重组聚合酶扩增混合物的监测的制作方法
【专利摘要】方法包括提供混合物，该混合物包括重组酶，单链DNA结合蛋白，和一或多个寡核苷酸，和检测混合物中的微粒。
【专利说明】重组聚合酶扩增混合物的监测
【技术领域】
[0001]本发明涉及核苷酸检测、扩增和定量的组分和方法【背景技术】
[0002]某些等温扩增方法能用特殊方式在约几分钟内能够把痕量级核苷酸模板(目标)扩增至可检测的高含量水平。这些等温方法，如重组聚合酶扩增，能扩大核苷酸应用范围，从诊断至新兴领域如床旁检测、现场和消费品检测。等温扩增技术的自然和宽泛的温度范围让使用者避免利用复杂的供电仪器。
【发明内容】
[0003]本发明基于，至少部分基于对RPA混合物内微粒的观察或观测。在一些实施例中，这些微粒可以包括核苷酸(如寡核苷酸)和/或RPA反应的蛋白成分。本发明包括与RPA相关的新的监测和检测方法。
[0004]在一方面，本发明的方法包括:(a)提供一种混合物，该混合物包括一个或多个重组酶，一种结合单链DNA的蛋白，和一个或多个核苷酸(如寡核苷酸)(他们可以任意组合)；(b)检测反应混合物中的微粒。在一些实施例中，混合物包括拥挤试剂，如一种或多种聚乙二醇(例如 PEG1450，PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000,PEG250000, PEG30000, PEG35000, PEG40000，或分子量在 15000 和 20000 道尔顿(Daltons)的PEG，或它们的任意组合)，聚乙烯醇，右旋糖苷(dextran)葡萄聚糖和聚蔗糖(ficoll)。在一些实施例中，拥挤试剂在反应混合物中的重量或体积百分比的浓度是1% -12%,如 1.0 %，1.5 %，2.0 %，2.5 %，3.0 %，3.5 %，4.0 %，4.5 %，5.0 %，5.5 %，6.0 %，6.5 %，7.0%，7.5%，8.0%，8.5%，9.0%，9.5%，10.0%，10.5%，11.0%，11.5%，和 12.0% 中的任意2个浓度数值之间的浓度范围。
[0005]在本发明的一些【具体实施方式】中，重组酶包括RecA或UvsX重组酶。在本发明的一些【具体实施方式】中，单链DNA结合蛋白包括一个原核SSB蛋白或一个gp32蛋白。在本发明的一些【具体实施方式】中，至少一个或多个核苷酸(如寡核苷酸)中的一个包含可检测的
T 己 O
[0006]在本发明的一些【具体实施方式】中，这些微粒包括一种或多种(如2种，或更多，或包括全部)重组酶，单链结合蛋白，和一种或多种核苷酸中的至少一种(任意组合的形式)。在本发明的一些【具体实施方式】中，反应混合物包括重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs,ATP，引物和模板核苷酸。
[0007]在本发明的一些实施例中，混合物包括一种或更多(如2种或更多，3种或更多，4种或更多，5种或更多，6种或更多，7种或更多，8种或更多，或包括所有的)重组酶，DNA聚合酶，单链结合蛋白，重组加载蛋白，ATP，dNTPs或dNTPs与ddNTPs的混合物，还原剂，肌酸激酶，核酸酶(如核酸外切酶III或核酸内切酶IV)，逆转录酶，核苷酸探针，核苷酸引物，和模板核苷酸(以任何组合形式存在)。[0008]在本发明的部分实施例中，微粒包括聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。在本发明的部分实施例中，微粒包括重组酶，聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。在本发明的部分实施例中，微粒包括重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。在本发明的部分实施例中，微粒包括聚合酶，dNTPs，ATP，从标记、引物、单链结合蛋白、ddNTPs、还原剂、肌酸激酶、核酸酶和逆转录酶中选择一种或多种(如2，3，4，5，或6)作为附加试剂。在本发明的一些实施例中，微粒包括重组酶，聚合酶，逆转录酶，dNTPs、ATP、引物和模板核苷酸。
[0009]在本发明的一些实施例中，微粒的尺寸大小约为0.5-20微米，如尺寸在03，1，
1.5,2,2.5，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，18，和20微米中的任意2个数字之间(如约为1-10
微米)。
[0010]在本发明的一些实施例中，大约10-5000个微粒/纳升可被检测到，如在每纳升中可以被检测的微粒处于10，20，50，100，200，500，1000, 2000，和5000个微粒的任意2个数字之间。
[0011]在本发明的部分实施例中，检测混合物中的微粒包括利用一种或多种显微镜，微流体装置，流式细胞仪，和照相机。在一些实施例中，微粒利用电荷耦合检测器(CCD)进行检测。
[0012]另一个方面，本发明的方法包括:(a)提供重组聚合酶扩增反应混合物；(b)维持反应混合物在适宜产生核苷酸扩增产品的条件下；(c)检测反应混合物中与核苷酸扩增产品相关的微粒。在一些实施例中，检测从开始维持反应的10分钟(如在9、8、7、6、5、4、3、2、
1.5或I分钟内)内完成。
[0013]在本发明的一些实施例中，反应混合物包括拥挤试剂，如一种或多种聚乙二醇(如 PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000,PEG30000, PEG35000, PEG40000,或分子量在15000和20000D的PEG，或它们的任意组合)，聚乙烯醇，葡萄聚糖(dextran)和聚蔗糖(ficoll)。在一些实施例中反应混合物包括聚乙二醇作为拥挤试剂(如这里所述的任意一种PEG或本领域内熟知的任意一种)。在一些实施例中反应混合物包括聚乙烯醇作为拥挤试剂。在一些实施例中拥挤试剂在反应混合物中的重量或体积百分比的浓度是1% -12%，如在L0%，L5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，
4.0 %, 4.5 %, 5.0 %, 5.5 %, 6.0 %, 6.5 %, 7.0 %, 7.5 %, 8.0 %, 8.5 %, 9.0 %, 9.5 %,
10.0%，10.5%，11.0%，11.5%，和12.0%中的任意2个浓度数值之间的浓度范围。在一些实施例中，拥挤试剂在反应混合物中的浓度足以增强反应混合物中扩增反应的数量。
[0014]在本发明的一些实施例中，微粒包括一种或多种(如2种或多种或所有的)重组酶，单链结合蛋白、和一种或多种核苷酸(在任何组合中)中的至少一种核苷酸。
[0015]在本发明的一些实施例中，反应混合物包括一种或多种(如2种或更多，3种或更多，4种或更多，5种或更多，6种或更多，7种或更多，8种或更多，或所有的)DNA聚合酶，重组加载蛋白，ATP, dNTPs或dNTPs and ddNTPs的混合液，还原剂，肌酸激酶，核酸酶(如核酸外切酶III或核酸内切酶IV)，单链结合蛋白，核苷酸引物，核苷酸标记，逆转录酶，和核苷酸模板(任何组合的形式)。
[0016]在本发明的一些实施例中，反应混合物包含重组酶，单链结合蛋白和一种或多种寡核苷酸。在一些实施例中，反应混合物包含重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。
[0017]在一些实施例中，反应混合物包括聚合酶，dNTPs，ATP，引物和模板核苷酸。在一些实施例中，反应混合物包括重组酶，聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。在一些实施例中，反应混合物包括重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs, ATP，引物和模板核苷酸。在一些实施例中，反应混合物包括聚合酶，dNTPs, ATP和一种或多种附加试剂(如:2、3、4、5、或6种)，附加试剂选自于探针、引物、单链结合蛋白、ddNTPs、还原剂、肌酸激酶、核酸酶或逆转录酶。在一些实施例中，反 应混合物包括重组酶、聚合酶，逆转录酶、dNTPs，ATP、引物和模板核苷酸。在一些实施例中，微粒的大小尺寸约为0.5-20微米，如大小在0.5，1，1.5,2,
2.5，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，18，和20微米中的任意2个数字之间(如大小约为1-10微米)。
[0018]在一些实施例中，约每纳升10至5000个微粒可被检测到，如在每纳升10，20，50，100，200，500，1000，2000，和5000个微粒的任意2个数字之间的微粒可被检测。
[0019]在一些实施例中，检测包括测定反应混合物中与核苷酸扩增产物相关的微粒的数量或比例，另外，可选择的，检测包括测定或评估原始混合液中模板核苷酸的浓度。在一些实施例中，检测也包括检测与不同的2种或多种核苷酸扩增产物有关的单一种类微粒。
[0020]另外，本发明的组分包括(a)第一种微粒群，该微粒群包括第一种重组酶、第一种单链DNA结合蛋白和第一种寡核苷酸；和(b)第二种微粒群，该微粒群包括第二种重组酶、第二种单链DNA结合蛋白和第二种寡核苷酸，其中，第一种和第二种寡核苷酸是不同的。在一些实施例中，第一种和第二种寡核苷酸中至少一种包括一个可检测标的记。在一些实施例中，第一种和第二种寡核苷酸包括同样的或不同的可检测标记。第一种和第二种单链DNA结合蛋白可以是相同的或不同的。第一种和第二种重组酶可以相同或不同。
[0021]在一些实施例中，微粒的大小约为0.5-20微米，如大小在0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6, 7,8,9,10，12，15，18，和20微米中的任意2个数字之间(如大小约为1-10微米)。
[0022]在一些实施例中，约每纳升10至5000个微粒存在于组分中，如在每纳升10，20，50，100，200，500，1000，2000，和5000个微粒的任意2个数字之间。
[0023]在本发明的一些实施例中，组分包括拥挤试剂，如一种或多种聚乙二醇(如PEG1450, PEG3000, PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000,PEG30000, PEG35000, PEG40000，或分子量在15000和20000D的PEG，或它们的组合)，聚乙烯醇，葡萄聚糖和聚蔗糖。在一些实施例中拥挤试剂在组分中的重量或体积百分比的浓度是 1% -12%，如在 1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%，5.5%，
6.0%,6.5%,7.0%,7.5%,8.0%,8.5%,9.0%,9.5%, 10.0%, 10.5%, 11.0%, 11.5%,和12.0 %中的任意2个浓度数值之间。
[0024]在本发明的一些实施例中，组分进一步包括一种或多种(如2种或更多，3种或更多，4种或更多，5种或更多，6种或更多，7种或更多，8种或更多，或所有的)DNA聚合酶，重组加载蛋白，ATP, dNTPs或dNTPs and ddNTPs的混合物，还原剂，肌酸激酶，核酸酶(如核酸外切酶III或核酸内切酶IV)，核苷酸探针，和核苷酸模板(任何组合的形式)。
[0025]在另一方面，本发明组分包括一种或多种这里所述的寡核苷酸和这些寡核苷酸的突变体。在一些实施例中，核苷酸扩增方法中(如等温核苷酸扩增如RPA)，核苷酸可以用来作为引物和/或检测探针。这里所述的寡核苷酸可以包括一种或多种可检测的标记。当在描述包括一种或多种可检测标记的寡核苷酸时，可选择性的标记可以被用在寡核苷酸的同一或不同位置或位点(如在被揭示位点可以位于第1，2，3,4, 5,6, 7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，or30个碱基内的5’或3’端)。在一些实施例中，寡核苷酸可包括一个或多个模拟脱碱基位点(abasic site mimics)。可选择性的,一个或多个模拟脱碱基位点的可以位于在寡核苷酸中的同一或不同位置，也可包含选择性模拟脱碱基位点(如在公开位置的 5’或 3’端的第 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，或30个碱基上)。在一些实施例中,这里所述的寡核苷酸的突变体与公开披露的寡核苷酸序列相比具有12个或更少(如，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，2或更少，I或更少，)的插入子、被删除、被替换，和/或被添加。在一些实施例中，这里所述的寡核苷酸突变体与公开的寡核苷酸序列具有至少80%(如，85%、90%或95% )相似度。
[0026]在一些实施例中，微粒可以用来自微粒的荧光而被检测到。
[0027]在一些实施例中，微粒可以不用来自微粒的荧光而被检测到。
[0028]在一些实施例中，微粒可以用荧光被检测到，还可以用相差显微镜，发光检测，光谱(颜色)来检测，磁性探测，放射性同位素检测，和/或电化学来检测。在一些实施例中，可用2种或多种(如2、3或4种)荧光组合，相差显微镜组合，荧光检测组合，光谱(颜色)检测组合，磁性探测组合，放射性同位素检测组合，和/或电化学检测组合来检测微粒。
[0029]在一些实施例中，一些微粒可用荧光来检测，其它的微粒不利用荧光来检测。例如微粒可包含第一子集微粒和第二子集微粒。第一子集微粒可以用来自第一子集微粒的荧光来进行检测，第二子集微粒可以不用来自第二子集微粒的荧光而被检测(例如用相差显微镜，发光检测，光谱(颜色)的检测，磁性探测，放射性同位素检测，和/或电化学检测)。
[0030]另一方面，本发明的 特征在微粒群包括重组酶、单链DNA结合蛋白，和寡核苷酸，其中一些微粒可以来自这些微粒的荧光而被检测，另一种微粒不用来自这些微粒的荧光而被检测。
[0031]本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒包括，在这里所述的任何一种方法中描述的重组酶、单链DNA结合蛋白和寡核苷酸。该试剂盒也包括，在这里描述的任何组分或任何微粒，以及用于实施这里所述的任何方法的说明书。
[0032]这里揭示的方法和组分中可以被用来检测核苷酸，如细菌核苷酸、哺乳动物的核苷酸、病毒核苷酸、真菌核苷酸、或原生动物核苷酸、和用于诊断与这些核苷酸有关的失调或疾病。
[0033]这里所述微粒的“大小或尺寸”指微粒最大横切面的直径。
[0034]这里所述的“寡核苷酸”指核苷酸聚合物包含至少10 (如，至少12，15，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，或100)个碱基。在一些实施例中，寡核苷酸包含总共不超过lkb，900个碱基，800个碱基，700个碱基，600个碱基，500个碱基，400个碱基，300个碱基，200个碱基，100个碱基。在一些实施例中，寡核苷酸有90或更少，80或更少，70或更少，60或更少，50或更少，40或更少，30或更少，20或更少碱基。在一些实施例中，寡核苷酸有至少10，12，14，16，18，或 20 个碱基。
[0035]这里所述的“血细胞计数”指检测、肉眼观察、分析微粒性能的方法和方法组合。这里所用的术语不是指细胞的存在。但是，被用来检测、肉眼观察、分析细胞性能的方法和组合可以用于这里所述的微粒的检测、观察或分析微粒的性能。
[0036]这里所用的“模拟脱碱基位点(abasic site mimic) ”指在核苷酸聚合物中的碱基簇位置中具有糖基或修饰过的糖基的位点(如葡萄糖或脱氧葡萄糖)，糖基或修饰糖基位点的第一个碳不是与基环结构共价键结合(如，腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘌呤，尿嘧啶，或他们的修饰形式)。在一些实施例中，糖基或经修饰糖基位点的第一个碳与一个氢共价键结合(如四氢呋喃)。在一些实施例中，糖基或经修饰的糖基位点的第一个碳与另一个非基环结构上的碳共价键结合。在一些实施例中，糖基或经修饰糖基位点的第一个碳与一个非环链结构共价键结合。在一些实施例中，由于模拟脱碱基位点与脱碱基位点(如:没有大基团附加到糖基)的结构相似性，模拟脱碱基位点被具有处理和修饰模拟脱碱基位点的酶识别。
[0037]下面描述适宜的方法和材料，当然与本发明所述的类似或等同的方法和材料都可以用来实践或验证本发明。这里所述的所有出版物，专利出版物，专利和其他参考文献都完整被引用并作为本发明的参考文献。在发生冲突的情况下，以包括定义的本发明的说明书为准。另外本发明的方法，材料和实例仅是对本发明的说明，而不受其限定。
[0038]本发明的其他特征和优点将会在下面详细说明和权利要求中具体体现。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1A-1C是包含微粒混合物中的单个区域的显微图。比例标尺是100微米。图1A是微分干涉差图(differential interference contrast) (DIC)。图1B,突光图。图 1C,融合图。
[0040]图2A-2C是包含微粒和核苷酸模板的混合物中的单个区域显微图。比例标尺是100微米。2A是微分干涉差图(DIC)。2B，荧光图。2C，融合图。
[0041]图3A-3H是包含所述具有指示聚乙二醇(PEG)浓度的混合物的荧光显
[0042]微图。
[0043]图4A-4F是包含微粒混合物的显微图。图4A和图4B是标准混合物。图4C和图4D是不包含UvsX的标准混合物。图4E和图4F是不包含gp32的标准混合物。图4A，图4C，图4E是微分干涉差图(DIC)。图4B，图4D，图4F是荧光图。
[0044]图5A-5H是包含微粒混合物的显微图。图5A和图5B是与图4A和图4B —样的标准混合物，但不包括UvsY0图5C和图是不包含聚合酶的标准混合物。图5E和图5F是不包含肌酸激酶的标准混合物。图5G和图5H是不包括核酸外切酶III的标准混合物。图5A，图5C，图5E是微分干涉差图(DIC)。图5B，图5D，图5F是荧光图(RxT荧光)。
[0045]图6A-6C是混合物显微图组。图6A显示了完整混合物的2个区域。图6B显示了不包含gp32和UvsY的完整混合物的2个区域。图6C显示了不包含gp32，UvsY和Emix(50mM磷酸肌酸，2.5mM ATP)的完整混合物的2个区域。每一组，最上面是DIC，最下面是荧光。
[0046]图7A-7F是包含用2种标记寡核苷制备的酸微粒的混合物的显微图。图7A是德克萨斯红(Texas red)荧光。图7B，DIC和德克萨斯红(Texas red)融合图。图7C羟基荧光素(FAM)荧光。图7D DIC和羟基荧光素(FAM)融合图。图7E是DIC。图7F是德克萨斯红和羟基荧光素(FAM)融合图。
[0047]图8A-8F是包含带有2种标记寡核苷酸的两种微粒的混合物的显微图，这2种标记寡核苷酸的微粒是单独制备然后再混合。图8A是德克萨斯红(Texas Red)荧光。SB，图DIC和德克萨斯红融合图。图8C羟基荧光素(FAM)荧光。图8D DIC和羟基荧光素(FAM)融合图。图8E是DIC。图8F是德克萨斯红和羟基荧光素(FAM)融合图。
[0048]图9是处于扩增反应过程中微粒的时间进程显微图。
[0049]图10是处于扩增反应过程中微粒的时间进程显微图。
[0050]图11是处于扩增反应过程中微粒的时间进程显微图，通过DIC/羟基荧光素(FAM)和DIC/德克萨斯红(Texas Red)显像检测。
[0051]图12A-12D是在放大20倍时包含微粒混合物的显微图组。图12A，包含T6 H66SUvsX和UvsY的混合物。图12B是包含T6 H66S UvsX但没有UvsY的混合物。图12C是包含T6 UvsX和UvsY的混合物。图12D是包含T6 UvsX但没有UvsY的混合物。在每一组中，最上面是DIC图，最下面是突光图。
[0052]图13A-13D是在放大40倍时包含微粒混合物的显微图组。图13A，包含T6 H66SUvsX和UvsY的混合物。图13B是包含T6 H66S UvsX但没有UvsY的混合物。图13C是包含T6 UvsX和UvsY的混合物。图13D是包含T6 UvsX但没有UvsY的混合物。在每一组图中，最上面是DIC图,最下面是突光图。
[0053]图 14A-14B 是包含 T6 H66S UvsX 和 UvsY (std UvsX+UvsY)，包含 T6 H66S UvsX没有 UvsY (std UvsX-UvsY)，包含 T6 UvsX 和 UvsY (T6 UvsX+UvsY)，包含 T6 UvsX 而没有UvsY (T6 UvsX-UvsY)的混合物中扩增反应的曲线图。图14A，500个模板拷贝。图14B，50个模板拷贝。
[0054]图15 是包含 T6 H66S UvsX 和 UvsY (std UvsX+UvsY)，包含 T6H66SUvsX 没有UvsY (std UvsX-UvsY)，包含 T6 UvsX 和 UvsY (T6 UvsX+UvsY)，包含 T6 UvsX 没有 UvsY (T6UvsX-UvsY)的混合物中扩增反应的曲线图。
[0055]图 16A-16B 是包含 T6 H66S UvsX 和 UvsY (std UvsX+UvsY)，包含 T6 H66S UvsX 没有 UvsY (std UvsX-UvsY)，包含 T6UvsX 和 UvsY (T6 UvsX+UvsY)，包含 T6 UvsX 没有 UvsY (T6UvsX-UvsY)的混合物中扩增反应的曲线图。
[0056]详细描述
[0057]根据显微观察，在RPA混合物中观察到微粒结构。在RPA核苷酸扩增反应的过程中，微粒与扩增的活跃性相关。
[0058]观察到典型的微粒大小在1-10微米之间，大约每纳升100-500个微粒。
[0059]在混合物中微粒被发现包含寡核苷酸。微粒的形成不需要存在镁离子。然而，在缺乏重组酶或单链DNA结合蛋白时形成的微粒具有改变的形态。在缺乏其他试剂，例如重组加载蛋白，DNA聚合酶，肌酸激酶，或核苷酸外切酶时形成的微粒没有显著影响其形态的改变。另外，存在拥挤试剂时能更有效的促进微粒形成。
[0060]在溶液状态下微粒相对更稳定。在接下去的混合过程中，不同的微粒群混合，而在一段时间内仍保持独立。
[0061]重鉬聚合酶扩增
[0062]RPA是一个核苷酸扩增方法(如等温扩增)。通常，在RPA的第一步，重组酶与第一和第二核苷酸引物接触，从而形成第一和第二核蛋白引物。通常第二步，第一和第二核蛋白引物与双链核苷酸模板接触，在模板核苷酸的第一链的第一部分形成第一个双链结构，在模板核苷酸的第二链的第二部分形成第二个双链结构，如在给定的DNA分子中，第一核苷酸引物和第二核苷酸引物的3’端相互相向而对。一股，在第3步，第一和第二核蛋白引物的3’端被DNA聚合酶扩展从而产生第一和第二双链核苷酸，第一和第二解置换核苷酸链。通常，第二步和第三步重可以被重复直到扩增达到预计的程度。
[0063]如这里所述，RPA使用的酶，已知是重组酶，能配对与双链DNA模板同源的寡核苷酸引物。在这种方式中，DNA在双链DNA模板中定点合成。存在核苷酸模板时，用2种或多种序列特异引物(如基因特异)即开始指数扩增反应。反应进展迅速，双链DNA模板序列的特异扩增的结果是几分钟内DNA模板从仅有几个拷贝扩增达到可检测的水平。RPA方法已经有所披露，例如在美国专利，号码US 7，270，981 ；US 7，399，590 ；US 7，666，598 ；US7,435, 561 ;美国专利公开US 2009/0029421 ;和国际申请WO 2010/141940中都有披露。所有这些文献的全部作文本发明的一部分并作为参考。
[0064]RPA反应包含各种蛋白和其他因子的协调，正如支持那些从寡核苷酸的3’端配对到互补底物的DNA合成一样，这些其它因子支持系统中重组元件的活性。在一些实施例中，RPA反应包含重组酶，单链结合蛋白，聚合酶，dNTPs，ATE引物和核苷酸模板的混合物。在一些实施例中，RPA反应可以包括一种或多种下列物质(以任意组合的方式):至少一种重组酶；至少一种单链结合蛋白；至少一种DNA聚合酶；dNTPs或dNTPs和ddNTPs的混合物；拥挤试剂；缓冲液；还原剂；ATP或ATP的类似物；至少一种重组加载蛋白；第一种引物和任意的第二种引物；探针；逆转录酶；和核苷酸模板分子，如单链(如RNA)或双链核苷酸。在一些实施例中，RPA反应可以包括如逆转录酶。其他的RPA反应混合物的实例不限于这里所描述的实例。
[0065]在一些实施例中，RPA反应可以包含UvsX蛋白，gp32蛋白，和UvsY蛋白。这里所述的组分、微粒或方法可以包括，或部分包括，如UvsX蛋白，gp32蛋白，和UvsY蛋白。例如这里所述的组分、微粒或任何的方法都可以包含，或部分包含，如T6H66S UvsX, Rb69 gp32，和 Rb69 UvsY0
[0066]在一些实施例中，RPA反应可以包含UvsX蛋白和gp32蛋白。例如,这里所述的任何组分、任何微粒或任何方法都可以包含，或部分包含，如UvsX蛋白和gp32蛋白。
[0067]RPA反应的一种蛋白组分是重组酶，重组酶可以来自原核生物、病毒或真核生物。典型的重组酶包括RecA和UvsX(如从任何物种获得的RecA蛋白或UvsX蛋白)，和他们的片段或突变体，和它们之间的任意组合。RecA和UvsX蛋白可以从任何物种获得。RecA和UvsX片段或突变体蛋白也可以用合适的RecA和UvsX蛋白，核苷酸序列和分子生物学技术产生(见如在美国专利第8，071，308号中描述的UvsX突变体的形成)。典型的UvsX蛋白包括那些源自肌病毒科卩遼菌体蛋白(myoviridae phages),例如T4,T2,T6,Rb69,Aehl,KVP40,不动杆菌卩遼菌体(Acinetobacter phage) 133,气单胞菌卩遼菌体(Aeromonas phage) 65,卩遼蓝藻体(cyanophage) P-SSM2,卩遼蓝藻体(cyanophage) PSSM4,卩遼蓝藻体(cyanophage) S-PM2,Rbl4, Rb32,气单胞菌卩遼菌体(Aeromonas phage) 25,弧菌卩遼菌体 nt_l, ph1-1, Rb 16, Rb43,噬菌体31，噬菌体44RR2.8t，Rb49，噬菌体Rb3，和噬菌体LZ2。其他典型的重组酶蛋白包括古细菌RADA和RADB蛋白和真核(如植物、哺乳动物和真菌)Rad51蛋白(如RAD51，RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMCl，XRCC2, XRCC3, and recA)(见例 Lin 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.103:10328-10333.2006) 。[0068]在本发明的任意方法中，重组酶(如UvsX)可以是突变体或杂种重组酶。在一些实施例中，UvsX突变体是Rb69 UvsX，它至少在其氨基酸序列上包含一个突变，其中，突变体可以选自于氨基酸突变组，氨基酸突变组可以由(a)为在64位点的氨基酸不是组氨酸而是丝氨酸，在C端附加一个或多个谷氨酸残基，在C端附加一个或多个天门冬氨酸，或它们之间的任意组合。在其他实施例中，UvsX突变体是T6 UvsX具有至少一个T6 UvsX氨基酸序列突变，其中突变体从氨基酸突变组中选择产生，氨基酸突变组由(a)在66位点的氨基酸不是组氨酸，(b)66位点是丝氨酸，(c)在C端附加一个或多个谷氨酸残基，(d)在C端附加一个或多个天门冬氨酸，和(e)它们之间的任意组合。杂种重组蛋白使用的地方，杂种蛋白可以，例如可以是至少一个区域的氨基酸序列来自不同物种的UvsX蛋白。这个区域可以是,例如UvsX的DNA-结合环-2结合域。
[0069]另外，在持续进行的各种交换反应过程中，一种或多种单链DNA结合蛋白可以用来稳定核苷酸。一种或多种单链DNA结合蛋白可以来源于或从各种物种中获得，如从原核生物，病毒或真核生物。典型的单链DNA结合蛋白包括但不限于大肠杆菌SSB和那些源自肌病毒噬菌体的单链DNA结合蛋白，例如T4，T2，T6，Rb69，Aehl，KVP40，不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2，Rbl4，Rb32，气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，ph1-1，Rbl6，Rb43,噬菌体31，噬菌体44RR2.8t, Rb49,噬菌体Rb3,和卩遼菌体LZ2ο额外的单链DNA结合蛋白的例子包括脱氮硫杆菌(A.denitrificans)Alide-2047,伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)BthaB_33951,普式菌(Prevotellapallen) sHMPREF9144_0124，和复制蛋白A的真核单链DNA结合蛋白。
[0070]DNA聚合酶可以是真核的或原核生物的聚合酶。真核生物聚合酶的实施例中包括pol-alpha,pol-beta,pol-delta,pol-epsilon,和它们的突变体或片段,或它们的组合。原核生物聚合酶的实施例中包括大肠杆菌(E.coli) DNA聚合酶I (如科莱诺(Klenow)片段)，曬菌体T4gp43DNA聚合酶,嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)聚合酶I的大片段，Ph1-29DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Pol I，金黄葡萄球菌(Staphylococc us aureus)Pol I,大肠杆菌DNA聚合酶I,大肠杆菌DNA聚合酶II，大肠杆菌DNA聚合酶III，大肠杆菌DNA聚合酶IV，大肠杆菌DNA聚合酶V，和它们的突变体或片段，或它们的组合。在一些实施例中，DNA聚合酶缺失3' -5'核酸外切酶活性。在一些实施例中，DNA聚合酶具有链置换功能，如I类和PolV原核生物聚合酶的大片段。
[0071]本发明的任何方法中都可以在拥挤试剂的情况下进行。在一些实施例中，拥挤试剂可以包括一种或多种聚乙二醇/聚氧乙烯，聚环氧乙烷，聚乙烯醇，聚丙乙烯，聚蔗糖，葡萄聚糖，聚乙烯(乙烯吡咯烷酮)(PVP)，和白蛋白。在一些实施例中，拥挤试剂的分子量不超过200，000道尔顿。拥挤试剂存在的重量体积比(w/v)在大约0.5%至大约15%间。
[0072]假如使用重组加载蛋白，重组加载蛋白可以是源自原核生物、病毒或真核生物。典型的重组加载蛋白包括大肠杆菌RecO，大肠杆菌RecR，UvsY，和它们的突变体或片段，或它们的组合。典型的UvsY蛋白包括那些源自肌病毒噬菌体例如T4，T2，T6，Rb69，Aehl,KVP40,不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2，Rbl4, Rb32，气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，ph1-1, Rb 16, Rb43，噬菌体31，噬菌体44RR2.8t，Rb49，噬菌体Rb3，和噬菌体LZ2。在本发明的任何方法中，重组加载试剂可以来自肌病毒噬菌体。肌病毒噬菌体可以是，例如T4，T2，T6，Rb69，Aehl，KVP40，不动杆菌噬菌体133，气单胞菌噬菌体65，噬蓝藻体P-SSM2，噬蓝藻体PSSM4，噬蓝藻体S-PM2，Rbl4, Rb32，气单胞菌噬菌体25，弧菌噬菌体nt-1，ph1-1, Rb 16, Rb43，噬菌体31，噬菌体44RR2.8t, Rb49,噬菌体 Rb3，和噬菌体 LZ2。
[0073]另外，本发明的任何方法中可以用中断引物执行。中断引物是一种引物可以不允许聚合酶延伸。利用中断引物时，解中断试剂可以用来开启引物并允许延伸。解中断试剂可以是从引物打通中断组的核酸内切酶或核酸外切酶。典型的解中断试剂包括大肠杆菌核酸外切酶III和大肠杆菌核酸内切酶IV。
[0074]在一些实施例中，本发明包括:重组酶与第一和第二核苷酸引物和第三延伸中断引物接触形成第一、第二核第三核酸蛋白引物，其中，中断引物含有一个或多个非互补或修饰内残基；第一和第二核酸蛋白引物与双链靶标核苷酸接触，在第一链的第一部分(形成D环)核酸蛋白引物和DNA第一链之间形成第一双链结构，在第二链的第二部分(形成D环)第二核酸蛋白引物和DNA第二链之间形成第二双链结构，这样，在位于第一和第二引物的5’端之间间的第三部分靶核苷酸的相同靶标核苷酸上，第一核酸蛋白引物和第二核酸蛋白引物彼此相向而对进行导向；和用一种或多种聚合酶和dNTPs延伸第一核酸引物和第二核酸引物3’端，从而形成靶标核苷酸的第一扩增；在核酸酶存在时，靶标核苷酸的第一扩增与第三核酸引物接触在靶标核苷酸初扩增内形成第三双链结构(形成D环)，只有在形成第三双链结果后，核酸酶特异拆开不互补的内部残基形成第三个5’引物和第三个3’延伸中断引物；和用一个或多个聚合酶和dNTP延伸第三个5’引物的3’端，产生第二双链扩增核苷酸。
[0075]在一些实施例中，这些方法包括:第一和第二引物扩增双链靶标核苷酸内的第一部分产生第一扩增产物，至少一种附加引物可以被用于扩增第一扩增产物内的部分连续序列(如，附加第三者引物被用来与如第一或第二引物结合，扩增在第一扩增产物内的部分连续序列)。在一些实施例中，方法包括:第一和第二引物扩增双链靶标核苷酸内的第一部分产生第一扩增产物，和，第三和第四中引物可被用于扩增第一扩增产物内的部分连续序列。
[0076]在一些实施例中，方法包括，如一个正向引物和一个反向引物。在一些实施例中，扩增方法包括至少一个中断引物，该中断引物包含一个或多个不互补或内修饰残基(如，一个或多个可以被核酸酶识别和清除的不互补或内修饰残基，核酸酶可以，例如为DNA糖基酶，脱嘌呤嘧啶(AP)内切核酸酶，fpg, Nth, MutY, MutS, MutM,大肠杆菌MUG’人类MUG’人类Oggl，脊椎动物Ne1-like (Neil)糖基酶，Nfo，核酸外切酶III，or尿嘌呤糖基酶)。其他的核苷酸实例(如引物和探针)不限于这里所述的方法。
[0077] 在一些实施例中，扩增方法可以包括抵抗(resistant)核酸酶的引物或探针，如包含至少一种(如至少 2、3、4、5、6、7 或 8)磷酸酯键(phosphorothioate linkages)。
[0078]本发明的任何过程可以有肝磷脂的情况下执行。肝磷脂作为减少非特异引物杂质的试剂，可以增加大肠杆菌核酸外切酶III或大肠杆菌核酸内切酶IV的功能来快速刨除3’中断基或来自重组中间体的末端残基。
[0079]根据反应的特殊类型，混合物可包含一种或多种缓冲剂、一种或多种盐和一种或多种核苷酸。反应混合物可以被持续在有利于反应的一个特定温度或温度范围内。在一些实施例中，温度被保持在或低于80°C,如保持在或低于70°C,保持在或低于60°C,保持在或低于50°C，保持在或低于40°C，保持在或低于37°C，保持在或低于30°C，保持在或低于室温。在一些实施例中，温度保持在或高于4°C，保持在或高于10°C，保持在或高于15°C，保持在或高于20°C，保持在或高于25°C，保持在或高于30°C，保持在或高于37°C，保持在或高于40°C,保持在或高于50°C,保持在或高于60°C,保持在或高于70°C。在一些实施例中，反应混合物被保持在室温或周围环境(ambient)温度。在一些实施中，整个反应时间内混合液的摄氏温度的变化小于25% (如少于20%，少于15%，少于10%，少于5% )和/或整个反应时间内混合液的温度变化小于15°C (如小于10°C，小于5°C，小于2V，或小于1°C )。
[0080]可以用本领域熟知的方法进行扩增的检测，例如实时检测。在一些实施例中，用一种或多种可检测的标记物标记一种或多种引物或探针(如分子信标探针)。典型可检测的标记物包括酶、酶底物，辅酶，酶抑制剂，荧光标记，猝灭剂，发光团，磁粉或玻璃珠，氧化还原敏感的基团(电化学活性基团)，冷光标记，放射性同位素(包括放射性核苷酸)，和结合对成员。更多特异实例包括荧光，藻蛋白，四乙基罗丹明和β_半乳糖胺酶。结合对成员可以包括生物素/抗生物素蛋白，生物素/抗生蛋白链菌素，抗原/抗体，配体/受体，和这些结合对的衍生物和突变体。
[0081]这里应该注明荧光猝灭剂被认为是可检测标记。例如荧光猝灭剂可以与荧光染料接触，猝灭的数量是可被检测到的。
[0082]微粒的检测
[0083]任何适宜的方法都可以用于微粒的检测和监测。典型方法包括显微镜检查，光散射，流式细胞术，和微流体方法。
[0084]在一些实施例中，用在高放大率情况下直接显微镜检测微粒，如微分干涉差显微镜或荧光显微镜。在计算机的协助下，显微图可以自动获得和分析。另外显微镜可以对至少一部分包含微粒的混合物进行持续或频繁的监测。
[0085]在一些实施例中，微粒用流式细胞术进行检测。在流式细胞术中，一种或多种光束，如每个单波长光，被直接投射到水动力聚焦液体流上。悬浮微粒经过光束散射光线，在微粒中或附着与微粒的荧光化学物被激活。装置内的检测器采集到散射的和/或荧光光线，从而微粒的尺寸和荧光类型等信息被检测到。现代流式细胞仪可以每秒分析数千种微粒，即“实时”，能有效区分和隔离具有特异属性的微粒。
[0086]在一些实施例中，微粒可以用如美国公开专利US2009/0079963，US2010/0179068和WO 2009/112594中所述的血细胞计数方法、装置和系统来检测微粒。
[0087]在一些实施例中，微粒可以用微流体方法、装置和系统进行检测。例如，微粒可以用芯片实验室装置或系统，或类似物检测。见，如美国应用专利出版物第2009/0326903和2009/0297733号中所描述的系统进行检测。
[0088]在一些实施例中，可以用适宜床边检验、就地检验、用户检验的装置或系统检测微粒。例如，装置(如芯片实验室)可以包括重组酶，聚合酶，单链结合蛋白，ATP，dNTPs和引物或探针。在一些实施例中，可以提供包括重组酶，聚合酶，单链结合蛋白，ATP，dNTPs和引物或探针的装置，其中重组酶，聚合酶，单链结合蛋白，ATP，dNTPs和引物或探针中的一种以共价或非共价的形式(如利用亲和标记物)被连接到表面上。在一些实施例中，颗粒可以被放置在多孔板的多个单孔中。
[0089]在本发明的任意方法中，检测微粒前要先固定微粒。例如，采用来交联样品中的蛋白和核苷酸，有效停止混合物中反应的进程，允许在反应被停止的状态下观察微粒，例如用乙醛(如，甲醛，多聚甲醛，或戊二醛)处理来固定微粒。通过固定混合物，微粒可以在后期实时检测时可能简化工序和检测过程。
[0090]寡核苷酸
[0091]本发明涉及的寡核苷酸可以作为扩增引物和/或检测探针。在一些实施例中，如在扩增方法中使用的寡核苷酸(如这里所述)，寡核苷酸可以是2个或更多的寡核苷酸组(例如2，3，4或更多)。
[0092]寡核苷酸可以根据标准氨基磷酸化学或其他方式合成。在合成时，修饰碱基和/或主杆连接化学试剂可能在某些情况下是有用和需要的，并在合成过程中被包含在内。另外，寡核苷酸可以被各种不同用途的群组修饰，如荧光群组，猝光剂，保护(中断)群组(可逆的或不可逆的)，磁性标签，蛋白等。
[0093]在一些实施例中这里所述的寡核苷酸包含一个连续序列(如至少10个碱基)，并且这些连续序列与靶标核苷酸的连续序列至少有90%的相似性(如，至少91%，92%，93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,or 100% )。两个序列间的相似性或同源性百分比可以用数学算法计算。比较两个序列的数学算法的实例可以是Karlin和Altschul (1990),(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 87:2264-68)描述的算法，在 Karlin 和 Altschul (1993)，(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:5873-77)中修订中的算法，但不限于此。算法是Altschul等(1990) ；(J.Mol.Biol.215 =403-410)的NBLAST程序的一部分。为了比对目的获得间隔算法，如 Altschul 等描述的间隔搜索(1997)，(Nucleic Acids Res.25:3389-3402)被应用。当利用BLAST和间隔BLAST程序时，可以使用NBLAST程序的默认参数，见网页ncb1.nlm.nih.gov。
[0094]寡核苷酸包括一种或多种可检测的标记。可检测标记可以是荧光团，酶，烊灭剂，酶抑制剂，放射性标记，氧化还原敏感基团(如电化学活性基团)结合对的一员和它们的组合。在一些实施例中，寡核苷酸同时包含突光团和碎灭剂。碎灭剂可以与突光团靠近来抑制荧光团的荧光。例如，荧光团和烊灭剂的差别可以是I至2个碱基，O至5个碱基，O至8个碱基，3至5个碱基，6至8个碱基，8至10个碱基。荧光团和烊灭剂可以是现有已经知道的任何荧光团和烊灭剂，包含但不限于，本发明所述的荧光团和烊灭剂。可检测标记是荧光团或碎灭剂时，通过突光团的dT残基(fluorophore-dT amidite residue)或碎灭的dT残基(quencher-dT amidite residue)分别附着到寡核苷酸上。任何其它附着方式都是众所周知的技术。
[0095]在本发明的另一方面，无论荧光团或烊灭剂都可以被修饰内残基附着，荧光团和碎灭剂可以通过核酸酶解离(cleavage)修饰内的残基从而被分开。
[0096]任何荧光团可以应用于本发明，荧光素，羟基荧光素(FAM)，TAMRA，和德克萨斯红(Texas Red)是典型的荧光素。典型烊灭剂包括黑暗烊灭，它们可以是，例如黑暗烊灭(DarkQuencher) I 号，黑暗碎灭(Dark Quencher) 2 号，黑洞碎灭(Black Hole Quencher) I 号，黑洞碎灭(Black Hole Quencher) 2 号.[0097]在一些实施例中，寡核苷酸可以包括被修饰的残基。被修饰的残基可以是在双链核苷酸结构中不能与互补碱基形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对的任何结构(残基)。术语“被修饰内残基”，包括，至少在DNA中非正常出现的任何残基一任何残基不是指“A”，“G”，“C”，或“T”，例如尿嘌呤或肌苷。在一些实施例中，修饰内残基是肌苷，尿嘌呤，8-尿嘌呤，胸腺嘌呤，或模拟脱碱基位点。最佳的模拟脱碱基位点包括在寡核苷酸合成过程中产生的四氢呋喃残基或D-间隔子(它可以为在寡核苷酸合成过程中可用5' -O-二甲氧基三苯甲基-1'，2'-去氧核糖-3' -[(2-氰基乙基)-Ν，Ν-二异丙基)]-亚磷酰胺的产物中生产](5' -O-Dimethoxytrityl-11 , 21 -Dideoxyribose-31 -[ (2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)]-pho sphoramidite)。
[0098]在一些实施例中，寡核苷酸的延伸受阻或被中断。一个延伸受阻寡核苷酸在3’端被阻碍或中断，这样，即便存在额外(complimentary)模板的情况下仍不能被聚合酶和dNTP正常延伸。阻碍寡核苷酸的方法是熟知的，包括至少3’端受阻核苷酸。3’端受阻核苷酸包括，例如防止聚合酶延伸的阻碍基。一股，附着到3’端的糖基的第3’或第2’位点，但其他附着位点也是可能的。最通用的3’阻碍方法是在寡核苷酸的3’端放置一个双脱氧糖。例如，阻碍基可以是可检测的标记。
[0099]在一些实施例中，本发明所述的寡核苷酸可以通过加载一个或多个可检测的标记，修饰残基(如修饰内残基)和阻碍基来进行修饰。当这里所述的寡核苷酸包括一个或多个可检测标记，修饰残基(如修饰内残基)和阻碍基的时候，没有以上修饰或具有其他修饰的寡核苷酸也包括在本发明中。另外，这里所述的包括一个或多个可检测标记，修饰残基(如修饰内残基)和阻碍基的寡核苷酸，可以具有被其他可检测标记，修饰基团(例如修饰残基)或阻碍基所取代，例如，这里描述的一可被检测的标记，修饰基，修饰基团(例如修饰残基)或阻碍基
[0100]应思
[0101]本发明所述的方法和组分用于检测靶核苷酸的拷贝数量，监测靶核苷酸中的序列扩增。在本方法的一些实施例中，靶核苷酸能够在低拷贝数的情况下被检测到，和在来自自然的天然样本中被检测到。在一些实施例中，被检测的核苷酸是细菌核苷酸，如来自细菌沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，A类链球菌，B类链球菌，梭状芽孢杆菌，大肠杆菌，结核杆菌，幽门螺杆菌，阴道加德纳氏菌，人型支原体，动弯杆菌属，普氏菌属和卟啉单胞菌属，或来自这里所述的或本领域熟知的其他细菌。在一些实施例中，被检测的核苷酸是哺乳动物核苷酸，如，与肿瘤细胞有关的核苷酸。在一些实施例中，被检测的核苷酸是病毒核苷酸，如来自HIV,流感病毒，或登革病毒，或其他病毒。在一些实施例中，被检测的核苷酸是真菌核苷酸，如来自白色念珠菌或其他真菌。在一些实施例中，被检测的核苷酸是原生动物核苷酸，如来自毛滴虫或其他原生动物。这里所述的方法和组分可以用于诊断核酸检测相关的疾病或状态，如细菌核苷酸，哺乳动物核苷酸，病毒核苷酸，真菌核苷酸或原生动物核苷酸(如本发明所述)。例如本发明提供的方法和组分用来诊断细菌侵染，病毒侵染，真菌侵染或寄生物侵染。在一些实施例中，被检测的核苷酸来自流行感冒A或它的变种，感冒B或它的变种，抗甲氧西林葡萄球菌(MRSA),梭菌(C.difficile),结核菌(M.tuberculosis),衣原体类(如沙眼衣原体)，淋球菌(N.gonorrhoeae)，梅毒螺旋体，人乳头状瘤病毒(HPV)(如HPV变种16型或18型)，肝炎病毒(如甲型肝炎A，B，和C)，或循环癌细胞。在一些实施例中，本发明提供的方法和组分用来诊断MRSA侵染，梭菌(C.difficile)侵染，肺结核，衣原体侵染，淋病，梅毒，HPV侵染，肺炎病毒侵染，或HPV侵染。本发明涉及的方法和组分可以用来定量分析核苷酸。核苷酸扩增/检测反应的“数字化”是为了精确定量模板分子数量的最新手段(见如 Vogelstein, 1999，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 96:9236)。这些方法中最有代表性的是，通过物理分割把扩增反应混合物分离到微室中(通常在纳升范围内)，如通过让其处于压力下让反应混合物进入到适宜的微流体中或把反应混合物分散在适宜的乳剂中。不希望被理论所束缚，如本文所公开的微粒是扩增的活性中心，然后存在的微粒构成一个已有内在划分的可用于定量分析反应混合物。例如，通过计算“活性” PRA微粒的数量(如那些与荧光信号产生有关的微粒)可以测量或估计反应混合物汇总模板核苷酸分子的数量。
[0102]本发明的方法也可以被用来检测两个或多个核苷酸间物理联接的方法。在很多分子生物学应用中，在给定样品中两个不同基因标记的物理联接的检测是很重要的。例如，在给定的样品中仅有细菌类标记和抗抗生素标记不能传递是否这两种标记在同一种细菌中存在(如在同一核苷酸上)，或是这些标记都存在于不同的共定殖细菌种类中。两个标记与一条基因组DNA相联则表示与他们特定病原菌的抗生素抗性有关。在这种2个标记的共定殖的情况下可以提供重要的诊断信息。
[0103]这里所述的方法和组分用来表示两个核苷酸的两个扩增中的点和扩增位置是重叠的，为核苷酸的物理联接提供重要信息。相反，分开的扩增事件说明存在2种核苷酸，但是他们是来自DNA不同片段的核苷酸(如2个共定殖的细菌种类)。在一些实施例中，通过观察在反应混合物中都定位到单微粒的活性扩增产物可以检测2种核苷酸序列间的联系。在其他实施例中，通过观察2种微粒间的“束缚”可以检测来自单条DNA的不同核苷酸序列间的关联，一次扩增一个DNA片段的核苷酸。
[0104]在一些实施例中，本发明所述的微粒的观察是质量控制的方法。例如微粒的外观(数量，大学，浓度)与RPA执行力间的关联可以用来产生在扩增前预测RPA反应质量的分析参数。这可以用于一股质量控制(如在给定的反应混合物中检查微粒的类型/数量)，或监测生产流程(如稳定进程)或储藏条件等改变时产生的影响。
[0105]在一些实施例中，本发明所用的方法和组分能用来获得从反应开始的几分钟内(如在8，7，6，5，4，3，2，1.5或1分钟内)的反应结果。典型的，通过“批量”检测荧光信号的积累来监测扩增反应，如个别模板分子产生的信号充满整个给定的反应体系，在5-8分钟内产生可检测的荧光反应。相反，观察RPA微粒产生的荧光信号原则上也可以用来缩短产生反应结果的时间。这个结果是由于，至少部分，为了在确定位置高放大率的情况下具有更高的检测灵敏度。
[0106]标准RPA反应的荧光信号力度，可以被“批量”监测得益于保温过程中的混合步骤，特别是在起始模板物质数量很低时。通过直接观察反应扩增中的微粒可以减少混合过程导入的杂质。
[0107]具体实施例子
[0108]例I重组聚合酶扩增混合物中的微粒
[0109]这里例子描述了在RPA混合液中包含寡核苷酸微粒的观察。在0.2毫升的管子中将 80 微升含有 9.38mM Tris 乙酸盐，ρΗ8.3,3.13mM DTT，2.5% PEG, 3.75%海藻糖，31.3mM磷酸肌酸，1.56mM ATP, 750 μ M dNTP 混合物(每个 dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 为 188 μ Μ)，388nM Spyl258F2
[0110](CACAGACACTCGACAAG TCCTCAATCAAACCTTG ；SEQ ID NO:1),363nM Spyl258R2
[0111](CAGAAATCCT TGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT ；SEQ ID NO:2)和 75nM Spyl258exoPl[0112](CCTTGTCCTACCTTATAGAACATAGAGAATQTHFAACCGCACTCGCTAC ；
[0113]F =羟基荧光素(FAM)-dT，H = THF(模拟脱碱基位点)，Q = BHQ-l_dT，3’ =中断c3间隔子；SEQ ID NO:3)的液体与冻干混合物混合，包含羟基荧光素(FAM)标记寡核苷酸的RPA反应组分的冻干混合物包含2.96微克肌酸激酶，13.1微克Rb69gp32，18.1微克T6H66S UvsX, 5.15微克Rb69 UvsY’ 5.38微克核酸外切酶III和5.0微克DNA聚合酶(金黄色葡萄球菌聚合酶I的大片段)。冻干试剂悬浮在46.5微升水化缓冲液(48mM Tris醋酸盐，133.8mM KOAc, 2% PEG)并加3.5微升水的溶液中，然后涡旋。这些混合物不包括核苷酸模板或镁离子。10微升混合物转移到显微镜玻片上并用微分干涉差(DIC)显微镜和荧光显微镜在放大率为40 X下成像(图1A-1C)。用微分干涉差(DIC)显微镜或荧光显微镜(图1B)可观察到约1-10微升大小的微粒(图1A)，和当两个图形合并(图1C)
[0114]时。可以观察到约每纳升100-500个微粒(40倍放大倍率的视野相当于1.55nL的混合物)。
[0115]在不同的实验中，如上所述准备混合液，但用2.5微升水和I微升酿脓链球菌基因组DNA制备液(每微升100个拷贝)取代3.5微升水。涡旋混合液，如上述成像(图2A-2C)。当2个图形合并后(图2C)，用DIC(如2A)或荧光(图2B)显微镜观察上述类似的微粒。
[0116]本例子表明RPA混合中的微粒的形成并不依赖模板或镁离子。
[0117]例2.拥挤试剂刺激微粒的形成
[0118]为了明确拥挤试剂对微粒形成的影响，新鲜配制RPA混合液，包括2.96微克肌酸激酶，13.1 微克 Rb69 gp32，18.8 微克 T6H66S UvsX, 2.5 微克 Rb69 UvsY’ 5.38 微克核酸外切酶III，和5.0微克溶 于含有50mM Tris醋酸盐，pH = 8.3DNA聚合酶溶液中，IOOmMKOAc，5mM DTT, 1.2mM dNTP 混合物(dATP，dTTP，dCTP and dGTP 各 300 μ Μ)，50mM磷酸肌酸，
2.5mM △了？，6%海藻糖，14禮MgAc, 30nM HIV p2LFtexas (德克萨斯红标记的寡核苷酸AGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCA5AATTTTCGGGTTT ;3’端 dA 中断，5’德克萨斯红，5 = d 间隔子(Spacer) ；SEQ ID NO:4),420nM Spyl258F2(CACAGACACTCGACAAGTCCTCAATCAAACCTTG ；SEQID N0:5)jP 390nM Spyl258R2 (CAGAAATCCTTGATGAGTTGCGGAAATTTGAGGT ；SEQ ID NO:6)的混合液中。在每一种混合物中包含0%，2%，2.5%,3%,3.5%,4%,5.5%，或8%的PEG。
[0119]混合物用移液枪混合，取10微升转移到显微玻片上。用鉴别干涉对比(DIC)显微镜和荧光显微镜在放大率为40 X下成像。随着PEG浓度的增加至5.5% (图3A-3G)，观察到微粒的数量也随之增加。在8% PEG时微粒相对较少的微粒被观察到。
[0120]这里实例说明PEG能促进RPA混合物中微粒的形成。
[0121]例子3.混合物组分对微粒形成中的贡献
[0122]为了确定RPA混合物中组分对微粒形成的贡献，如例2中制备混合物，但包括
5.5% PEG，在每个反应中除个别组分不包括在内。如上用DIC显微和荧光显微成像。当所有组分都存在时，如上(图4A-4B)所述在混合物中形成微粒。没有UvsX时形成微粒的尺寸大小与具有UvsX时形成的微粒的尺寸不同，不过这些微粒却不容易被DIC显微所观察(图4C-4D)。没有gp32时形成微粒的大小和形状不同于那些具有gp32时形成的微粒(图4E-4F)。缺乏RPA其他组分形成的结构(UvsY，DNA聚合酶，肌酸激酶，或核酸外切酶III)与那些在完整RPA反应中的相似(图5A-5H)。缺乏UvsY导致微粒的数量轻微的减少，却导致微粒的尺寸的增加(图5A-5B)。[0123]制备缺乏2种或3种反应组分的另外的混合物。制备对照RPA混合物:2.96微克肌酸激酶，13.1微克Rb69 gp32，18.8微克T6 H66S UvsX, 5.15微克UvsY’ 8.26微克核酸外切酶III and5.0微克溶于pH为8.3含有IOOmMKOAc DNA聚合酶溶液中，5mM DTT，1.2mMdNTP 混合物(dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 各 300 μ Μ)，50mM 磷酸肌酸，2.5mM ΑΤΡ，6%海藻糖，14mMMgAc,5.5%PEG,120nM M2int羟基荧光素(FAM)(羟基荧光素(FAM)-标记的探针5’_tcctcatatccattctgTcgaatatcatcaaaagd，；T =炭素突光(carboxy fluorescein) -dT ；SEQID NO: 19)，420nM,每个 SpaF3
[0124](CGCTTTGTTGATCTTTGTTGAAGTTATTTTGTTGC ；SEQ ID NO:7)和
[0125]SpaR10+l (TTAAAGATGATCCAAGCCAAAGTCCTAACGTTTTA ；SEQ ID NO:8)的 5OmM Tris醋酸盐中。制备缺失的平行混合物，缺失(i)gp32和UvsY ； (ii) UvsX和UvsY ； (iii)UvsX和gp32 ； (iv) UvsX, UvsY,和 gp32 ；or (iv) gp32, UvsY,和 Emix (憐酸肌酸和 ATP)。在缺失 UvsX和缺失至少一种其他组分的混合物中没有微粒被观察到。在缺失gp32和UvsY的混合物中，观察到大的，不规则的荧光体(图6A-6C)。
[0126]这些实例说明缺失UvsX或gp32对微粒形态具有最大的影响，接着，缺失UvsY对微粒的影响居中，缺失DNA聚合酶，肌酸激酶，或核酸外切酶III则对微粒的形成没有影响。缺失两种或更多组分可以增加对微粒形成的影响。
[0127]例4.混合时不同微粒群保持独立状态
[0128]除每一种混合物包含不同的寡核苷酸和18.8微克UvsX外，如例I所述制备2中冻干混合物。混合试剂 I 包含:296nM SpaF3 (SEQ ID NO:7) ,298nM SpaR10+l (SEQ ID NO:8)和 149nM Spa 探针 I
[0129](CATCAGCTTTTGGAGCTTGAGAGTCAT9A8G6TTTTGAGCTTCAC ;3’ 端生物素(biotin)，6 = BHQ-2dT，8 = d 间隔子(Spacer)，9 = TMR dT ；SEQ ID NO:9)。混合试剂 2 包含:299nM MecF9-8+2(CCCTCAA ACAGGTGAATTATTAGCACTTGT ；SEQ ID NO:10),300nMMecRla(CTTGTTGAGCAGAGG TTCTTTTTTATCTTC ；SEQ ID NO:11)和 150nM Mec 探针I (ATGACGTCTAT CCATTTATGTATGGCAFGHGQAACGAAGAATATA ;3’ 端生物素 TEG，Q = BHQ-1 dT, H=THF(模拟脱碱基位点)，F =羟基荧光素(FAM)-dT ；SEQ ID NO:12)。2种混合物试剂等体积结合，吸取80微升到0.2毫升的管子中并冻干。冻干混合物重悬浮在46.5水化缓冲液(见例I)，I微升水，和2.5微升280mMMgAc中。涡旋混合液，并取10微升到显微镜玻片用DIC显微镜和荧光显微镜成像。观察到微粒同时具有红(TMR)和绿(羟基荧光素(FAM))荧光时，说明微粒中存在两种都标记的寡核苷酸(图7A-7F)。
[0130]在其他实施例中，2种不同的冻干混合物如上制备，一种仅包含TMR标记Spa RPA探针(混合试剂1，如上)，和其他仅包括羟基荧光素(FAM)-标记的MecA RPA标记(混合试剂2,如上)。重构建混合物后,2种重构建混合物合二为一,并用DIC和突光显微镜成像。在该混合物中，观察到了不同的颗粒，主要包含一个或其他荧光团(图8A-8F)。这说明混合后包含不同标记的微粒彼此保持独立。
[0131]为了确定微粒随着时间的持续在混合种群的稳定性，2种没有引物的冻干反应在含有醋酸镁和寡核苷酸的水化缓冲液中如下重新构建。一个混合物包括30nM HIVp2LF texas(德克萨斯红标记)，420nM Spyl258F2 (SEQ ID NO: 1，无标记)，和 390nMSpyl258R2(SEQ ID NO:2，无标记)。另一种混合物包括50nMM2int羟基荧光素(FAM)oligo(SEQ ID N0:19，羟基荧光素(FAM)标记)，420nMSpyl258F2 (SEQ ID 勵:1，无标记)，and390nM Spyl258R2 (SEQ ID勵:2，无标记)。取5微升每一种混合物到显微镜玻片并混合，在2、7和13分钟时对混合液拍照成像(图9)。混合物在接下去的12分钟时间内的图形如图9所示。13分钟后，可以观察到以德克萨斯红或羟基荧光素(FAM)荧光为主的微粒。
[0132]这里实例说明在溶液中微粒相对稳定，可以被单独标记。这个观察结果在同时监测2个或更多RPA反应中不同微粒集时很有用。
[0133]例5.观察RPA反应定位微粒
[0134]包含羟基荧光素(FAM)标记寡核苷酸标记的RPA反应组分的冻干混合物，如例I，用46.5微升水化缓冲液重构建后，加入每微升50000拷贝的S.pyogenes基因组DNAl微升和280mM MgAc2.5微升，开始扩增反应。反应混合物用移液枪混匀，转移到显微镜玻片上用DIC显微镜和荧光显微镜在混合起始后2分40秒后成像，然后在8、12、14、15、16、18、20和22分钟成像(图10)。可以观察到荧光增强(表明扩增))，而这种增强最初只是定位到局部单个微粒上。
[0135]在其他实例中，无引物的冻干反应混合物组分(反应混合物准备如下:把2.96微克肌酸激酶，9.88微克Rb69gp32，18.8微克T6H66S UvsX, 5.38微克UvsY’ 5.38微克核酸外切酶III和5.34微克DNA聚合酶混合在25mMTris醋酸盐，PH = 8.3的溶液中，5mM DDT,2.28% PEG, 5.7%海藻糖，50mM磷酸肌酸，2.5mM ATP，1200微摩尔 dNTP混合物(dATP，dTTP，dCTP和dGTP各300 μ M)并冻干在0.2毫升的试管内)与29.5微升无引物水化缓冲液(41.7mMTris醋酸盐，167.5mM乙酸钾，5.4%PEG，pH8.3)，3.5微升的6μM Spa F3 (SEQ IDNO:7) ,3.5 微升的 6 μ M Spa R10+1 (SEQ ID NO:8)，I 微升的 6 μ MTMR-1abeled Spa Probe
I(SEQ ID NO:9)，I 微升的(λ 6μ M M2int 羟基荧光素(FAM) oligo (SEQ ID N0:19，用作微粒的荧光标记，不包括在RPA反应中)和8微升水溶解。加入每微升50000个拷贝的链球菌A纯化基因组DNA模板和280mM醋酸镁2.5微升，用移液枪混匀后起始反应。取混合液10微升到显微镜玻片，反应起始后3分钟后开始成像。反应混合物在3、8、15、18、22和26分钟的时间里(图11)显示红色荧光增加(指示扩增)，而这种增加最初只是定位到局部单个微粒上。
[0136]这个例子表明，核酸扩增产物可以与颗粒共同定位进行观察。
[0137]例6.UvsX夺化的影响
[0138]为了调查不同UvsX变化的影响，室温制备混合物，混合物包含2.96微克肌酸激酶，13.1微克Rb69 gp32，8.26微克核酸外切酶III，5.0微克聚合酶在50mM Tris醋酸盐，pH = 8.3，IOOmM KOAc, 5mM DTT, 1.2mM dNTP 混合物(dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 各 300 μ Μ)，50mM 磷酸肌酸，2.5mM ΑΤΡ，6 % 海藻糖，14mM MgAc, 5.5% PEG, 120nM M2int 羟基荧光素(FAM) (SEQ ID NO:19)，420nM 每个 SpaF3 和 SpaR10+l (50 μ I 最终体积)中.制备含有
18.8微克T6H66S UvsX或17.6微克T6UvsX，有或没有5.15微克Rb69 UvsY的4种不同混合物。每一种混合物中取10微升到显微镜玻片上，在反应开始5-20分钟后在放大率20X成像(如12A-12D)，在反应开始50-60分钟后在放大率40 X成像(图13A-13D)。一股，在T6H66S UvsX的混合物中的微粒比T6 UvsX中更多。另外T6H66S UvsX的微粒通常不同于那些T6 UvsX的，包括更多彗星形的外形，而T6 UvsX的微粒更似球形。T6H66S UvsX混合物缺乏UvsY是产生更多扩散微粒，弥散“光晕”或“甜甜圈”的微粒在中间没有信号。有了T6 UvsX后常能观察到相反的效果。没有UvsY，微粒是明亮的小球体，但有UvsY时他们不明朗更污浊更小。
[0139]用T6H66S UvsX和T6 UvsX研究UvsY对RPA反应动力学的影响。反应如上制备，具有T6H66S UvsX或T6 UvsX，有或没有Rb69 UvsY。用不同引物对和模板执行三个不同的试验。在第一个试验中，引物是420nM
[0140]FluAPAFNA507(AACCTGGGACCTTTGATCTTGGGGGGCTATATG ；SEQ ID NO:13)和 FluAPARNA106 (ATGTGTTAGGAAGGAGTTGAACCAAGAAGCATT ；SEQ ID NO: 14)，和 120nM 探针 FluAPAexoP2.2 (GATCTTGGGGGGCTATATGAA GCAATYGAGGAGFHCQTGATTAATGAT ；F =羟基荧光素(FAM) _dT，H = THF (模拟脱碱基)，Q = BHQ-l_dT,3’=中断(block) c3 间隔子(spacer) ；SEQ ID NO:15)。每个反应使用流感A模板RNA的500或50个拷贝。RPA反应被装配成包含2.96微克肌酸激酶，13.1 微克 Rb69 gp32，18.8 微克 T6H66S UvsX 或 17.6 微克 T6UvsX, 8.26 微克核酸外切酶III，5.0微克聚合酶，1.79微克逆转录酶，5.15微克UvsY (存在的时候)在50mMTris醋酸盐，pH8.3中，IOOmM KOAc，5mMDTT，0.2单位/微升RibolockTM核糖核酸酶抑制剂(富酶泰斯)(Fermentas), 1.2mM dNTP 混合物(dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 各 300 μ Μ)，50mM磷酸肌酸，2.5mM ATP，6%海藻糖，5.5% PEG。上述组分归集混合为46.5微升体积并置入
0.2毫升管中的中，通过加入2.5微升的280mM MgOAc和流感A模板RNA的500或50个拷贝I微升起始反应。涡旋反应混合物，简短离心，并转移到特斯塔仪器上(ESE)，和40°C的温度下反应20分钟，每隔20秒进行荧光检测，并且每隔5分钟进行混匀(涡旋和简短离心)。相比没有UvsY’ T6H66S UvsX中包含UvsY导致扩增的延缓，而对T6UvsX来讲，情况则相反(图14A-14B)。当仅有50拷贝的模板存在时，缺少UvsY的反应产生更少的整体信号(图14A-14B)。用 420nM SpaF3 和 SpaRlO 引物和 120nM SpaProbel.2 和 1000 个拷贝的链球菌A纯化基因组DNA的第二个试验中观察到类似的反应动力学(图15)。
[0141]在第二个试验中，引物为420nM FluBNSF1007
[0142](CATCGGATCCTCAACTCACTCTTCGAGCGT ；SEQ ID NO:16)和
[0143]FluBNSR705(GACCAAATTGGGATAAGACTCCCACCGCAGTTTC ；SEQ ID NO: 17)，和 120nM探针 FluBNSexoPl
[0144](CATCGGATCCTCAAYTCACTCTTCGAGCGFHTQAA TGAAGGACATTC ;F =羟基荧光素(FAM) -dT, H = THF (模拟脱喊基)(abasic site mimic), Q = BHQ-1-dT, =中断 c3 间隔子(block c3spacer) ；SEQ ID NO:18)。每个反应中使用500个拷贝的PCR扩增流感B的DNA模板。在这些反应中，有T6H66S UvsX而缺乏UvsY时没有观察到扩增(图16A-16B)。有T6UvsX时可以观察到相反的结果(图16A-16B)
[0145]这个实施例说明根据微粒外观和反应动力学，对于UvsY而言，不同的UvsX变种有不同的需求。另外，微粒外观似乎与动力学和/或扩增反应的进程有关。
[0146]例7.核苷酸的定暈
[0147]这里所述的方法用于核苷酸的定量。在一个实施例中，核苷酸模板稀释物与RPA反应混合物如例5所示混合。在特定反应体积中的微粒数量与核苷酸扩增位点有关,是由每一次的稀释倍数决定的。在一定范围内，与核苷酸扩增位点有关的微粒数量随着反应中核苷酸模板浓度而改变。例如与核苷酸扩增有关的微粒数量与核苷酸模板浓度成比例，或与核苷酸扩增有关的微粒数量等同于与相同体积的核苷酸模板的数量。用这个信息显示了活性微粒的 数量和核苷酸模板浓度的关联，就可以确定在试验样品中核苷酸模板的浓度。
【权利要求】
1.方法包括: (a)提供混合物，包括重组酶，单链DNA结合蛋白，和一个或多个寡核苷酸 (b)检测混合物中的微粒。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的混合物包括拥挤试剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的拥挤试剂包括聚乙二醇，聚乙烯醇，右旋糖酐(dextran)和/或聚鹿糖(fcoll)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的拥挤试剂包括聚乙二醇。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的聚乙二醇选自于PEG1450，PEG3000,PEG8000, PEG10000, PEG14000, PEG15000, PEG20000, PEG250000, PEG30000, PEG35000,PEG40000,并且PEG的分子量在15，000和20，000道尔顿之间，和他们之间任意的组合。
6.根据 权利要求2-5之一所述的方法，其中，所述的拥挤试剂在反应混合物中的重量或体积百分比的浓度是1% _12%。
7.根据权利要求1-6之一所述的方法，其中，所述的重组酶包括RecA或UvsX蛋白。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其中，所述的单链DNA结合蛋白包括原核SSB蛋白或gp32蛋白。
9.根据权利要求1-8之一所述的方法，其中，所述的一个或多个寡核苷酸包括一个可被检测的标记。
10.根据权利要求1-9之一所述的方法，其中，所述的微粒包括一个或多个重组酶，单链DNA结合蛋白，和至少一个或多个寡核苷酸。
11.根据权利要求1-10之一所述的方法，其中，所述的混合物进一步包括DNA聚合酶，重组装载蛋白，dNTPs或dNTPs和ddNTPs的混合，还原试剂，肌酸激酶，核酸酶，核酸探针，逆转录酶，和模板核酸中的一种或多种。
12.根据权利要求1-11之一所述的方法，其中，所述的微粒的尺寸为大约1-10微米。
13.根据权利要求1-12任何之一所述的方法，其中，检测混合物中的微粒包括使用显微镜进行检测。
14.根据权利要求1-12任何之一所述的方法，其中，检测混合物中的微粒包括使用微流体装置进行检测。
15.根据权利要求1-12任何之一所述的方法，其中，检测混合物中的微粒包括使用流式细胞计数仪进行检测。
16.根据权利要求1-10，12-15任何之一所述的方法，其中，所述微粒的尺寸大约在0.5-20微米之间。
17.根据权利要求1-16任何之一所述的方法，其中通过检测来自微粒的荧光进行所述微粒的检测。
18.根据权利要求1-16任何之一所述的方法，其中，不通过检测来自微粒的荧光进行所述微粒检测。
19.根据权利要求1-16任何之一所述的方法，其中，所述的微粒包括第一微粒子集和第二微粒子集，其中第一微粒子集通过来自第一微粒子集的荧光进行检测，和第二微粒子集不通过来自第二微粒子集的荧光进行检测。
20.方法，包括:(a)提供重组聚合酶扩增反应混合物: (b)让反应混合物维持在混合物中产生核酸扩增产物的条件下； (C)在混合物中检测与核酸扩增产物相关的微粒。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，检测是在维持所述条件开始后10分钟内进行。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述的混合物包括拥挤试剂。
23.根据权利要求20-22所述的方法，其中，所述的检测包括测试与核酸扩增产物相关的微粒的数量或比例。
24.根据权利要求20-23所述的方法，其中，所述的检测包括与两个或多个不相同的核酸扩增产物相关连的单一微粒测试。
25.根据权利要求20-24所述的方法，其中，所述的微粒的尺寸大约为0.5-20微米。
26.根据权利要求20-25所述的方法，其中，所述的检测为使用来自微粒的荧光进行检测。
27.根据权利要求20-25所述的方法，其中，所述的检测为不使用来自微粒的荧光进行检测。
28.根据权利要求20-25所述的方法，其中，所述的微粒包括第一微粒子集和第二微粒子集，其中第一微粒子集通过来自第一微粒子集的荧光进行检测，和第二微粒子集不通过来自第二微粒子集的荧 光进行检测。
29.试剂组分包括: (a)第一微粒群，包括第一重组酶，第一单链DNA结合蛋白，和第一寡核苷酸； (b)第二微粒群，包括第二重组酶，第二单链DNA结合蛋白，和第二寡核苷酸； 其中，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸不相同。
30.根据权利要求29所述的组分，其中，第一和第二寡核苷酸中的至少一个包括可被检测的标记。
31.根据权利要求29所述的组分，其中，第一与第二寡核苷酸包括不同的可被检测的
T 己 O
32.根据权利要求29-31之一所述的组分，其中，所述的微粒的尺寸大约为0.5-20微米。
33.根据权利要求29-32之一所述的组分，所述为微粒能够通过来自微粒的荧光进行检测。
34.根据权利要求29-32之一所述的组分，其中，所述为微粒不使用来自微粒的荧光进行检测。
35.根据权利要求29-32之一所述的组分，其中，所述的微粒包括第一微粒子集和第二微粒子集，其中第一微粒子集通过来自第一微粒子集的荧光进行检测，和，第二微粒子集不通过来自第二微粒子集的荧光进行检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103476940SQ201280018775
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年4月6日 优先权日:2011年4月7日
【发明者】尼尔·A·阿穆斯, 奥拉夫·派普拉, 凯撒利尔·J·格林伍德 申请人:美艾利尔圣地亚哥有限公司