核酸的定量、高度多重检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在多重的单个腔室反应中检测和定量样品中靶标核酸的方法。提供了把信号背景优化降低到接近高效阵列的耗材整合腔室，及其使用方法。本发明的特征是设置成使用所述耗材以实施所述方法的装置和系统。
【专利说明】核酸的定量、高度多重检测[0001 ] 联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
[0002]本发明是在美国国土安全部第HSHQDC-10-C-00053号基金资助下进行。政府对本发明拥有某些权利。
[0003]相关申请的交叉参考
[0004]本申请涉及2011年2月18日提交的美国临时专利申请第61/463，580号和2011年11月17日提交的美国临时专利申请第61/561，198号的优先权，所述专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
【技术领域】
[0005]本发明是实时DNA扩增、检测和定量的领域，以及相关耗材(consumable)、装置和系统(包含阵列)。
技术背景
[0006]实时PCR通常用于生物样品中感兴趣核酸的检测。实时PCR的综述见例如MTevfikDorak (编者)(2OO6) Real-time PCR(Advanced Methods)(实时 PCR (高级方法))TF公司(Taylor&Francis)，第一版 ISBN-10:041537734X ISBN-13:978-0415377348，和 Logan等(编者)(2009) Real-Time PCR:Current Technology and Applications (实时 PCR:现有技术和应用)，Caister 学术出版社，第一版 ISBN-10:1904455395，ISBN-13:978-1904455394。其他细节也见例如 Gelfand 等，“Homogeneous Assay System Using The NucleaseActivity of A Nucleic Acid Polymerase (使用核酸聚合酶的核酸酶活性的均匀测试系统)，，USP5, 210，015; Leone 等，(1995) " Molecular beacon probes combined withamplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA (分子信标探针与NASBA扩增的结合能均匀 实时检测RNA) " Nucleic Acids Res.26:2150-2155;和 Tyagi 和 Kramer (1996) “Molecular beacons: probes that fluoresce uponhybridization (分子信标:基于杂交的突光探针)’^Nature Biotechnologyl4:303-308。通常，用于在单反应容器(如多孔板的孔)中检测各样品多于一个靶标核酸的单细胞多重技术(multiplexing)，这是使用对各扩增子特异性的自体淬灭PCR探针例如TAQMAN?或分子信标探针来实现。一旦在溶液中结合扩增子，或一旦PCR中探针的降解，所述探针不淬灭(unquench)，而生成检测信号。所述探针用不同波长的荧光团标记，使得多重技术在单个“单罐式”反应中多至约5个靶标。由于实践光谱范围和标记释放限制，难于实现各反应多于约5个探针。这严重限制了单个反应的多重技术，进而严重限制了各样品能筛选多少个靶标和提高了在检测感兴趣多个靶标中的成本和设备复杂性。
[0007]核酸阵列代表多重检测扩增产物的另一种方法。更常见地，在样品上进行扩增反应，并且扩增子在核酸阵列上分别检测。例如Sorge“Methods for Detection of a TargetNucleic Acid Using A Probe Comprising Secondary Structure (使用包含二级结构探针检测靶标核酸的方法)”US 6，350，580提出了通过从扩增混合物中纯化探针并且检测探针来捕获基于扩增释放的探针。这种生成和检测扩增子的多重步骤方法使得实时分析扩增混合物是不现实的。
[0008]也提出了在捕获核酸存在下扩增反应物的多种方法。例如，Kleiber等“Integrated Method and System for Amplifying And Detecting Nucleic Acids (扩增和检测核酸的整体方法和系统)”US 6, 270, 965,提出了通过逐渐消失(evanescence)诱导的突光来检测扩增子。相似地，Alexandre 等“Identification and Quantification of aPlurality of Biological (Micro) Organisms or Their Components (多种(微)生物体或其成分的鉴定和定量)"US 7，829，313，提出了在阵列上检测扩增子。在另一个示例中，通过检测扩增生成的探针片段来检测靶标多核苷酸，所述检测例如通过结合电极，然后电化学检测。见例如 Aivazachvilli 等，“Detection of Nucleic Acid Amplification (核酸扩增的检测)，，US 2007/0099211 ;Aivazachvilli 等，“Systems and Methods for DetectingNucleic Acids (检测核酸的系统和方法)” US 2008/0193940，和 Scaboo 等，“Methods AndSystems for Detecting Nucleic Acids (检测核酸的方法和系统)” US 2008/0241838。
[0009]所有这些方法的缺陷在于限制其用于多重靶标核酸检测的现实限制性。例如Kleiber (US 6270, 965)依靠逐渐消失(evanescence)诱导的突光以在阵列表面检测扩增子的荧光，并且需要复杂和昂贵的光学器和阵列。Alexandre (7，829，313)提出在阵列上检测扩增子；如Kleiber所述，这显著增加了阵列成本，因为必需设置设计各阵列以检测各扩增子。如Alexandre所述，实践中，在阵列上对不同的扩增子难于实现相似的杂交动力学，特别是当扩增子相对较大时。另外，本领域对阵列(在阵列上有也包含高水平信号背景的伴随溶液相)或者在通过原位热循环保持稳定的阵列上如何检测信号几乎没有提供引导。
[0010]本发明克服了本领域中这些问题和其他问题。通过完整阅读以下内容可以更完整地理解本发明。
【发明内容】
[0011]本发明提供了能高度多重`检测感兴趣核酸的方法及相关装置、系统和耗材，所述检测例如检测病毒、细菌、疟原虫(Plasmodium)属、真菌或生物样品中的其他病原体。所述耗材包含在其腔室内表面有高效热稳定核酸检测阵列的信号优化腔室。所述阵列设置成检测多至约100种或更多种不同通用标记的探针。所述方法在感兴趣核酸部分扩增中生成标记的通用探针(如“探针片段”)，所述扩增反应在腔室中进行。所述通用探针在一些扩增循环后与阵列杂交，并且然后选择扩增循环，使得在样品中实时检测和扩增一种或多种感兴趣核酸。因此，在第一个方面，提供了检测靶标核酸的方法。这包含了提供在腔室的至少一个表面上有至少一种高效核酸检测阵列的检测腔室。所述高效阵列通常包含非速率限制(non-rate limiting)数量的捕获核酸,使得增加了腔室中反应生成的可检测探针片段的捕获速率，并且所述捕获核酸设置成捕获相对小的探针核酸，这也增加了阵列效率。探针与阵列的结合检测优选在选择或设置降低所述阵列附近的背景信号水平(如没有结合的游离探针)的条件下进行。例如，在某些实施方式中，设置腔室本身以把信号背景降低成接近阵列背景，例如通过定型腔室以降低背景(如通过将腔室制成与接近阵列的相对薄的腔室，所述腔室通常是阵列上约500 μ m或更薄)。较薄的腔室也有较少的热质量，并且相较较厚的腔室，其温度循环更快和更有效。下面详细讨论了把所述系统和方法设置成降低背景信号水平的其他方式。
[0012]有一个或多个拷贝要检测的靶标核酸的样品加载到所述检测腔室中。所述扩增引物和标记探针与一个或多个靶标核酸拷贝杂交。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增至少一个或多个靶标核酸拷贝的一部分。所述扩增反应造成剪切标记探针，例如由于扩增酶的核酸酶活性。这造成标记探针片段的释放，其可以由所述阵列检测。所述标记的探针片段与高效阵列杂交(通常在进行一些扩增循环以扩增腔室中释放的探针片段数量之后)。然后检测标记探针片段和阵列结合生成的标记信号，从而检测所述靶标核酸。
[0013]能改变所述检测腔室的精确设置。选择所述设置以把腔室中的信号背景降低到接近阵列的程度。通常，腔室中至少1%并且经常约5%或更高的信号在阵列区域中的阵列中浓缩(如约6%、8%或甚至10%或更多)。尽管经常需要更低水平，总体信号99%或更少的背景能通过系统标准化。在本文所述常见实施方式中，通过把腔室优化设置成接近阵列的程度以达到95%或更小的背景水平。例如通过保持腔室厚度高于阵列最小值来实现这种设置优化。在典型实施方式中，所述腔室的厚度或其他接近阵列的尺寸小于约1_，更常见在至少一个接近阵列的尺寸上是约500 μ m或更小,优选约250 μ m或更小,例如约10 μ m_约200 μ m之间，并且在一些实施方式中，所述腔室接近阵列的尺寸是约150 μ m。在本文一个实施例中，所述腔室的厚度高于所述阵列约142μπι。在本文另一个实施例中，所述腔室厚度约100 μ m。相关腔室尺寸取决于检测系统中信号检测路径，例如当光通过阵列以生成所述信号时，其中一些光从阵列溢出并且进入阵列上的液体中，所述相关尺寸是阵列上腔室的厚度。除了降低要检测的背景信号的水平，降低腔室厚度也有降低背景噪音成分影响的优势，例如反应流体的阵列点信号和背景信号的特异性检测无关的检测器反应。特别地，一个主要的噪音来源是使用的检测器的散射噪音，其通常随着要检测的总信号量平方根而增加，所述平方根然后与所述反应器腔室的厚度相称。因而，通过降低反应腔室的厚度，降低背景噪音，并且随后增加整体系统的信号与背噪之比(signal to backgound noise ratio)(SNR)。其他可能的噪音来源包含检测过量的光，如未过滤的激发光、非预期的环境光、散射荧光、系统组分的自发荧光等。很多这种噪音来源可以通过传统方法减轻，例如通过使用合适的光学过滤器(如消除或降低过 量激发光)、在检测器上降低或防止环境光的封闭的光学系统、和通过设置阵列点的大小和位置以降低或消除检测器上的信号交互作用。在特别优选的方面，本发明所述测试方法和系统的SNR通常是2.5或更大，优选大于3、大于4、大于
5、大I于O,并且在一些不例中大于20或更大。
[0014]也能在与本发明装置和方法联用中使用设置本发明系统和方法以降低背景信号的替代或其他方法。例如，可以使用全内反射荧光显微术(“TIRF”)设置本发明装置和系统以向捕获阵列提供激发光照，其中激发光定位到捕获阵列下面的基材上，从而其全部内发射(见 M.Tokunaga 等，Biochem.and Biophys.Res.Comm.235, 47 (1997)和 P.Ambrose, Cytometry, 36，244(1999))。尽管如此，在阵列的基材一液体界面生成渐消波，所述渐消波离开表面后指数衰减，造成临近表面如IOOnm厚度的有效光照，在剩余溶液中没有激发的荧光团。
[0015]在另一个替代或其他方案中，设置本发明分析方法中使用的反应物以降低相对于实际探针/阵列结合信号的背景信号。例如，可以通过在捕获阵列探针和标记探针片段上使用协同荧光团(如FRET构建物)以降低背景信号。尤其是，有第一激发光谱和第一发射光谱的供体荧光团可以与捕获探针或标记的探针片段之一偶联。有与供体发射光谱重叠的激发光谱、并且不同于供体激发光谱的受体荧光团与其他探针偶联。当捕获探针和标记探针片段杂交时，所述供体和受体引入足够近的能量转移距离以生成响应受体荧光团发射光谱的不同的荧光信号。通过设置光学系统以仅在供体激发光谱中激发和过滤供体的发射光谱，能选择性检测杂交后从受体能量转移信号生成的信号。预先描述了各种FRET标记对(见例如Waggoner的美国专利号6，008，373和Lee等的7，449，298)。应理解，本发明中可以使用很多方法以降低相对于结合背景探针片段检测信号、反应溶液中未结合的完整标记探针信号或背景信号的影响，例如包含设置反应腔室以浓缩检测器焦平面内的信号，使用当与阵列结合对比溶液中未结合探针时有与不同发射光谱的交互式标记技术，或者当在相同完整探针中存在对比剪切探针片段中分离时有荧光降低的自体淬灭探针。
[0016]如所述，阵列通常包含非速率限制数量的与标记探针片段杂交的捕获探针。这意味着所述扩增反应在扩增中生成大量探针片段，造成了反应混合物中探针片段浓度不能满足阵列上可用于结合探针片段的位点数量(如可用的互补捕获核酸)。再次声明，阵列上结合位点的数目保持过量，并且优选过量很多，可以在扩增反应中生成的探针片段浓度中饱和。因为阵列上位点的数目是非速率限制性的，优化了阵列上探针片段与溶液中背景探针片段的比率。典型阵列密度是约350fmol/cm2或更大，如约2，000fmol/cm2或更大、
2,500fmol/cm2 或更大、3，OOOfmol/cm2 或更大、4，OOOfmol/cm2 或更大、4，500 f mo I/ cm2 或更大、或者5，OOOfmoVcm2或更大。在一些实施方式中，结合阵列上探针的位点数目是可以在扩增生成的探针片段浓度中饱和的位点数目的至少IX，并且可选5X、10X、50X或更多。所述比率可以随着扩增循环数目和生成的探针量而变化。所述阵列效率也是要捕获的探针片段长度的函数。尽管所述探针必需足够长以在杂交给定Tm下结合，更短片段通常显示更有效的杂交。通常阵列要捕获的探针片段长度是约50个核苷酸或更短；所述阵列包含对应互补捕获核酸序列的位点(所述捕获核酸也能可选包含其他序列，如表面上间隔互补位点，如降低表面影响的序列)。更典型地，所述探针和捕获序列长度是约40个核苷酸或更短，如长度约30、约20或约15个核苷 酸或更短。
[0017]在一些示例中，选择用于给定分析的所述捕获阵列探针和互补标记探针片段，从而提供了超过阵列所有数目的窄范围Tm。特别地，为了确保与捕获阵列的最优和稳定的杂交，给定阵列中所述捕获探针各自Tm是所述阵列其他成员的约10°C内，并且优选所述阵列的各自其他探针的约7°C、5°C或:TC内。这样窄的Tm范围使得稳定杂交，并且所得信号生成涵盖阵列的所有成员。
[0018]在典型实施方式中，所述杂交温度小于扩增反应的温度，所以所述捕获核酸的探针片段Tm能小于探针的分子内Tm (如当探针包含淬灭剂以降低背景时)，和/或低于靶标核酸探针的Tm。在典型热循环实施方式中，这是在高于杂交步骤的温度下进行的扩增反应；因此所述靶标核酸探针通常有比阵列探针片段更高的Tm。所述标记探针通常包含与所述靶标核酸不互补的第一正交折翼；所述折翼从所述标记探针上剪切下以生成标记探针片段。所述标记探针可选包含如偶联到淬灭剂部分的第二正交折翼，所述第二正交折翼至少与第一折翼部分互补(如提供第一折翼上标记的邻近淬灭)。当第二折翼结合第一折翼的Tm高于所述第一折翼结合阵列的Tm时，背景降低。在这种设置中，所述延伸反应在第一温度发生，即低于所述靶标核酸的完整探针的Tm，但是高于完整探针的分子内Tm和阵列上捕获探针的探针片段的Tm)。延伸后，随着反应温度降低，其低于探针的分子内Tm，使得形成所述探针的二级结构，并且造成荧光团的淬灭。再冷却到低于捕获探针的探针片段Tm，使得探针片段与阵列杂交，并且检测其相关的荧光团。因为所述完整探针先形成其二级结构，其较不可能结合到捕获探针或淬灭，因而降低了完整探针的非预期的捕获和溶液中完整探针上存在的荧光团的背景信号(或其可以结合到捕获探针阵列上)。尽管在某些方面，在本发明完整探针上使用淬灭剂，在某些实施方式中，令人惊讶地测定了所述探针上不需要淬灭剂，因为甚至当探针没有淬灭剂背景增加时，最优腔室设计和高效阵列能区分阵列信号和背景。
[0019]在其他实施方式中，设计或选择Tni高于延伸反应温度(如高10度或更多)的标记探针片段和其互补捕获核酸。因此，当例如在55° -60°C下进行延伸实验时，所述标记探针片段和捕获核酸的Tm通常是例如71°C。这种示例中，标记探针片段与阵列上捕获核酸的杂交在延伸反应相同温度下进行，避免了进一步降低温度以杂交所述阵列和检测所得信号的需要。结果，可以使用两步温度法而不是三步法。
[0020]在完整标记探针背景下，正交标记探针片段相对于结合靶标序列探针部分的方向是可以变化的。特别地，释放的标记探针片段可以与阵列上的捕获探针杂交，在所述杂交方向中从所述探针的靶标特异部分剪切的末端在捕获探针偶联到阵列表面位点的近端或远端。在一些示例中，例如通过确保任意完整探针仅结合到捕获探针上(所述结合方向使探针的靶标特异性部分朝向阵列表面)，然后可以利用与所述结合的潜在表面干扰以进一步降低所述阵列的完整探针不需要捕获的可能。这种方法在阵列上固体表面示例中特别有用，例如二氧化硅基材等。
[0021]根据耗材的精确设置，样品能以任意多种机制载入到腔室中。在一个方便应用中，通过与腔室可操作连通的至少一个舱门或流体通道来加载样品。例如，能在耗材顶表面制成舱门，所述舱门朝向所述腔室。这提供了例如通过移液管或其他液体递送装置的简化的加载。或者，流体或微流体通道、毛细管等能用于样品递送。
[0022]所述方法能用于检测样品中感兴趣核酸和/或如实时定量核酸。因此，一方面，在检测信号前多种扩增循环中可选扩增`所述靶标核酸，信号检测后即标记附加探针拷贝存在时再扩增靶标核酸部分。所得的释放标记探针片段然后与阵列杂交并且检测，检测的信号强度与样品中存在的靶标核酸的存在和/或数量相关联。通常，所述样品在起始检测前扩增多于I轮循环，以通过增加扩增释放的探针片段数量来增加信号水平。例如，阵列中检测信号前，所述靶标核酸能可选扩增至少如2、3、4、5轮或更多轮扩增循环。
[0023]所述标记探针通常包含荧光或发光标记，尽管也能使用其他标记例如量子点。在一个优选实施方式中，所述标记是荧光染料。所述探针片段生成的信号通常是光学信号。所述标记探针可选包含标记和标记淬灭剂；标记探针被切断造成所述标记和淬灭剂的分离，因而不淬灭所述标记。然而，如上述，在实践本发明中不需要淬灭剂。
[0024]信号通常通过检测对应探针或探针片段上光学标记的一种或多种光学信号波长来检测。因为阵列上探针片段的结合位点能用于区分不同探针，不需要在不同探针上使用不同标记以区分多重扩增反应中的探针(如果样品中存在多于一个靶标时，设计扩增多个靶标核酸的扩增反应)。然而，多个探针标记能用于增强多重能力。当使用多个探针时，检测信号检测能包含检测从多种不同标记生成的多种信号的多种光学信号波长(如不同探针上的不同荧光染料部分)。[0025]尽管通常与结合阵列的探针片段相连接的标记组(如标记探针片段)来描述，应理解可以使用不需要使用预先标记的探针的其他检测方案。例如，在一些实施方式中，可以使用插入染料。插入染料通常一旦整合到或插入到双链核酸上后提供检测信号事件。在本发明中，阵列上所述剪切探针片段与互补探针的杂交生成了阵列表面的双链体，所述双链体可以整合到插入染料上，并且提供指示杂交的独特信号。插入染料为本领域熟知，并且包含描述于如 Gudnason 等，Nucleic Acids Research, (2007),第 35 卷，第 19, el27 中的那些，其通过引用纳入本文以用于所有目的。相似地，尽管特别优选光学信号检测方法，所述探针设计和测试方法也可以通常使用非光学标记和/或检测方法进行，例如使用电化学检测方法，如ChemFETS、ISFETS等，可选与电化学标记基团联用，如有大带电基团以扩增探针片段与阵列探针在检测器表面或其附近杂交的检测。
[0026]能就阵列的一个或多个区域检测局部背景，信号强度测量值通过所述背景校正来标准化。通常，所述标准化的信号强度小于总体信号的10%，如总体信号的约1-约10%。在实施方式的一类示例中，所述标准化的信号强度是总体信号的约4-约7%。通常，当约1%或更多信号定位到阵列时，如当约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多信号定位到阵列上腔室区域，可以从背景中区分阵列信号。可能区分更低水平信号和背景，但是通常不优选这样。所述方法也能包含通过对阵列上捕获核酸点样差异(如通过校正点大小和/或点密度)、或对阵列不同区域的视野不等进行校正，来标准化信号强度。
[0027]本发明的优选方面是在样品中能同时检测多个靶标核酸。所述样品可以有一个或多个靶标核酸，所述阵列包含能在每个样品中检测多于一个靶标的多种捕获核酸类型。所述捕获核酸类型在阵列上空间分隔，不需要使用多个标记(尽管如上述能使用多个标记)。在多重方案中，各自对不同核酸靶标特异的多种扩增探针与样品一起孵育，所述样品能包含一个或多个靶标核酸。例如，能是约5-约100种或更多种捕获核酸类型。要检测的各潜在靶标也会使用不同的探针，如在扩增反应中可选约5-约100种或更多种标记探针类型，各自对潜在的感兴趣靶标特异。所述阵列包含对应的捕获核酸，如约5-100种或更多种捕获核酸类型。这使得由阵列检测和处理对应的大量信号。例如，探针片段和阵列杂交后，能根据阵列上信号位点检测约5-约100种或更多种不同的信号。应理解，通常在单个反应体积内多重的不同扩增反应的数目能 指示阵列上捕获探针类型的数目。然而，有较大数量不同捕获探针(如大于100、大于1000、10，000种或更多种捕获探针类型)的捕获阵列也能在一些情况中使用，例如当通过阵列调查等收集扩增反应。
[0028]本发明的优势是一种捕获阵列设置可以用于多种不同的靶标核酸序列组。特别地，第一组的探针组会包含探针，所述探针有对组中靶标特异的第一靶标特异性位点，和与捕获阵列上单个探针互补的第二捕获部分。第二个不同组的探针组(部分重叠或完全不同)会包含所述组的靶标特异性部分，而所述捕获部分与第一组探针组相同。再次声明，对任意靶标组而言，所述探针组包含用于所述组探针的半固定部分，所述部分总是与所述捕获阵列成员互补。所述探针也包含就靶标核酸特异组选择的可变部分。例如，在分析过程中，当第一组中各探针有对应捕获探针阵列上不同捕获探针的第一固定部分时，使用第一组探针。各探针也包含与第一组中给定靶标序列互补的靶标特异部分。就第二组而言，当所述组中各探针包含相同第一固定部分但是有对组中靶标特异的第二靶标特异部分时，使用第二组探针。[0029]参照图1A，标记探针的部分A对应可变部分，而部分B可以对应与阵列上探针互补的固定部分。使用通用的或常见的捕获阵列和捕获探针组使得生产本发明使用的耗材更有效并且成本更低。
[0030]因此，在一个样品包含多个靶标核酸的实施方式中，所述方法包含将各自对不同靶标核酸特异的多种标记探针与靶标核酸孵育。在扩增引物依赖的扩增反应中扩增至少一部分靶标核酸剪切多种靶标探针类型和释放多种标记探针片段类型。多种探针片段类型与阵列杂交。不同的探针片段类型各自分别与不同空间位置的捕获核酸类型杂交。检测标记信号包含检测来自多个不同空间区域的多种标记信号，所述多个不同区域分别对应阵列上不同空间位置的多种捕获核酸。可选地，在数个优选实施方式中，所述标记探针类型包含相同标记部分，但是其他多重和/或使用不同对照或对准(registration)探针能包含使用多种不同的标记部分。通常，所述多种标记探针类型能包含一种或多种不同的标记部分，不同标记部分的数目小于标记探针类型的数目。
[0031]进行所述方法的装置和系统是本发明的特性。所述装置和系统能包含在所述腔室的至少一个表面上包含至少一种高效核酸检测阵列的检测腔室。如方法所述，所述腔室的构造降低相对于阵列信号的背景信号。所述装置和系统通常包含操作性连接到检测腔室的热调节模块，其在装置运行中调节腔室内温度。光学系统检测所述装置运行中阵列生成的信号。
[0032]对所述装置可选应用参照方法所述的腔室降低背景的所有三维特性。例如，所述装置在至少一个纬度上靠近所述阵列且该纬度的厚度小于约500 μ m,如至少一个纬度上靠近所述阵列的厚度约IOym-约200μπι。所述阵列形成的腔室表面能由任意合适材料组成，例如陶瓷、玻璃、石英或聚合物。在如使用落射荧光的数个实施方式中，所述表面至少部分透明。
[0033]如方法所述，通常在装置操作中捕获核酸在阵列上以非速率限制性的密度存在。所述阵列可选包含多种捕获核酸类型，如定位在阵列不同空间区域上。例如，所述阵列上能存在5种或更多种不同捕获核酸类型，如多至约100种或更多种不同类型。所述捕获核酸可选偶联到腔室表面的热稳定涂层上，以帮助阵列的热循环。示例性涂层能可选包含:化学反应基团、未电基团、NHS酷、四氣苯基酷或五氣苯基酷、单硝基苯基酷或二硝基苯基酷、硫酷、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β_不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。
[0034]所述热调节模块可选包含帮助热循环的结构(feature),例如热电模块、Peltier装置、冷却风扇、散热器、设置成与所述腔室外表面部分配对的金属垫片。通常，所述热调节模块有反馈控制系统，所述系统操作性连接到计算机上，所述计算机控制模块或是模块的一部分。
[0035]所述光学系统能包含或操作性连接到落射荧光检测系统上。通常光学系统包含任意下列组件:激发光源、弧光灯、汞弧光灯、LED、透镜、光学过滤器、棱镜、相机、光检测器、CMOS相机、和/或CCD阵列。所述装置也能包含或偶联到阵列读数模块上，所述模块使阵列上信号与要检测的核酸相关联。
[0036]所述装置或系统包含或操作性连接到如在计算机或计算机可读介质中实施的系统指令。所述指令能控制所述装置和系统的任意方面，如信号强度的一种或多种测量与热调节模块进行的很多扩增循环相关联，以测定所述装置检测的靶标核酸的浓度。
[0037]系统能包含如操作性连接到计算机的所述装置。所述计算机包含控制热调剂模块进行的热循环并指明光学系统何时成像何时读图的指令，和/或把图片信息转化成时间函数的信号强度曲线，测定由所述装置分析的靶标核酸的浓度的指令等等。所述计算机能包含用背景信号强度标准化的指令，如就阵列的一个或多个区域检测局部背景，以及通过较正所述背景来标准化阵列信号强度测量值。相似地，所述计算机能包含通过对阵列上捕获核酸点样差异、或对阵列不同区域的视野不等进行校正，来标准化信号强度的指令。
[0038]所述发明一方面包含如与本发明装置和系统使用的核酸检测耗材，以用于实践本发明方法。所述耗材能包含例如小于约500 μ m厚度的薄腔室，其中所述腔室包含光学透明窗，所述窗在窗内表面设置有高效捕获核酸阵列。所述耗材也能包含与所述腔室流体相通的至少一个试剂递送端口。通常，所述耗材的构造使所述腔室中的流体热循环。
[0039]关于上述本发明的装置、系统和方法背景中阵列和腔室的所有特性也使用于耗材(并且反之亦然)。例如，所述核酸阵列能包含多种不同捕获核酸类型，所述类型位于阵列的不同空间区域上。捕获核酸的密度能是约例如2，000fmol/cm2或更大、2，500fmol/cm2或更大、3，OOOfmol/cm2 或更大、4，OOOfmol/cm2 或更大、4，500fmol/cm2 或更大、或者 5，OOOfmol/cm2或更大。
[0040]相似地，所述腔室能包含含有试剂递送端口的第一上表面，和含有所述窗的底部透明表面，例如其中所述顶表面和底表面通过压敏粘合材料形成的侧壁结合。也能使用结合顶表面和底表面以形成腔室的其他结构。例如，所述顶表面和底表面能通过上表面和/或下表面上的衬垫或特形结构结合。所述衬垫或结构可选融合或附着到上表面和/或下表面上的相应区域。在一些实施方式中，所述衬垫或结构指导UV可固化粘合剂的流动，所述粘合剂在上表面和下表面之间流动，并且接受UV光，因而使所述上表面和下表面彼此结合。在其他实施方式中，所述 上表面和下表面能超声融合在一起，所述衬垫或结构划定融合区域的界限。在另一个实施例中，所述结构是上表面或下表面上的透明区域，和关联的上表面或下表面上的对应阴影区域。在这个实施方式中，所述上表面或下表面能通过指导激光通过透明区域并且到阴影区域的激光焊接在一起。
[0041]所述捕获核酸阵列通常偶联到窗口的热稳定涂层上。例如，所述涂层能可选包含:化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。所述窗本身能包含例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。
[0042]关于上述方法、系统和装置的所有特性能应用于设置耗材中所述腔室。例如，所述腔室厚度能是约10 μ m -约200 μ m,如厚度约140 μ m。所述腔室的其他尺寸更宽得多，如平均直径约Imm-约50mm。在一个特定实施方式中，所述腔室的平均直径约IOmm-约20mm。
[0043]本发明包含试剂盒，所述试剂盒如包含本发明的耗材。所述试剂盒也能包含包装材料、实施所述方法的说明书、对照试剂(如结合到耗材阵列的对照位点上的如对照模板、探针或引物)。[0044]所述方法、系统、装置、耗材和试剂盒也可以组合使用以实施本发明的方法，如所述试剂盒提供了在本发明系统或装置中使用的耗材。除非另有表述，本发明步骤可选有所述系统、装置、耗材或试剂盒中相应的结构特性，并且反之亦然。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1A和IB是本发明PCR探针的示意图。
[0046]图2是本发明PCR腔室的示意图。
[0047]图3显示了三步扩增反应的拷贝数目滴定的基于阵列的实时PCR曲线。
[0048]图4显示了溶液等分试样生成的基于溶液的实时PCR曲线。[0049]图5显示了未淬灭探针生成的基于阵列的实时PCR曲线。
[0050]图6显示了多重扩增的实时PCR曲线。
[0051]图7显示了没有靶标加入的10重反应的基于阵列的实时PCR曲线。
[0052]图8显示了在各自IO4个拷贝上存在的10重的组和3个靶标的基于阵列的实时PCR曲线。
[0053]图9显示了 5’折翼模拟杂交的实时动力学。
[0054]图10是方法示意图。
[0055]图11是系统示意图。
[0056]图12显示了两步扩增反应的拷贝数目滴定的基于阵列的实时PCR曲线。
[0057]图13显示了反应腔室厚度跟信号一背景比的关系。
[0058]图14显示了本发明的移动基材实施方式的整体检测系统。
[0059]发明详述
[0060]进行靶标核酸扩增、检测和实时定量的方法是本发明的特性。在所述方法中，靶标核酸的扩增释放与阵列杂交的靶标特异性标记的探针片段；当发生扩增时，所述阵列在腔室中分布。从所述阵列检测信号，提供了靶标核酸的检测和实时定量。
[0061]本发明也提供了反应腔室，通常的形式是腔室中包含核酸检测阵列的耗材，以及与所述耗材相互作用的装置和系统。
[0062]方法
[0063]本发明提供了在样品中实时检测和定量一个或多个靶标核酸的方法。所述方法高度适合多重技术，相较使用可用的溶液实时核酸检测方法所获得，所述方法使得用一个腔室反应和检测而特异性检测和定量更大量的不同靶标核酸。这是因为本发明使用基于阵列来检测分析物(所述阵列与所述分析物接触)，而不是溶液相光谱检测。相较于区分如溶液中的不同染料标记，通过阵列位点区分的核酸检测阵列溶解分析物的能力显著更强。通过比较，可能构建同时检测数千种不同分析物的阵列，而通常不可能检测溶液中多于约5种不同标记的荧光团。
[0064]图10提供了所述方法的部分概述。如所示，引物与模板、标记探针一起杂交。所述探针包含与所述模板(“折翼”)不互补的、偶联到标记部分的正交序列。所述探针在扩增反应中被剪切(如PCR扩增循环)。在一个便利方法中，聚合酶的天然核酸酶活性用于剪切所述折翼一在这个方法中，通过聚合酶的引物延伸造成由于聚合酶的核酸酶活性而剪切折翼，因为其遇到了折翼和模板之间的连接。这释放折翼作为标记探针片段，其然后再与阵列杂交，如通过把温度调整到适合特异性杂交的条件。阵列上标记的检测提供了对模板的实时检测和定量。
[0065]通常，对要测试一个或多个靶标核酸是否存在的样品进行扩增反应。所述反应能易于用多重技术以在单个反应腔室中扩增、检测和定量约10-约100种或更多种不同核酸。例如，单个扩增/检测腔室中能检测约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100种或更多种核酸。本文下面显示了在反应/检测腔室中同时扩增、检测和定量10种不同靶标核酸的工作实例。这个实施例和本方法的容量超过传统空间限制的、基于溶液多重检测的容量。
[0066]在这个方法中，要检测的各靶标核酸使用至少一种、并且通常两种扩增引物来特异性扩增(与单个引物相比，使用两种引物增加反应的特异性，并且加速产物形成速率)。所述引物通常在样品中与靶标核酸特异性杂交，并且使用聚合酶如在标准聚合酶链反应(PCR)中延伸。按照已知方法来设计和构建能用于扩增感兴趣靶标核酸的扩增引物。关于PCR 引物设计的细节，见例如 Anton Yuryev (编者)(2007) PCR Primer Design (Methods inMolecular Biology) [PCR引物设计(分子生物学方法)][精装书]Humana出版公司?’第I版，ISBN-10:158829725X, ISBN-13:978-1588297259,以及下面引用的参考文献。
[0067]在靶标核酸上使用引物的PCR扩增能使用合适的反应条件进行，所述条件包含使用标准的扩增缓冲液、酶、温度和循环次数。对PCR技术的综述，包含杂交条件、缓冲液、试剂、反应循环次数等，见例如Yuryev (如上)，van Pelt-Verkuil等，(2010)Principlesand Technical Aspects of PCR Amplif ication (PCR 扩增的原理和技术方面)Springer出版社；第 I 版，ISBN-10:9048175798, ISBN-13:978-9048175796 ;Bustin (编)(2009) ThePCR Revolution:Basic Technologies and Applications (PCR 革命:基本技术和引用)，剑桥大学出版社(Cambridge University Press);第 I 版，ISBN_10:0521882311, ISBN-13:978-0521882316;Viljoen 等，(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook (分子诊断PCR 手册)，Springer 出版社，IS`BN1402034032; Kaufman 等，(2003) Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine (生物学和医学中分子和细胞方法手册)第 2 版，Ceske (编)CRC 出版社(Kaufman) ; The Nucleic Acid Protocols Handbook(核酸方法手册)Ralph Rapley(编)(2000)冷泉港实验室出版社，Humana出版社公司(Rapley) ; Chen 等(编)PCR Cloning Protocols (PCR 克隆方案)，第 2 版(Methods inMolecular Biology(分子生物学方法)，第 192 卷)Humana 出版社；PCR Protocols A Guideto Methods and Applications (PCR方案:方法和应用手册)(Innis等编)，加利福尼亚州圣地亚哥市学术出版社公司(1990) (Innis)。可用于实时PCR方法的扩增条件、引物设计和其他细节描述于例如 Logan 等(编者)(2OO9) Real-Time PCR:Current Technology andApplications (实时PCR:现有技术和应用)，Caister学术出版社，第I版，ISBN-10:1904455395，ISBN-13:978-1904455394,和 MTevf ikDorak (编者)(2006) Real-time PCR (AdvancedMethods)(实时 PCR (高级方法))TF 公司(Taylor&Francis)，第 I 版，ISBN-10:041537734XISBN-13:978-0415377348。
[0068]样品中对各靶标核酸特异的标记探针与扩增引物和靶标核酸一起杂交。所述扩增反应剪切模板-杂交标记探针以释放标记探针片段。这种标记片段然后在反应腔室中与阵列杂交，如图10所示。[0069]图1A显示用于本发明方法的探针。所述探针包含与靶标核酸互补的区域A。所述探针也包含与所述IE标核酸不互补的“折翼”B。标记E连接到折翼B上。在末端显示标记E,但是所述标记实际上能在折翼B的任何位点上存在(format)。例如,任意各种核苷酸能被标记，并且用于标准或稍微改良的核酸合成方法中以提供探针任意所需位点上的标记。
[0070]图1A中，包含标记淬灭剂D的可选区域C与折翼B的部分互补。在合适的溶液条件下，区域C与折翼B碱基配对，把标记E引入到淬灭剂D附近，因而淬灭标记E。这降低了反应/检测腔室中的溶液相的信号背景，但是探针淬灭对本发明实践不是必需的。本发明一个令人惊讶的方面是能特异性检测结合到阵列的探针片段，甚至当接近阵列的溶液有未淬灭的探针时。本文描述了这个实施方式的一个工作实施例。通常，反应/检测腔室中使用设置降低溶液相背景的高效阵列使得在本发明的方法、耗材、装置和系统的溶液中区分阵列信号和信号背景。
[0071]根据实验设置，各种不同标记基团能用于标记标记探针。如上述，这种标记通常包含荧光标记基团，所述荧光标记基团可以包含单个荧光团或相互作用的染料对或组,如FRET对，以及供体/淬灭剂对。合适于标记核酸探针的不同突光标记基团的范围描述于Molecular Probes Handbook (分子探针手册)，第11版(生命技术公司(LifeTechnologies, Inc.))。
[0072]尽管本文很多讨论是关于PCR扩增，但是能应用到其他扩增。例如，能使用涉及与扩增反应偶联的剪切反应的多酶系统，例如包含易剪切切断的键(参见例如 US 5, Oil, 769;US 5, 660, 988;US 5, 403, 711 ;US 6, 251, 600)和叉状核酸结构(US
7,361, 467;US 5, 422, 253;US 7, 122, 364;US 6，692，917)的那些。也能使用与 TaqMan 样剪切偶联的解旋酶依赖性扩增(Tong，Y等，2008BioTechniques45:543-557)。能使用核酸序列扩增(NASBA)或连接酶链反应(LCR)。在NASBA方法中，所述探针能与PCR中的模板、扩增引物一起杂交。所述探针能通过逆转录酶的核酸酶活性或加入的内切核酸酶剪切，以与PCR中聚合酶释放相似的 方式释放探针片段。NASBA的一个潜在优势是不需要热循环。这简化了整体装置和系统需要。对NASBA的描述见例如Compton (1991)，" Nucleicacid sequence-based amplification(基于核酸序列的扩增)"Nature350 (6313): 91 - 2。对使用NASBA检测例如致病性核酸，参见例如Keightley等，(2005) “Real-time NASBAdetection of SARS-associated coronavirus and comparison with real-time reversetranscription-PCR (实时NASBA检测SARS相关的冠状病毒及与实时逆转录PCR的比较)”Journal of Medical Virology77 (4): 602 - 8。当使用LCR类型反应时,探针能使用内切核酸酶剪切，而不是依赖于扩增酶核酸酶活性的剪切。
[0073]本文所述方法中，提供了在所述腔室的至少一个内表面上有至少一种高效核酸检测阵列的检测腔室。所述高效阵列通常以非速率限制数量捕获核酸，这使得在腔室中扩增反应生成的有效捕获探针片段。设置所述捕获核酸以捕获相对小的探针核酸，这也增加了阵列效率。设置所述腔室以把信号背景降低到接近所述阵列，如通过使所述腔室成形以降低背景。例如，通过使得腔室薄(浅)到靠近所述阵列(如上面或下面)来降低背景；如所述腔室通常在所述阵列上面或下面约500 μ m或更薄，尽管也能使用腔室中深至Imm或更深的检测。关于所述方法使用的耗材，下面描述了反应腔室和阵列的其他细节。
[0074]检测阵列捕获的信号，并且测量信号强度。信号强度与样品中的靶标核酸的存在和/或数量相关联。通常，所述样品在起始检测前扩增多于I轮循环，以通过增加扩增释放的探针片段数量来增加信号水平。例如，阵列中检测信号前，所述靶标核酸能可选扩增至少如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多轮扩增循环。
[0075]在一个典型实施方式中，扩增反应中，在选定的时间、温度和扩增循环间隔从阵列捕获荧光或其他光学图像。分析这些图像以测定靶标核酸是否在样品中存在，并且提供样品中起始靶标核酸浓度的定量。结合使用平均灰度强度测量值、背景校正和基线调整来分析图像。在所述阵列中对各个点局部测量背景。通过测量感兴趣阵列区域(如阵列点)周围溶液的同心环的图像强度来计算背景。然后校正各个区域的信号以计算所述区域的局部背景。还能标准化各个区域的校正信号以计算点以及视野的不均匀光照中的变化。从第一组循环(通常5-15轮循环)中获得的校正强度测量值的平均用于调整基线和标准化各个区域的测量。
[0076]关于基于扩增后信号强度测量值定量核酸方法的其他细节可以在如上面部分所述的参考文献和 Jang B.Rampal (编者)(2010)Microarrays(微阵列):第 2卷,Applicationsand Data Analysis (应用和数据分析)(Methods in Molecular Biology (分子生物学方法))Humana 出版社；第 2 版，ISBN-10:1617378526, ISBN-13:978-1617378522; StephenA.Bustin (编者)(2004) A-Z of Quantitative PCR (定量 PCR 大全)(IUL Biotechnology(IUL 生物技术)，第 5 卷)(IUL 生物技术系列)International University Line;第 I 版，ISBN-10:0963681788, ISBN-13:978-0963681782 ；和 Kamberova 和 Shah (2002)DNA ArrayImage Analysis:Nuts&Bolts (DNA 阵列图像分析:螺母和螺栓)(Nuts&Bolts series (螺母和螺栓系列))DNA 出版社?’第 2 版，ISBN-10:0966402758, ISBN-13:978-0966402759 中找到。
[0077]在其他设置中，所述捕获探针可选偶联到移动基材(例如珠、树脂、颗粒等(本文通常与“珠”互换))，而不是静态基材。例如，如本文其它地方所述，平面基材可以用于提供阵列捕获探针，所述阵列捕获探针与扩增样品材料中一个或多个靶标核酸系列生成的剪切探针片段杂交。通过检测阵列上哪个捕获探针位点与探针片段杂交来检测给定靶标核酸系列的存在。因为各探针片段对特定靶标序列特异，如果所述探针片段存在，其指示所述靶标存在并且扩增。在移动相基材中，给定分析中各个不同类型的捕获探针偶联到也带有单个标记的不同移动基材上。所述移动基材然后通过检测通道以鉴定珠和隐含地鉴定捕获探针，并且鉴定所述标记探针是否存在。如果在对应特定捕获探针的给定珠上检测所述标记探针，其指不了与探针片段(和互补捕获探针)相关联的祀标序列在样品中存在并且扩增。本发明的这个方面可以在如完成整体扩增反应的终点检测中使用，但是也可以在定量分析中使用，如一个或多个扩增循环后用虹吸管从扩增混合物中吸出珠部分，和从珠上测量标记探针片段信号强度。
[0078]给定珠上的捕获标记探针片段的浓度提供了检测通道中足够高的信号一背景比，从而不需要把反应混合物与珠分离开。另外，有阵列基材时，在完整探针和/或可选淬灭基团中包含二级结构使得不论是在溶液中还是无意结合到移动基材上，更能区别探针片段和完整探针背景信号。在一些示例中，也期望完整探针二级结构的特性以在移动基材上结合捕获探针时生成位阻，造成在一些示例中完整探针结合珠的可能性降低。
[0079]多种不同珠类型可以与本发明这个方面联用。例如，可以使用聚苯乙烯、纤维素、丙烯酸、乙烯、二氧化硅、顺磁或其他无机颗粒、或任意各种其他类型的珠。如所述，珠通常用独特标记特征分别标记。再者，可以使用多种不同标记类型，包含有机荧光标记、无机荧光标记(如量子点)、发光标记、电化学标记等。大量的这种标记市售可得，并且设置成易于偶联到合适的活性珠上。在荧光标记基团的示例中，可以通过不同结合2、3、4种或更多种不同空间荧光标记基团和不同水平的各种标记以提供大量的标记特征，从而提供不使用宽的激发辐射光谱就能提供宽范围的单个标记特征，如多重激光。
[0080]所述方法通常使用装置、系统、耗材和试剂盒来进行。能提供所述装置、系统和耗材的所有特性以实践本文所述方法，并且本文所述方法能与所述装置、系统、耗材和试剂盒联用。
[0081]耗材
[0082]设置本发明的单罐式反应腔室以降低信号背景。在所述腔室的至少一个内表面上形成高效阵列。在所述方法的扩增和阵列杂交步骤中，所述阵列通常与扩增反应剂和产物接触。这使得用户进行一次或多次扩增反应循环，通过实时监测阵列信号来检测结果，并且然后进行一次或多次附加的扩增反应，再检测。因此，阵列的信号强度可以用于实时检测和定量感兴趣核Ife。
[0083]本发明的耗材包含腔室和所述腔室内表面上的高效阵列。所述腔室通常较薄(浅)，如厚度小于约1_。通常，腔室越薄，阵列上的溶液越少，这降低了溶液中标记探针或探针片段的信号背景。通常所需的腔室厚度的范围是约I μ m -约500 μ m。就耗材生产的容易性而言，所述腔室在阵列上的厚度范围通常是约IOym-约250 μ m，如厚度约IOOym-约150 μ m。所述腔室能包含有试剂递送端口的表面，例如通过手工或自动移液器递送样品。
[0084]图2提供了示例性耗材 的放大(blow-up)图。在这个实施例中，底表面层I和上表面层2通过中间层3结合。在组装层1、2和3后切口 4形成腔室。端口 5形成便利通道以把缓冲液和试剂递送到组装成的腔室中。能在所述区域的顶层或底层形成高效阵列，所述区域形成切口的顶表面或底表面。在一个便利实施方式中，当落射荧光检测用于检测结合到阵列的标记时，底表面上制成阵列，设置所述耗材以通过定位在本发明装置和系统底表面下面的检测光学器来观察。通常，顶表面和/或底表面会包含窗口，通过窗口检测光学器能观察到阵列。
[0085]中层3能根据要使用方法组装的耗材采用任意各种形式。在一个便利实施方式中，顶表面或底表面I和2通过压敏粘合材料形成的层3来结合。压敏的粘合层(如带)熟知并且广泛可用。参见例如Benedek和Feldstein (编者)(2008)Handbook of Pressure-Sensitive Adhesives and Products (压敏粘合剂和产品手册):卷 I !Fundamentals of Pressure Sensitivity (压敏的基本原理)，卷 2 !Technologyof Pressure-Sensitive Adhesives and Products (压敏粘合剂和产品技术)，卷 3:Applications of Pressure-Sensitive Products(压敏产品的应用)，CRC 出版社；第 I 版,ISBN-10:1420059343，ISBN-13:978-1420059342。
[0086]也能使用结合上表面和底部表面以形成腔室的其他制造方法。例如，所述上表面和底部表面能通过上表面和/或下表面上的衬垫或特形结构结合。所述衬垫或结构可选融合或附着到上表面和/或下表面上的相应区域。硅和聚合物芯片制造方法能用于形成顶表面或底表面的结构。对结构制造(包含微结构制造)方法的介绍，参见例如Franssila (2010)Introduction to Microfabrication (微制造介绍)，Wiley 出版社；第 2 版，ISBN-10:0470749830，ISBN-13:978-0470749838 ;Shen 和 Lin (2009) “Analysis of mold insertfabrication for the processing of microfluidic chip(用于微流体芯片处理的模塑插入制造的分析)”聚合物工程和科学出版社，塑料工程协会公司(Polymer Engineering andScience Publisher: Society of Plastics Engineers, Inc.),卷 49,第 I 期,第 104 (11)页；Abgrall (2009)Nanofluidics (纳米流体)ISBN_10:159693350X, ISBN-13:978-1596933507;Kaajakari(2009)Practical MEMS:Design of microsystems, accelerometers, gyroscopes, RF MEMS, optical MEMS, and microf luidic systems (实践 MEMS:设计微系统、加速度计、陀螺仪、RF MEMS、光学MEMS和微流体系统)，小齿轮出版社(Small Gear Publishing),ISBN-10:0982299109, ISBN-13:978-0982299104;Saliterman(2006)Fundamentals ofBioMEMS and Medical Microdevices (BioMEMS 和医学微型装置的基本原理)，SPIE 出版社，ISBN-10:0819459771，ISBN-13:978-0819459770;Madou(2002)Fundamentals ofMicrofabrication:The Science of Miniaturization (微制造的基本原理:小型化的科学)，第 2 版，CRC 出版社；ISBN-10:0849308267, ISBN-13:978-0849308260。这些制造方法能用于基本形成顶表面或底表面所需的任意结构，而不需要中间层。例如，在所述顶表面和/或底表面形成降低，并且所述两个层结合，因而形成所述腔室。
[0087]在一些实施方式中，所述衬垫或结构指导UV或可辐射固化的粘合剂的流动。这种粘合剂在上表面和下表面之间流动，并且接受UV光或辐射(如电子束或“EB”辐射)，因而使上表面和下表面彼此结合。可用的粘合剂(包含UV和可辐射固化的粘合剂)的描述，参见例如 Ebnesaj jad (2010) Handbook of Adhesives and Surface Preparation: Technology,Applications and Manufacturing (粘合剂和表面制备手册:技术、应用和生产),威廉姆斯安德鲁出版社(William Andrew);第 I 版，ISBN-10:1437744613, ISBN-13:978-1437744613;Drobny (2010) Radiation Technology for Polymers (聚合物的福射技术)，第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，I SBN-10:1420094041, ISBN-13:978-1420094046。
[0088]在其他实施方式中，所述上表面和下表面能超声融合在一起，所述衬垫或表面结构划定耗材中融合和要生产腔室或其他构造结构的区域。用于融合材料的超声焊接和相关技术在例如 Astashev` 和 Babitsky (2010)，Ultrasonic Processes andMachines: Dynamics,Control and Applications(Foundations of EngineeringMechanics)(超声处理和机械:动力学、控制和应用(工程机械的基础))，Springer出版社；第 I 版，ISBN-10:3642091245, ISBN-13:978-3642091247 ;和 Leaversuch (2002) “Howto use those fancy ultrasonic welding controls (怎样使用那些奇特的超声焊接控制)” Plastics Technology48 (10):70-76 中讲述。
[0089]在另一个实施例中，所述结构是上表面或下表面上的透明区域，和关联的上表面或下表面上的对应阴影区域。在这个实施方式中，所述上表面或下表面能通过指导激光通过透明区域并且到阴影区域的激光焊接在一起。激光焊接方法在例如Steen等，(2010)Laser Material Processing (激光材料处理)Springer 出版社；第 4 版,ISBN-10:1849960615, ISBN-13:978-1849960618 ；Kannatey-Asibu(2009)Principles of Laser MaterialsProcessing (Wiley Series on Processing of Engineering Materials)(激光材料处理原理(Wiley 工程材料处理系列))，Wiley 出版社，ISBN-10:0470177985, ISBN-13:978-0470177983 ;和 Duley (1998) Laser Welding (激光焊接)韦利科学公司，ISBN-10:0471246794，ISBN-13:978-0471246794 中讲述。
[0090]所述捕获核酸阵列通常偶联到窗口的热稳定涂层上。所述窗本身能包含例如玻璃、石英、陶瓷、聚合物或其他透明材料。可用适用于涂层所述窗的多种涂层。通常，基于以下因素选择涂层:与阵列基材的相容性(如阵列连接的腔室表面是玻璃或者聚合物)，衍生或处理以包含合适连接阵列成员的活性基团的能力，和与处理条件的相容性(如热稳定性、光稳定性等)。例如，所述涂层能可选包含:化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。对表面涂层和其用于生物分子和表面连接的描述，参见例如Plackett (编者)(2011)Biopolymers:New Materials for Sustainable Films and Coatings (生物聚合物:可持续膜和涂层的新材料)，Wiley 出版社，ISBN-1O:0470683414，ISBN-13:978-0470683415 ；Niemeyer (编者)(2010)，Bioconjugation Protocols: Strategies and Methods (Methodsin Molecular Biology)(生物偶联方案:策略和方法(分子生物学方法))，Humana出版社；第 I 版，ISBN-10:1617373540, ISBN-13:978-1617373541 ；Lahann(编者)(2009)，ClickChemistry for Biotechnology and Materials Science (生物技术和材料科学的点击化学)，Wiley 出版社，ISBN-1O:0470699701, ISBN-13:978-0470699706 ；Hermanson(2008),Bioconjugate Techniques (生物偶联技术),第2版,学术出版社；第2版,ISBN-10:0123705010，ISBN-13:978-0123705013 ;Wuts 和 Greene (2006)Greene' s Protective Groupsin Organic Synthesis (有机合成中的保护基团)，韦利科学公司(Wiley-1nterscience);第 4 版，ISBN-10:0471697540，#ISBN-13:978-0471697541 ；ffittmann(编者)(2006)，Immobilisation of DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(芯片上DNA 的固定II (现代化学专题)),Springer 出版社，第 I 版，ISBN-10:3540284362, ISBN-13:978-3540284369 ；Licari (2003),Coating Materials for Electronic Applications:Polymers, Processing, Reliability, Testing(Materials and Processes for Electronic Applications)(电子应用的涂层材料:聚合物、处理、可靠性、测试(电子应用的材料和处理))，威廉姆斯安德鲁出版社，ISBN-10:0815514921, ISBN-13:978-0815514923 ；Conk(2002), FabricationTechniques for Micro-Optical Device Arrays Storming Media(微型光学阵列基质的制造技术)，ISBN-10:1423509641, ISBN-13:978-1423509646,以及石油和颜色化学协会(Oiland Colour Chemists ' Association) (1993), Surface Coatings-Raw materials andtheir usage (表面涂层-原材料及其应用),第3版,Springer出版社；第3版，ISBN-10:0412552108，ISBN-13:978-0412552106。
[0091]生成核酸阵列的方法可用，并且能通过形成内腔室表面来适应本发明。能用于在内腔室表面形成阵列的核酸微阵列形成技术描述在，例如Rampal (编者)，Microarrays: Volume 1: Synthesis Methods (Methods in Molecular Biology)(微阵列:卷1:合成方法(分子生物学方法))，Humana出版社；第2版，ISBN-10:1617376639, ISBN-13:978-1617376634 ;Miiller 和 Nicolau (编者)(2010), Microarray Technology and ItsApplications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(微阵列技术及其应用(生物和医学物理、生物医学工程))，Springer出版社?’第1版，ISBN-1O:3642061826，ISBN13:978-3642061820 ；Xing 和 Cheng (编者)(2010) Biochips: Technology andApplications (Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering)(生物芯片:技术和应用(生物和医学物理、生物医学工程))，Springer出版社?’第I版，ISBN-10:3642055850, ISBN-13:978-3642055850 ;Dill 等(编者)(2010)Microarrays:Preparation, Microfluidics, Detection Methods, and Biological Applications (Integrated AnalyticalSystems)(微阵列:制备、微流体、检测方法和生物应用(集成分析系统))，Springer出版社，ISBN-10:1441924906，ISBN-13:978-1441924902 ；Whittmann (2010)Immobilisationof DNA on Chips II (Topics in Current Chemistry)(芯片上 DNA 的固定 II (现代化学专题))，Springer 出版社；第 I 版，ISBN-10:3642066666, ISBN-13:978-3642066665 ；Rampal(2010), DNA Arrays:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(DNA阵列:方法和方案(分子生物学方法))，Humana出版社；第I版，ISBN-10:1617372048，ISBN-13:978-1617372049 ；Schena (作者，编者)(2007)，DNA Microarrays (MethodsExpress) (DNA 微阵列(方法快报))，Scion 出版社；第 I 版，ISBN-10:1904842151, ISBN-13:978-1904842156 ;Appasani (编者)(2007) ,Bioarrays = From Basics to Diagnostics (生物阵列:从基础到诊断)，Humana 出版社?’第 I 版，ISBN-10:1588294765, ISBN-13:978-1588294760 JPUlrike Nuber (编者)(2007), DNA Microarrays (Advanced Methods) (DNA 微阵列(高级方法))TF 公司(Taylor&Francis), ISBN-10:0415358663, ISBN-13:978-0415358668。把DNA连接到表面以形成阵列的技术能包含任意各种点样方法、使用化学反应表面或涂层、光导向的合成、DNA印刷技术、和很多本领域可用的其他方法。
[0092]定量阵列密度的方法在上面引用的参考文献以及Gong等，(2006) “Mult1-technique Comparisons of Immobilized and HybridizedOligonucleotide Surface Density on Commercial Amine-Reactive Microarray Slides(商业胺反应性微阵列载玻片上固定和杂交寡核苷酸表面密度的多技术比较)”Anal.Chem.78:2342-2351 中描述。
[0093]所述耗材能在容器中包装，或包装材料以形成试剂盒。所述试剂盒也能包含用于使用所述耗材的组分，所述耗材例如对照试剂(如对照模板、对照探针、对照引物等)、缓冲液等。
[0094]装置和系统
[0095]使用所述耗材和/或实践本发明方法的装置和系统也是本发明的特性。所述装置和系统能包含所述耗材的特性，例如反应腔室和阵列(以耗材形式或者装置的专用部件)。最典型的，所述装置通常有接收器如安置上述耗材平台(stage)，以及监测阵列的监测光学器，热循环腔室的模块，和有控制热循环、监测和信号后处理的系统指令的计算机。
[0096]系统的示意图示于图11。如所示，耗材10安置在平台20上。环境控制模块(ECM) 30 (如包含Peltier装置，冷却风扇等)提供环境控制(如温度的热循环)。通过光源40 (如灯、电弧灯、LED、激光等)提供照明光。光学系统50把光从光源40导向耗材10。耗材10的信号通过光学系统监测，并且信号信息传递给计算机60。计算机60也可选控制ECM30。信号信息能通过计算机60来处理，并且输出给用户可见的显示器70和/或打印机。ECM30能安置在耗材10的上面或下面，并且能包含其他可见光学器80 (位于平台20的上面或下面)。
[0097]设置所述平台/接收器以安置用于热循环和分析的耗材。所述平台能包含与对应的耗材特性件紧密配合的对准(registration)和比对结构,例如比对臂、扳手、孔、栓等。所述平台能包含接收和定向所述耗材的盒，使其置于与其他装置元件的可操作连接中，尽管其在很多实施方式中不是必需的，如当所述耗材直接安置在平台上时。设置装置元件以操作耗材，并且装置元件包含递送缓冲液和试剂到耗材的流体递送系统、热循环或其他温度控制或环境控制模块、检测光学器等。在所述腔室置于装置而不是整合到耗材的实施方式中，通常设置所述装置元件以在腔室上或接近腔室处操作。
[0098]流体递送到耗材能通过所述装置或系统来完成，或能在把耗材加载到所述装置或系统前来进行。流体处理元件能整合到所述装置或系统上，或能配置(format)成从所述装置或系统分开的单独处理器。流体处理元件能包含把试剂或缓冲液递送(手工或自动)到耗材中端口的移液器，或能包含毛细管、微制造的装置通道等。能用于加载所述耗材的手工和自动移液器和移液器系统从各种来源广泛可用，包含赛默科技公司(ThermoScientific)(美国)、Eppendorf公司(德国)、Labtronics公司(加拿大)等。一般说，可用各种流体处理系统，并且能整合到本发明的装置和系统中。参见例如Kirby (2010)，Micro-and Nanoscale Fluid Mechanics: Transport in Microfluidic Devices (微米级和纳米级流体力学:微流体装置中的运输)，ISBN-10:0521119030, ISBN-13:978-0521119030 ；Bruus (2007), Theoretical Microfluidics(Oxford Master Series in Physics)(理论微流体(牛津物理大师丛书)，美国牛津大学出版社，ISBN-10:0199235090, ISBN-13:978-0199235094 ；Nguyen(2006), Fundamentals And Applications of Microfluidics (微流体的基础和应用)，第2版，(Integrated Microsystems (整合的微系统))，ISBN-10:1580539726，ISBN-13:978-1580539722 ;Wells(2003)，High Throughput Bioanalytical SamplePreparation:Methods and Automation Strategies(Progress in Pharmaceutical andBiomedical Analysis)(高通量生物分析样品制备:方法和自动策略(药学和生物医药分析中的进展))，埃尔斯威尔科学公司；第 I 版，ISBN-10:044451029X, ISBN-13:978-0444510297。所述耗材可选包含设置成与所述递送系统紧密配合的端口，如通过移液器或毛细管递送装置加载的合适尺寸的端口。
[0099]所述ECM或热调节模块能包含帮助热循环的结构，例如热电模块、Peltier装置、冷却风扇、散热器、设置成与所述腔室的外表面部分配对的金属垫片、流体浴等。很多这种热调节组件可用于整合到本发明的所述装置和系统中。参见例如Kennedy和Oswald (编者)(2011), PCR Troubleshooting and Optimization:The Essential Guide (PCR 问题解决和优化:基本手册)，Caister 学术出版社，ISBN-10:1904455727; ISBN-13:978-1904455721 ；Bustin (2009), The PCR Revolution:Basic Technologies and Applications (PCR 革命:基本技术和应用)，剑桥大学出版社；第I版，ISBN-10:0521882311, ISBN-13:978-0521882316 ;Wittwer 等(编者)(2004), Rapid Cycle Real-Time PCR-Methods and Applications(快速循环实时PCR方法和应用)，Springer出版社；第I版，ISBN-10:3540206299，ISBN-13:978-3540206293;Goldsmid(2009)Introduction to Thermoelectricity(Springer Seriesin Materials Science)(热电性介绍(Springer材料科学系列))，Springer出版社；第I版，ISBN-10:3642007155, ISBN-13:978-3642007156 ;Rowe (编者)(2005) ThermoelectricsHandbook:Macro to Nano (热电手册:宏观到纳米)，CRC 出版社；第 I 版，ISBN-1O:0849322642，ISBN-13:978-0849322648。所述热调节模块能例如制成接收耗材的盒的形式，或能安置在与耗材可操作临近的平台上。
[0100]通常，所述ECM或热调节模块有反馈控制系统，所述系统操作性连接到计算机，所述计算机控制模块或是模块的一部分。计算机反馈控制是可用于仪器控制的方法。参见例如 Tooley (2005), PC Based Instrumentation and Control (基于 PC 的仪器和控制)，第 3 版，ISBN-10:0750647167, ISBN-13:978-0750647168 ；Dix 等(2003)，Human-ComputerInteraction (人机互动)(第 3 版)，Prentice Hall 出版社，第 3 版，ISBN-10:013046109I，ISBN-13:978-0130461094。通常，通过计算机进行系统控制，所述计算机能使用例如脚本文件作为输入以生成靶标温度和循环时间期限，以及当通过检测光学器观察或拍摄图像时的特异化。图像通常在反应中不同时间点拍摄，并且通过计算机分析以生成作为时间函数的强度曲线，并且因而得到靶标浓度。
[0101]所述光学系统能包含任意典型光学系统组件，或能操作性连接到这种组件上。所述光学系统把光导向耗材，例如集中到耗材阵列或阵列区域上。所述光学系统也能指导从阵列发射的光(如突光或发光信号)。可选光学组件的描述参见例如Kasap等(2009),Cambridge Illustrated Handbook of Optoelectronics and Photonics (剑桥光电子和光子图示手册)，剑桥大学出版社?’第I版，ISBN-10:0521815967, ISBN-13:978-0521815963 ;Bass 等(2009), Handbook of Optics (光学手册),第 3 版,卷 I !Geometrical andPhysical Optics, Polarized Light, Components and Instruments (set)(几何和物理光学，偏振光、组件和仪器(组))，MHP 公司(McGraw-Hill Professional);第 3 版，ISBN_10:0071498893，ISBN-13:978-0071498890 ；Bass 等(2009), Handbook of Optics (光学手册)，第3 版，卷 I1:Design, Fabrication and Testing, Sources and Detectors, Radiometry andPhotometry(设计、制造和测试，来源和检测器，辐射测量和光度测定法)，MHP公司；第3版，ISBN-10:0071498907，ISBN-13:978-0071498906 ;Bass 等(2009)，Handbook of Optics (光学手册)，第3版,卷II1: V ision and Vision Optics (视觉和视觉光学),MHP公司，ISBN-10:0071498915，ISBN-13:978-0071498913 ;Bass 等(2009) Handbook of Optics(光学手册)，第 3 版，卷 IV:0ptical Properties of Materials, Nonlinear Optics, Quantum Optics(材料的光学属性，非线性光学、量子光学)，MHP公司(McGraw-Hill Professional),第3版，ISBN-10:0071498923，ISBN-13:978-0071498920 ;Bass 等(2009)，Handbook of Optics(光学手册)，第 3 版，卷 V:Atmospheric Optics, Modulators, Fiber Optics, X-Ray andNeutron Optics (大气光学、调节剂、光纤、X-射线和中子光学)，MHP公司；第3版，ISBN-10:0071633138, ISBN-13:978-0071633130 ;以及 Gupta 和 Ballato (2006) The Handbook ofPhotonics (光子手册)，第 2 版，CRC 出版社，第 2 版，ISBN-10:0849330955, ISBN-13:978-0849330957。通常光学系统包含任意下列组件:激发光源、弧光灯、汞弧光灯、LED、透镜、光学过滤器、棱镜、相机、光检测器、CMOS相机、和/或CCD阵列。在一个所需实施方式中，使用落射荧光检测系统。所述装置也能包含或偶联到阵列读数模块上，所述模块使阵列上信号与要检测的核酸相关联。
[0102]在本发明的移动基材实施方式中，在某些方面，所述反应容器可以直接偶联到检测通道，如在整合的微流体通道系统内，或通过控制混合物和检测通道之间的合适的流体界面。或者，例如传统流式细胞仪中的流体界面，可以在检测通道上存在以取样扩增反应混合物。所述检测通道通常设置成在给定时间基本上仅使单个珠穿过所述通道的尺寸。所述检测通道通常包含检测窗，所述检测窗能激发珠，并且收集从所述珠发出的荧光。在很多示例中，融合的二氧化硅或玻璃毛细管或其他透明微流体通道用作检测通道。
[0103]本发明的光学检测系统通常包含能在一种或多种激发波长递送激发光的一种或多种激发光源。也包含了设置光学系统，以收集从检测通道发出的光和过滤来自荧光信号的激发光。所述光学系统也通常包含其他分离元件，所述分离元件转化荧光信号、或者把所述珠发出的荧光信号成分与捕获的探针片段发出的信号成分分开。
[0104]图14提供了整体检测系统1400的示意图。如所示，所述系统包含第一和第二激发光光源，例如激光1402和1404，各提供不同波长的激发光。或者，单个宽光谱光源或多个窄光谱光源可以用于在一个或多个合适波长范围内递送激发光以激发样品中的检测标记，如与所述珠相关联的那些和与所述标记探针片段相关联的那些。
[0105]实线箭头所示的来自各激光的激发光束指向检测通道1408，如通过使用定向光学器，如分色镜1406。在检测通道1408中的珠1410发出的光，通过收集光学器如物镜1412收集。所述收集的光然后通过过滤器1414，所述过滤器设置成通过虚线箭头所示的发出的荧光，而排除收集的激发辐射。所述收集荧光包含在第一发射光谱的捕获探针片段上的标记发出的荧光，以及根据珠中使用的很多标记，在一种或多种不同发射光谱上的珠标记特征的荧光信号。所述收集的荧光然后通过分色镜1416，所述分色镜把来自捕获特征片段的荧光发射到第一检测器1420。来自所述珠的剩余荧光特征然后再用于通过第二分色镜1418的信号来分离(其把第一珠信号组分反射到第二检测器1422)，并且通过第二珠信号组分到第三检测器1424。所述检测器通常偶联到合适的处理器或计算机上以存储和检测与珠相关联的信号数据，并分析信号数据以测定珠与捕获特征和相关靶标核酸序列的一致性。再者，所述处理器或计算机可以包含定量信号数据的程序和引起(originate)靶标序列拷贝数目，其中进行时程实验，如在整体扩增反应中一轮或多轮扩增循环后对珠取样。
`[0106]所述装置和系统包含或操作性连接到如在计算机或计算机可读介质中实施的系统指令上。所述指令能控制所述装置和系统的任意方面，如信号强度的一种或多种测量与热调节模块进行的很多控制循环相关联，以测定所述装置检测的靶标核酸的浓度。
[0107]系统能包含操作性连接到其他装置组分的计算机，如通过合适的配线或通过无线连接。所述计算机能包含如通过热调节模块控制热循环的指令，如使用上述反馈控制，和/或当光学系统拍摄或观察图片时发生特异性。所述计算机能接收或转化图像信息成数据信息和/或作为时间函数的信号强度曲线，测定由所述装置分析的靶标函数的浓度等等。所述计算机能包含标准化信号强度以作为(account for)背景，如就阵列的一个或多个区域检测局部背景，以及通过校正所述背景来标准化阵列信号强度测量值。相似地，所述计算机能包含通过对阵列上捕获核酸点样差异、或对阵列不同区域的视野不等进行校正，来标准化信号强度的指令。
[0108]其他定义在进一步详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的特定装置或生物系统，因为它们当然可能变化。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。因此，例如关于"一个表面"，如本文所讨论的耗材腔室，可选包含两个或多个表面的结合，等等。
[0109]除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。在说明和要求保护本发明的过程中，将依据以下定义使用以下术语。
[0110]“扩增引物”是在模板依赖性扩增反应中延伸的部分(如分子)。最典型地，所述引物会包含或是在扩增条件下结合到模板的核酸。通常，所述引物会包含通过聚合酶(如通过聚合酶链反应中的热稳定聚合酶)或通过(如连接酶链反应中的)连接酶延伸的末端。
[0111]“检测腔室”是部分或全部封闭的结构，其中分析样品或检测靶标核酸。所述腔室能全部封闭，或能包含流体偶联到所述腔室的端口或通道，例如用于递送试剂或反应剂。所述腔室的形状能根据本发明和可用的系统设备而变化。当其设置尺寸形状以降低信号背景[如通过包含接近阵列的较窄尺寸(如腔室厚度)(因而降低靠近所述阵列溶液生成的信号数量)]时，或者当设置所述腔室以降低背景[如通过使用涂层(如光学涂层)或结构(如挡板或靠近所述阵列的其他形状结构)]时，腔室“设置成降低到靠近所述阵列的背景信号”。通常，设置所述腔室以靠近所述阵列的尺寸(如厚度)，从而溶液中的信号足够低以使得检测到阵列上的信号差异。例如，在一个实施方式中，所述腔室小于阵列上厚度约Imm ；需要的是所述腔室厚度小于约500 μ m。通常，所述腔室厚度小于阵列上约400 μ m，小于约300 μ m，小于约200 μ m，或小于约150 μ m。在本文提供的一个实施例中，所述腔室厚度约142 μ m0
[0112]“高效核酸阵列”是在杂交条件下与探针或探针片段有效杂交的捕获核酸阵列。在典型实施方式中，所述阵列设置成反应/检测腔室的内表面。所述阵列能通过在表面上从点样到化学或光化学合成的任意传统阵列技术形成。通过控制捕获探针区域长度(相较更长的探针，更短的探针杂交更有效，小到杂交条件的最小杂交长度)、和通过控制各阵列区域上捕获核酸数目来实现高效 。能通过包含捕获位点和表面之间的连接序列或结构生成对杂交更有效/更可用的捕获位点(因而在表面的选择距离上形成捕获位点格式，其能降低表面对杂交的影响)。例如，能使用核酸序列和/或聚乙二醇接头。各阵列区域上分布捕获核酸的数目，从而对通常控制反应生成的给定探针或片段而言，不限定可用于杂交的位点数目。如上所述，这意味着用于在扩增反应中生成的结合标记探针片段的位点数目是过量的，并且优选位点数目显著(substantially)过量,所述位点数目在扩增反应后在反应混合物中可以由探针片段浓度饱和。“标记探针”是分子或化合物，所述分子或化合物在杂交条件下与靶标核酸特异杂交的，并且包含可检测部分或能制成可检测的部分。最常见地，标记探针是包含光学标记的核酸，所述光学标记例如荧光团、染料、发光团、量子点等。所述标记能直接检测，或能在淬灭状态，如其中所述探针包含淬灭剂部分。在本文很多实施方式中，在靶标核酸扩增中剪切靶标探针以释放包含可检测标记的探针片段。例如，所述标记探针能包含荧光团和淬灭剂，如其中扩增反应造成探针剪切以释放标记探针片段。最典型地，所述探针包含“折翼”区域。这种折翼区域在杂交中不与靶标碱基配对，并且通过核酸酶(如聚合酶的核酸酶活性)从探针的其余部分剪切下，因而形成探针片段。
实施例[0113]提供以下实施例用于说明而非限制本发明的权利要求。应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。
[0114]示例性检测系统
[0115]这个实施例的检测系统使得对单个腔室、多重、靶标核酸的实时PCR检测。所述系统扩大了实时PCR的多重性能，所述扩大是通过除去其他光谱差异到阵列空间差异以生成对要扩增的各靶标特异的实时信息。
[0116]传统上，通过使用对各扩增子特异和用不同波长荧光团标记的PCR探针例如TAQMAN?探针来实现单孔多重。由于染料释放光谱和光谱窗的限制，这种方法把单个反应多重性能限制在最多约5个靶标。
[0117]这个实施例中描述的方法使用标记的PCR探针，所述PCR探针扩增子作为代替以在方法中把关于扩增进展的信息转移到阵列结合的表面上。保留了关于扩增的动力学信息，这使得根据循环数目阀值方法来获得检测和定量信息。
[0118]PCR循环的延伸步骤中，Taq聚合酶的5’ _3’核酸酶活性剪切PCR探针以释放折翼核酸，然后所述折翼核酸能优选与阵列表面的捕获探针杂交。各个折翼和对应的捕获探针对测试组中的潜在靶标是独特的。
[0119]反应腔室厚度
[0120]进行实验以评价给定阵列中腔室厚度与信号与背噪之比的关系。用不同厚度腔室的机器来设计基材，并且用官能化的聚合物涂层。测量腔室的实际厚度。所述基材然后用捕获探针点样，并且使用UV固化环氧树脂组装成封闭的反应腔室。包含45nM与阵列上各包含探针互补的标记探针片段的合成模拟和255nM对应完整探针(对模拟15%剪切)用移液器转移到各封闭反应腔室中，并`且30C下3min杂交后测量所述信号对比背景信号。一个试验的结构示于图13。如所示，反应腔室从厚度600微米降低到小于200微米显示了信号与背噪之比的显著增加，最优比率小于300微米，并且优选小于200微米厚度。
[0121]PCR腔室和阵列
[0122]大部分实验中使用的PCR腔室示于图2。如所示，所述腔室由包含与PCR探针折翼序列互补的阵列捕获寡核苷酸的底表面组成。所述捕获探针通过整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies Inc)(爱荷华州克拉威尔)合成,并且有共价连接到形成PCR腔室底部的基材的5’末端氨基基团，以及连接化学和寡核苷酸序列之间的聚乙二醇接头。序列长度与对应的PCR探针折翼相同。用市售可得的载玻片形成PCR腔室的底部。这种载玻片与包含捕获探针后续连接的活性NHS酯的聚合物涂层一起获得。载玻片包含用聚合物涂层的玻璃和塑料基材。两种类型的载玻片生成相似的实验数据。根据标准方法，使用SP0TB0TTM(Arrayit技术公司(加利福尼亚州萨尼维尔))点样捕获探针。所述捕获探针点通常是100 μ m直径，点之间中心与中心的距离是200 μ m。
[0123]所述捕获探针点样和洗涤之后，使用压敏粘合剂(PSA)和有如图2所示的进端口和出端口的聚碳酸酯顶部部件组装成PCR腔室。所述腔室有142 μ M的最终深度/厚度(或高度)和15mm的直径。所述腔室的溶剂保持约45uL PCR试剂。
[0124]热循环和光学线路板。
[0125]所述热循环和光学检测系统包含落射荧光、单通道系统，所述系统包含(I)激发光源(如汞弧光灯或LED)，(2)用于激发光和发射光的干扰光学过滤器，从而检测特异性结合的荧光团，如Cy3、Cy5等，和(3)是CXD或CMOS照相机的光探测器。
[0126]所述系统也包含热循环组件，例如一对热电模块、金属板、散热器和强力冷却风扇，这些组件用于把封闭的耗材(如上述需要的阵列和腔室)快速热循环到需要的温度和需要的时间。通过使用反馈控制系统来控制所述热电模块到特定温度、特定时间期，所述系统使用与耗材临近的热敏电阻器作为控制系统的反馈。通过计算机进行系统控制，所述计算机使用脚本文件作为输入以生成靶标温度和时间期，以及当通过光探测器拍摄图像时产生特异性。所得图像在热反应中的不同时间点拍摄，并且通过计算机分析以生成作为时间函数的强度曲线，并且因而得到靶标浓度。
[0127]在热反应过程中的不同时间和温度下捕获单通道荧光图像。然后分析这些荧光图像以生成起始靶标核酸浓度的定量。结合使用平均灰度强度测量值、背景校正和基线调整来分析荧光图像。在所述阵列中对各个点局部测量背景。通过测量感兴趣点的周围溶液的同心环的荧光强度来计算背景。然后校正各个点的信号以计算局部背景。还能标准化各个点的校正信号以计算点以及视野的不均匀光照中的变化。从第一组循环(通常5-15轮循环)中获得的校正强度测量值的平均用于调整基线和标准化各个点的测量。
[0128]实施例1:三步扩增反应所述扩增试剂混合物包含标准PCR试剂，所述试剂包含对要扩增的各靶标特异的两个PCR扩增引物，以及对要扩增的各靶标特异的PCR探针。典型探针的结构示于图1A。如所示，图1A探针区域(A)表示与靶标扩增子互补的探针核酸区域，使用如通常对传统实时PCR探针(如在TAQMAN?探针中)相同的规定来设计。探针区域(B)表示与相应捕获探针(下面讨论)互补但是与靶标核酸不互补的正交核酸“折翼”序列。为了说明，在一个实施例中设计所述序列以有40° -46°C的Tm，尽管能用其他探针设计来取代。在一个实施例中，所述序列长度是约13或14个碱基。探针区域(C)表示有与核酸区域(B)序列部分互补的序列的核酸。设计这个序列以帮助形成全长探针的二级结构，如Tm是47-51°C。淬灭剂(D)表示可选淬灭剂分子。标记(E)表示荧光团或其他可选的检测标记。所述荧光团Cy3用于 下面表示的数据。
[0129]对这个实施例中的数据而言，用下列试剂制剂进行PCR:200nM引物，IX FASTSTARTtdi PCR 缓冲液(可购自 Roche 公司)，2_6mM MgCl2,0.5mg/mL BSA, 0.2 单位 /uL FASTSTARTtdi Taq 聚合酶(Roche 公司)和 150nM PCR 探针。
[0130]使用上述制剂制备IOOuL PCR反应。用于这个实施例的所述PCR探针序列是:
[0131]
NNNNNNNNNNNNNCCTGTTGCCAATTTCAGAGTGTTTTGCTT AACNNN
NNNNNN' GAT (SEQ ID NO:1)。
[0132]所述5’和3’折翼以下划线/双下划线显示，并且传统TaqMan序列示于黑体。双下划线序列显示设计形成二级结构的同源区域。二级结构的预测融合温度是51°C，如mFold(idtdna.com)使用PCR缓冲液条件所测定。所述PCR探针用5’Cy3荧光团和黑洞猝灭物(Black Hole Quencher) 2部分在3’末端标记。
[0133]所述连接到PCR腔室的底表面的捕获探针序列是:NNN NNNNNNNNN N (SEQ IDNO: 2),使用PCR缓冲液条件的Tm是42°C。[0134]包含靶标序列的DNA质粒以浓度106、IO4和IO2拷贝/uL加入到各PCR反应中。然后所述溶液通过加热到95°C脱气。脱气后，加入聚合酶，并且所述反应使用移液器加载到PCR腔室中。剩余溶液加入应用生物系统(Applied Biosystems) 7500用于平行分析。
[0135]对基于PCR的阵列的循环条件如下:
[0136]
【权利要求】
1.一种检测靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤: 提供检测腔室，所述检测腔室在腔室的至少一个表面上有至少一种高效核酸检测阵列； 把样品加入到检测腔室，所述样品包含要检测的一个或多个靶标核酸拷贝； 将扩增引物和探针与一个或多个拷贝杂交； 在扩增引物依赖性扩增反应中扩增一个或多个靶标核酸拷贝的至少一部分，其中所述扩增反应将所述探针切断并释放第一探针片段； 将所述第一探针片段与高效阵列杂交；和， 检测所述第一探针片段与所述阵列结合生成的信号，由此检测所述靶标核酸，其中在降低阵列附近背景信号的条件下进行所述检测步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针包含标记探针，所述第一探针片段包含标记探针片段。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记探针片段包含在与所述阵列杂交后生成可检测信号的标记。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测腔室的构造降低所述阵列附近的背景信号。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测腔室在至少一个纬度上靠近所述阵列且该纬度的尺寸小于500 μ mo
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测腔室在至少一个纬度上靠近所述阵列且该纬度的尺寸约10 μ m —约200 μ m。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阵列包含与所述第一探针片段杂交的非速率限制数量的捕获核酸。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针片段与所述靶标核酸不互补。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，与阵列上捕获核酸杂交的所述第一探针片段长度小于约30个核苷酸。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，与阵列上捕获核酸杂交的所述第一探针片段长度小于约20个核苷酸。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，与阵列上捕获核酸杂交的所述第一探针片段长度小于约15个核苷酸或更短。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过与腔室可操作连通的至少一个端口或流体通道来加载所述样品。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标核酸在检测前至少扩增5轮循环。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标核酸在检测前进行多轮循环扩增，检测后在附加探针拷贝存在下再扩增所述靶标核酸部分，由此释放的第一探针片段与所述阵列杂交并被检测，将测得的信号强度与样品中靶标核酸的量相关联。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号检测是通过检测一种或多种光学信号波长。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号检测包含检测多种信号的多种光学信号波长。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂交温度低于所述扩增反应的温度。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针包含与所述靶标核酸不互补的第一正交折翼，所述折翼从所述标记探针上切下而生成标记探针片段。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述探针包含与所述第一折翼至少部分互补的第二正交折翼，所述第二折翼结合第一折翼的Tm高于所述第一折翼结合阵列的Tm。
20.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记探针包含荧光标记或发光标记。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光染料。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针包含标记和标记淬灭剂，探针被切断造成所述标记和淬灭剂的分离，因而不淬灭所述标记。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针包含不淬灭的标记。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号是光学信号。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述被检信号包含来自插入染料的信号，该信号指示所述第一探针片段与所述高效阵列杂交。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含检测阵列一个或多个区域的局部背景，并且通过校正所述背景来标准化信号强度测量值。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测步骤中被检信号的信号与背噪之比大于2.5。
28.如权利要求1所述的 方法，其特征在于，所述检测步骤中被检信号的信号与背噪之比大于5。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法包含通过对阵列上捕获核酸点样差异、或对阵列不同区域的视野不等进行校正，从而标准化信号强度。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包含多种靶标核酸，和所述阵列包含多种捕获核酸类型。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕获核酸类型在阵列上空间分隔。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法把特异性针对不同核酸靶标的多种扩增探针与所述靶标核酸一起孵育。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，在所述扩增反应中有约5-约100种捕获核酸类型，和约5-约100种对应的标记探针类型，基于信号在所述阵列上的定位能检测多达5-100种不同信号。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕获核酸的排布密度约350fmol/cm2 一约 5，OOOfmol/cm2 或更大。
35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述捕获核酸的排布密度大于2000fmol/2cm ο
36.如权利要求32所述的方法，所述方法把特异性针对不同核酸靶标的多种标记探针与所述靶标核酸一起孵育，在所述扩增引物依赖性扩增反应中扩增至少部分靶标核酸造成多种标记探针类型切断并且释放多种标记探针片段类型，所述杂交包括这多种探针片段类型与所述阵列杂交，不同探针片段类型各自分别与不同空间位置的捕获核酸类型杂交，检测标记信号包含检测来自多个不同空间区域的多种标记信号，所述多个不同区域分别对应阵列上不同空间位置的多种捕获核酸。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述标记探针类型包含相同的标记部分。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述标记探针类型包含多种不同的标记部分。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述多种标记探针类型包含一种或多种不同的标记部分，不同标记部分的数目小于标记探针类型的数目。
40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增步骤和将所述第一探针片段和高效阵列杂交的步骤在相同温度下进行。
41.一种分析样品多种靶标核酸序列的方法，所述方法包括如下步骤: 将所述样品与第一标记探针群接触，所述第一种标记探针各自包含分别与第一组靶标核酸序列内不同感兴趣靶标序列互补的第一部分和分别与高效探针阵列上的不同捕获探针互补的第二部分，其中所述第二部分连有标记并且与感兴趣靶标序列不互补； 在扩增引物依赖性扩增反应中从所述样品中的第一组靶标核酸序列中扩增所有靶标序列，所述扩增反应将靶标序列杂交的标记探针切断并释放带有标记的所述标记探针的第二部分； 将释放的所述标记探针的第二部分与高效阵列杂交； 检测所述标记探针的第二部分与高效阵列上捕获探针的结合；和根据与所述高效阵列杂交的所述标记探针的第二部分来鉴定所述样品中存在的靶标序列。
42.如权利要求41所述 的方法，其特征在于，所述方法还包括: 将样品与第二标记探针群接触，第二种标记探针各自包含所述第二部分和一个第三部分，所述第三部分分别与第二组靶标核酸序列中的不同感兴趣靶标序列互补； 在扩增引物依赖性扩增反应中从所述样品中的第二组靶标核酸序列中扩增所有靶标序列，所述扩增反应将靶标序列杂交的标记探针切断并释放带有标记的所述标记探针的第二部分；和 重复所述杂交、检测和鉴定步骤。
43.一种核酸检测装置，所述装置包含: 检测腔室，所述检测腔室在至少一个腔室表面上包含至少一种高效核酸检测阵列，所述腔室的构造降低相对于阵列信号的背景信号； 与检测腔室操作性连接的热调节模块，所述模块在装置运行中调节腔室内温度；和 光学系统，所述光学系统在所述装置运行中检测阵列上生成的信号。
44.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述装置在至少一个纬度上接近所述阵列且该纬度上厚度小于500 μ m。
45.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述装置在至少一个纬度上接近所述阵列且该纬度上厚度约10 μ m —约200 μ m。
46.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述表面由陶瓷、玻璃、石英或聚合物构成。
47.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述装置操作中，运行期间，捕获核酸在所述阵列上以非速率限制性的密度存在。
48.如权利要求47所述的核酸检测装置，其特征在于，所述捕获核酸结合于所述腔室表面的热稳定涂层。
49.如权利要求48所述的核酸检测装置，其特征在于，所述涂层包含下列一种或多种:化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，β-不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。
50.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述阵列包含多种捕获核酸类型，不同类型定位在所述阵列上不同的空间区域。
51.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述阵列上存在多于5种不同的捕获核酸类型。
52.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述阵列上存在约5—约100种不同的捕获核酸类型。
53.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述捕获核酸的排布密度大于2000fmol/cm2。
54.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述热调节模块包含下列一种或多种:热电模块、Peltier装置、冷却风扇、散热器、设置成与所述腔室外表面部分配对的金属垫片。
55.如权利要求54所述的核酸检测装置，其特征在于，所述热调节模块包含与计算机操作性连接的反馈控制系统。
56.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述光学系统包含或操作性连接落射荧光检测系统。
57.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述光学系统包含下列一种或多种:激发光源、弧光灯、萊弧光灯、LED、透镜、光学过滤器、棱镜、相机、光检测器、CMOS相机、或CXD阵列。
58.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述装置包含阵列读数模块，所述读数模块将所述阵列上信号位点与要检测的核酸相关联。
59.如权利要求43所述的核酸检测装置，其特征在于，所述装置包含或操作性连接包含于计算机或计算机可读介质中的系统指令，所述系统指令将一种或多种信号强度测量值与热调节模块进行的扩增循环数相关联，以测定通过所述装置检测的靶标核酸的浓度。
60.一种包含如权利要求43所述装置的系统，其特征在于，所述系统操作性连接计算机，所述计算机包含控制热调剂模块进行的热循环并指明光学系统何时成像何时读图的指令，所述计算机还包含把图片信息转化成时间函数的信号强度曲线并/或测定由所述装置分析的靶标核酸的浓度的指令。
61.如权利要求60所述的系统，其特征在于，所述计算机包含检测阵列一个或多个区域的局部背景的指令，和通过校正所述背景来标准化信号强度测量值的指令。
62.如权利要求60所述的系统，其特征在于，所述计算机包含通过对阵列上捕获核酸点样差异、或阵列不同区域视野不等进行校正来标准化信号强度的指令。
63.一种核酸检测耗材，所述耗材包含:厚度小于约500 μ m的薄腔室，所述腔室包含光学透明窗，所述窗在窗内表面设置有高效捕获核酸阵列，所述腔室还包含与所述腔室流体相通的至少一个试剂递送端口，其中耗材的构造允许所述腔室中的流体热循环。
64.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述核酸阵列包含多种不同的捕获核酸类型，分别位于所述阵列的不同空间区域。
65.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室包含含有试剂递送端口的第一上表面，和含有所述窗的底部透明表面，所述上表面和底部表面通过包含压敏粘合材料的侧壁结合。
66.如权利要求63所述的耗材,所述腔室包含含有试剂递送端口的第一上表面,和含有所述窗的底部透明表面，所述上表面和底部表面通过位于上表面和/或下表面上的衬垫或特形结构结合在一起，其中所述衬垫或结构融合或附着在上表面和/或下表面上的相应区域。
67.如权利要求66所述的耗材，其特征在于，所述上表面和下表面超声融合在一起，所述衬垫或结构划定融合区域的界限。
68.如权利要求66所述的耗材，其特征在于，所述结构是上表面或下表面上的透明区和相应上表面或下表面上的对应阴影区，所述上表面或下表面能通过引导激光透过透明区射到阴影区而激光焊接在一起。
69.如权利要求66所述的耗材，其特征在于，所述衬垫或结构引导UV可固化粘合剂的流动，所述粘合剂在上表面和下表面之间流动并接受UV光从而将所述上表面和下表面彼此结合。
70.如权利要求65所述的耗材,其特征在于,所述捕获核酸阵列结合于所述窗的热稳定涂层上。
71.如权利要求70所述的耗材，其特征在于，所述涂层包含化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮、环氧、氮杂环丙烷、醛、α，不饱和酮或包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺、酰基卤化物、磺酰卤、亚酰胺、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。
72.如权利要求65所述的耗材，其特征在于，所述捕获核酸阵列的排布密度大于2000fmol/cm2。
73.如权利要求65所述的耗材，其特征在于，所述捕获核酸阵列的排布密度大于2500fmol/cm2。
74.如权利要求70所述的耗材，其特征在于，所述窗包含陶瓷、玻璃、石英或聚合物。
75.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度约10μ m —约200 μ m。
76.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度约140μ m或更薄。
77.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室厚度约100μ m或更薄。
78.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室平均直径约Imm—约50mm。
79.如权利要求63所述的耗材，其特征在于，所述腔室平均直径约IOmm—约20mm。
80.一种试剂盒，包含包装在包装材料中的权利要求63所述耗材，所述试剂盒可选包含一种或多种对照试剂。
81.—种检测样品中靶标核酸存在的方法，所述方法包含: 在第一标记探针存在下，用有核酸酶活性的聚合酶对样品进行扩增反应，所述第一标记探针包含与第一靶标核酸序列互补的第一部分和与第一靶标核酸序列不互补的带标记的第二部分，由此，当扩增所述靶标核酸序列时，所述第二部分从第一部分上切下； 将所述带标记的第二部分与包含与该第二部分互补的捕获探针的基材杂交；和 检测与基材上捕获探针杂交的所述带标记的第二部分。
82.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述基材包含平面基材。
83.如权利要求81所述的方法，其特征在于，所述基材包含珠。
84.如权利要求82所述的方法，其特征在于，所述方法还包含提供多种标记探针，所述多种标记探针分别具有与不同靶标核酸序列互补的第一部分和带标记的第二部分，所述带标记的第二部分包含各不相同且与不同靶标核酸序列都不互补序列，由此，当扩增不同靶标核酸序列时，所述带标记的第二部分从第一部分上切下； 将扩增反应中切下的所述带标记的第二部分与分别与之互补的不同捕获探针杂交，不同捕获探针各自置于平面基材的不同的已知位点上；和 根据所述基材上带标记第二部分与捕获探针杂交的位置鉴定样品中存在的靶标核酸序列。
85.如权利要求83所述的方法，其特征在于，所述方法还包含提供多种标记探针，所述多种标记探针各有分别与不同靶标核酸序列互补的第一部分和带标记的第二部分，所述带标记的第二部分包含与不同靶标核酸序列都不互补的各不相同的序列，由此，当扩增不同靶标核酸序列时，所述第二标记部分从第一部分上切下； 将扩增反应中切下的所述带标记第二部分与分别与之互补的多种不同捕获探针杂交，其中不同捕获探针各自置于各 有独特标记的不同珠上；和
通过鉴定其结合的珠来检测给定靶标核酸序列的存在。
【文档编号】C12N15/11GK103502471SQ201280018955
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年2月17日 优先权日:2011年2月18日
【发明者】K·斯卡布, P·马丁, B·塔弗特 申请人:Nvs技术股份有限公司