158] 其中双下划线序列组成正交折翼，并且非下划线序列与扩增子同源。最稳定的探 针二级结构的熔融温度是45°C。正交折翼的1' 111是711：。用内部Cy3荧光团C(购自新泽 西州皮斯卡特维的GE健康护理生物科学公司）和黑洞猝灭物2部分D (购自加利福尼亚州 诺瓦托的生物探索公司（Biosearch，Inc.))在3'端上标记该PCR探针。
[0159] 定点测定与PCR探针的折翼部分同源的捕获探针。如上述进行PCR，除了使用下述 循环条件：
[0160] 溢度 时M U的 95V 60 秒 FAST START ft激活 95V 15 秒 变fl·: 55eC 60秒 聚介II延伸、折翼杂交和 光学读取
[0161] 进行40轮循环，在各延伸步骤结束时测量荧光信号。图12显示对两个靶标的基 于阵列的PCR的拷贝数滴定，其中第一个在靶标DNA质粒的10 4拷贝时开始出现，而第二个 在106拷贝时出现。
[0162] 实施例3 :使用未淬灭PCR探针的基于阵列的PCR曲线
[0163] 除了以下不同，使用与实施例1相同的方法。如下使用PCR探针序列：
[0164] NNNMNNNNM NNNNTCGCTGAACAAGCAACCGTTACCC NNNNNMNM (SEQ ID NO ：3)
[0165] 用5' Cy3荧光团标记这个序列，但是不包含3'淬灭剂。
[0166] 加入106拷贝的靶标并运行PCR。实时数据示于图5。
[0167] 实施例4 :基于多重阵列的扩增
[0168] 这个实验建立了在相同PCR腔室中检测和扩增多个靶标的能力。PCR条件与实施 例1所示相同，除了以下例外：第一，将5组引物和5种单独的PCR探针加入到对待测的各 靶标有特异性的PCR反应中。第二，将5种单独捕获探针置于PCR腔室的底部基材上，该腔 室对应5种PCR探针各自的5'折翼序列。第三，在第10轮PCR循环后，使温度降低到各2 轮循环而不是如实施例1的各5轮循环的表面杂交温度30°C。这使得PCR扩增过程中光学 研究的效率更高。
[0169] 所述PCR探针和捕获探针效率如下所示：
[0170] PCR 探针：
[0171] F 1 u A ： N N N NNMNNNMMNN CCCCAT GGAATGTTAT CTCCCTTTTAAGCTTCTNNNNNNNN (SEQ ID NO :4) (50. 3。的 TJ
[0172] A/HI ：NNNN NNNNNNNNN. ACCTTGGC GCTATTAGAT TTCCATTTGC CMMMMNNMM (SEQ ID NO :5) (51. 2。的 TJ
[0173] A / H 3 ： N N NNNNNNNNNNMN C C T G T T GCCAATTT CAGAGTGTT TTGCTTAAC NNNNNNNNMMMN (SEQ ID NO :6) (51。的 Tj
[0174] FluB ：NNNNNNNNNNNNMNTCAAAGC CAATTCGAG CAGCTGAAAC TMNNNNNNN (SEQ ID NO :7) (51。的 TJ
[0175] p h i M S 2 ： N. NNNNNNNNNNNN TCGCTGAA CAAGCAACC GTTACCC NNNNNNNNNNMN (SEQ ID NO :8) (52。的 Tj
[0176] 捕获探针 FluA: NNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 8) (46。的 Tm) AMI: NNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO: 9) (45°ft T||J) A/H3; NNNNNNNNNMNNN (SEQ Π 3 NO: 10) (420的 Tm) FluB: NNN NNN NNN MNN N (SEQ ID NO: 1 】）（46°的 Tm) phiMS2: NNN NNN NNN NNN N (SEQ ID NO; 12) (43^3 Tm)
[0177] 将包含对上述引物和PCR探针有特异性的序列的5种靶标质粒加入lOOuL PCR反 应中，并且如上述准备并加载该溶液。所得的基于实时阵列的PCR数据示于图6。
[0178] 实施例5:高水平多重
[0179] 这个实施例显示了检测多个靶标的单个腔室多重，所述靶标能是包含在这个实施 例的组中的任何10个可能的靶标。无法在传统溶液相PCR中实现该水平的多重（超过5 个潜在靶标的组）。
[0180] 所述实验材料和方法与上述相同，除了以下例外：第一，将10个引物组和PCR探针 以与上述相同的浓度纳入到PCR反应中。PCR探针和捕获探针的序列如下所示：
[0181] PCR 探针：
[0182] FluA ：NNN NNNNMNNN NNCCCCATGG AATGTTATCT CCCTTTTAAG CTTCTNNNNNNNN(SEQ ID NO : 13) (50.3。的 Tj
[0183] A/HI ：NNNNNNNNNNNNNN ACCTTGGCGCT ATTAGATTTC CATTTGCC NNNNNNNN (SEQ ID NO :14) (51.2。的 TJ
[0184] A/H3 :祖 NNNNNNNNNNN CCTGTTGCCA ATTTCAGAG TGTTTTGCT TAAC NNNNNNNNNNN (SEQ ID NO :15) (5Γ 的 Tm)
[0185] F 1 u B - V 2 ： N^. NNNNNNNNNNN TCAAAGCC AATTCGAGCA GCTGAAACT NNNNNNNN (SEQ ID NO :16) (51° 的 Tj
[0186] phiMS2 ：NNNNNNNNNNNNNTCGCTG AACAAGCAA CCGTTACCC NNNNNNNN (SEQ ID NO :17) (52° 的 TJ
[0187] MPV ： NNNNNNN NNNNNNNATGG CCGTTAGCTTCAGTCAATTC AACAG NNNNNNN (SEQ ID NO :18) (48. 4° 的 TJ
[0188] PIV1 ：NNN NNNNNNNNN NTTOGAATT GTCTCGACA ACAATCTTTG GCCTNNNNNNNNN(SEP ID NO : 19) (50.4° 的 Tj
[0189] PIV2 ：NN NNMMNNMNN NNCCATTT ACCTAAGTGA TGGAATCAAT CGCAAAAGNNNNNNNN(SEQ ID NO :20) (48.8° 的 Tj
[0190] PIV3 ：NNN NNNNNNNNNNN ΝΑΓΑΤΑΑ GCTTTGATC AACCCTATG CTGCACNNNNNNNNN(SEP ID NO :21) (49.9。的 Tj
[0191] RSV ；N NNNNNNNNN NNNTTCGAAGGCTC CACATACACAG CTGCTGNNNNNNNNN (SEQ ID NO :22) (49. 9° 的 TJ
[0192] RSY-V2 ：NNNNN NNNNNMN NTCGAAGGC TCCACATACA CAGCTGCTGNNNNNNNN (SEQ ID NO :23) (5Γ 的 Tm)
[0193] 0PC1 ： NNNNNNNN NNNNNTTCGGCAT TTCCTGGATTGAGT CGGTACTANNNNNNNN (SEQ ID NO :24) (48. 7° 的 TJ
[0194] 捕获探针 捕获探针Tm FluA NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 26 ( 460的 A/Hl NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO·· 27 (45° 的 fTP*· \ i HI J A/IB NNNNNNNNNNNNN eEQ ID NO: 28 (42° 的 fTr% \ i HI J FluB-v2 NNN NNN NNN NNN N gEQ ID NO: 29 (46。的 Tm) phiMS2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 30 (43° 的 Tm) MPV NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 31 PIVI NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 32 PIV2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 33 PIV3 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 34 RSV NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 35 RSV-v2 NNN NNN NNN NNN N SEQ ID NO: 36 OPC1 NNN NNN NNN NNN N SFQ ID NO: 37
[0195] 图7显示了当没有靶标加入到PCR反应（没有模板对照）时，所得基于实时阵列 的PCR曲线。如图所示，从含有除了靶标以外的所有PCR组分的溶液中没有得到信号。图 8显示了具有以10000拷贝/uL加入的3种质粒靶标（MPV、0PC-1、PIV2)的相同的实验。
[0196] 实施例6 :快速杂交动力学的示范
[0197] 如上所述构建PCR腔室。将下列胺、PEG化的捕获探针序列置于底部基材上：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :38)。
[0198] 制备含有上述PCR缓冲液的溶液，其含有以下寡聚序列（ΙΟΟηΜ)，该寡聚序列模拟 PCR探针的5'折翼部分，用Cy3荧光团在5'端上标记并与捕获探针互补：NNN NNN NNN NNN N(SEQ ID NO :39)。
[0199] 将该溶液加入到PCR腔室中，并且将该腔室加热到60°C (比双链体Tm高15度）， 然后冷却到30°C。这模拟了 PCR方案扩增步骤的条件。每20秒光学读取持续2分钟。所 得数据示于图9。
[0200] 数据的一个有趣的方面显示了内部温度达到30°C时已经发生了大量杂交。
[0201] 实施例7:暗试验设置
[0202] 使用包含购自整合DNA技术公司的Iowa Black RQ猝灭基团的探针的折翼部分重 复上述实施例1所述的三步骤扩增试验，将该基团偶联于其5 '端，并且没有任何其他的标 记物或猝灭基团与探针相连。阵列表面上设置的捕获探针携带与3 '末端偶联的Cy3荧光 团。
[0203] 所有的引物和探针序列订购自IDT并经冻干。然后使其在水中重悬至储液浓度 (100uM-200uM)并且用于制备PCR反应的引物/探针储液。将H03NVSPCR缓冲液与引物和 探针合并以制备PCR主混物。
[0204] 通过Array-It spotbot2用传统微阵列定点测定技术在官能化的表面（由官能化 聚合物被覆的C0P基材）上定点测定。定点测定的载玻片在75%湿度下孵育8-15小时，然 后用DI水冲洗并用氩气干燥。带标记的捕获探针以在50mM的pH8. 5的定点测定缓冲液中 100nM-50uM范围的浓度定点测定，产生信号强度的范围。
[0205] 如上述实施例，将基于芯片的反应腔室使用双侧压敏粘合剂垫圈、聚碳酸酯盖 和任选的透明密封构建在官能化、阵列的表面之上。反应腔室的总体积为约30uL，高度 150um〇
[0206] 向PCR主混物中加入已知浓度的靶序列并将所得的溶液加载到反应容器中。对容 器进行密封并且装载到上述的热循环仪上。从质粒储液中得到靶序列或者从包括这些扩增 子储液的之前反应中得到所得的扩增子。在NanoDrop仪器上使用UV-Vis光谱定量所有的 革巴标分子。
[0207] 热循环条件包含在95°C下85秒的热起始步骤，之后是40轮分别为5秒和20秒的 熔融（95°C)和延伸（55°C)的循环。在第10、15和18轮循环以及之后每2轮循环时，向 循环添加用以收集数据的额外步骤。在延伸后使温度降至30°C并持续30秒。在这些杂交 步骤结束时收集表面的图像。计算各试验中的斑点的平均像素强度并且针对循环数绘制曲 线以产生实时PCR曲线。溶液和表面探针的设计示于试验模式3。对于双重PCR反应：力口 入用于H3和0PC1试验的600nM引物和300nM探针。图15显示基于折翼部分和它们相关 联的猝灭剂与Cy3标记的捕获探针的增加杂交的实时PCR反应的过程的曲线。荧光信号以 负信号的绝对值作图，其显示信号随着反应进行而降低。
[0208] 本文所列的方法具有之前的方法中未发现的多种优势。本发明系统使得能通过在 扩增过程中从溶液相PCR向表面限制的阵列实时有效传递信息来进行单腔室、高度多重、 定量的PCR。这允许实现更高水平的多重性，同时保持效率并影响关于溶液相实时PCR所积 累的大量认识。为了实现这个方法，开发了该系统的多个新方面。
[0209] 例如，本发明的一个特征是使用扩增子代替物来桥连溶液相和固相。之前针对基 于阵列的实时PCR的教导通常依赖于扩增子本身对固相阵列的杂交。这提出了多个问题， 所述问题使系统复杂化、阻碍效率并且需要更昂贵的组件以阐明所需信息。在多重PCR环 境中，非常难于设计相似长度和杂交效率的扩增子。使用有可切割的5'折翼的PCR探针使 得物质均质化，通过使用对杂交动力学理想的非常短的序列将信息从各扩增子转移到表面 上。这种方法也在不依赖待检测的扩增子序列的阵列上制备捕获探针序列。这使得能选 择最有利的捕获序列和可用于很多不同靶标组的通用阵列的可能性，简化了设计和制造方 法。
[0210] 如本文所述，PCR探针也影响了已开发的对基于探针的溶液相实时PCR的设计规 贝1J。使用对于杂交的非常短的序列（例如，13-14个碱基）使得杂交非常高效，使得在标准 PCR缓冲液的低盐环境生成阵列的高信号。因此，所述系统能在单腔室中获得非常良好的效 果，其中表面杂交必需与最优溶液相PCR偶联。
[0211] 本发明的另一个特征是从溶液相背景荧光中区分表面杂交信号。本发明的这个方 面对于从该阵列中提取相关信息很重要。之间的教导使用复杂或昂贵的光学方法以克服这 个问题，诸如使用内全反射或共聚焦显微以从溶液背景中分离表面信号。相反，本发明提供 了不需要光学"窍门（trick)"来实现区分的简单标准光学设备的用途。从多个来源区分信 号的能力。在阵列中使用的表面化学提供了非常高的捕获探针密度，并且因此非常高的经 杂交的靶标密度。已显示表面可以接近100%的靶核酸捕获效率。这种高捕获密度和效率 作用以集中表面信号，以辅助表面/溶液相的区分。使用短靶核酸以显著增加这种效果。
[0212] 本发明辅助信号区分的另一方面是使用非常薄的PCR腔室。来自溶液的背景信号 与阵列之上的溶液的高度线性相关。使用薄腔室利用这种效果。
[0213] 本发明的另一方面是使用快速杂交动力学以使得从溶液相信息向表面阵列实时 转移。这些实施例中所述的系统显示了极快的固相杂交。这种现象促进了该技术，并且能 对本发明的多个方面发挥作用，包含短5'折翼靶标、最优固相表面化学、薄耗材和热循环温 度程序中生成温度梯度。
[0214] 尽管已经出于阐述和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域 技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下进行各种 形式和细节的变化。例如，上述所有的技术和设备都可以用于各种组合。本申请中提到的 所有公开出版物、专利、专利申请和/或文献都通过引用全文纳入本文中，相当于所述各单 独的公开出版物、专利、专利申请和/或文献都独立地通过引用纳入本文用于所有目的。
【权利要求】
1. 一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括：用具有核酸酶活性的聚合酶对所述 样品进行扩增反应，所述扩增反应在包含第一探针的试剂的存在下进行，所述第一探针包 含与所述靶核酸序列互补的第一部分和不与该第一靶核酸序列互补的第二部分，所述第二 部分包含第一位置上的与所述第二部分偶联的第一猝灭剂部分，从而当所述靶核酸序列被 扩增时，所述第二部分从所述第一部分被切下成为第一探针片段； 使所述第一探针片段与固定在基材上的捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含被所述 第一猝灭剂部分至少部分猝灭的荧光团，所述荧光团偶联至所述捕获探针上的第二位置， 从而在所述探针片段与所述捕获探针杂交之后，所述荧光团至少部分被所述猝灭剂猝灭； 以及 基于所述捕获探针上所述荧光团的猝灭来检测所述靶序列的存在。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述扩增试剂包括多种不同的探针，所述多种不同的探针具有与不同靶核酸序列互补 的多种不同的第一部分和不与多种靶核酸序列互补的不同的第二部分，所述第二部分各自 包含偶联至所述第一位置上的猝灭剂部分，所述多种第二部分在所述多种靶核酸序列扩增 后被切割成探针片段；以及 其中所述基材包含在所述基材上排列的多种不同的捕获探针区域，各捕获探针区域包 含与所述多种不同的探针的不同第二部分互补的捕获探针，并且各捕获探针包含被所述猝 灭剂部分猝灭的荧光团。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一位置包含所述探针片段的5'端， 而所述第二位置包含所述捕获探针的3'端。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，各捕获探针区域包含与所述探针片段杂交 的非速率限制数量的捕获核酸。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段 的长度小于约30个核苷酸。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段 的长度小于约20个核苷酸。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，与所述捕获探针杂交的所述第一探针片段 的长度小于约15个核苷酸或更短。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测前将所述靶核酸扩增至少5轮扩 增循环。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述检测前将所述靶核酸扩增多轮扩增 循环，其中，所述检测后在该探针的额外拷贝的存在下另扩增所述靶核酸部分，所得释放的 第一探针片段随后与所述阵列杂交并被检测，其中检测到的信号强度与所述样品中存在的 革巴核酸的量相关联。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交温度低于所述扩增反应的温度。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测所述阵列的一个或多个 区域的局部背景，和通过针对所述背景校正来使信号强度测量值标准化。
12. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品包含多种靶核酸。
13. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种不同的捕获探针在所述阵列上空 间分离。
14. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述扩增反应中存在约5-约100种不同 的捕获探针，和约5-约100种对应的探针，其中基于所述信号在所述阵列上定位可以检测 多至5-100种不同的信号。
15. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕获探针以约350fmol/cm2-约 5000fm〇l/cm 2或更大的密度排列在所述基材上。
16. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕获探针以超过2000fm〇l/cm2的密度 排列在所述基材上。
17. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多种不同的捕获探针包含相同的标记 物部分，并且所述多种不同的探针片段包含相同的猝灭剂部分。
18. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增步骤和将所述第一探针片段与所 述基材杂交的步骤在相同温度下进行。
【文档编号】C12Q1/34GK104093857SQ201280067273
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年8月16日 优先权日:2011年11月17日
【发明者】K·斯卡布, P·马丁, B·塔弗特, J·拉 申请人:Nvs技术股份有限公司