收获细胞的方法和系统的制作方法

收获细胞的方法和系统的制作方法
【专利摘要】本发明提供了使用振动收获在3D培养物中生长的细胞的方法。所述方法对附着于3D基质的细胞施加足够振幅、频率和持续时间，使得细胞与基质分离并使分离的细胞从基质材料中冲掉(flush)。本发明还提供了进行本发明方法的装置。
【专利说明】收获细胞的方法和系统
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2011年4月15日申请的美国临时申请号的优先权，所述申请全文并入本文。
发明领域
[0003]本发明涉及收获培养生长的细胞的方法和系统。更特别地，本发明涉及收获在三维(3D)培养基上体外生长的细胞的方法和系统，通过施加足够频率、振幅和持续时间的振动力，使细胞从3D基质中释放，由此细胞以高收率和高细胞存活率和活力(vitality)回收。所述振动力也可用于将细胞接种在基质上，之后生长，及用于细胞在3D生物反应器系统中生长期间与3D基质有效混合。
[0004]细胞、如哺乳动物或人细胞群，在医学中作为可用于治疗许多不同医学病症的生物制剂而越来越重要。例如，已经相当感兴趣地关注于人细胞在各种医学应用方面的治疗潜力，包括损伤器官如脑、心脏、骨和肝脏的组织修复，及支持骨髓移植(BMT)。已经对一类人细胞-成人干细胞-在治疗和治愈各种病症如造血功能失调、心脏病、帕金森氏症、阿尔兹海默病、脑卒中、烧伤、肌肉萎缩症、自身免疫失调、糖尿病和关节炎中的作用进行了评估。
[0005]另一类感兴趣的人细胞是粘附基质细胞(ASC)。ASC是异质细胞群，可得自骨髓、脂肪组织、胎盘或者血液。ASC及其在体外增殖造血干细胞中的应用在美国专利N0.6，911，201中描述，所述专利以其全部内容并入本文。
[0006]由于其在临床和研究领域中的不同医学应用，越来越需要大规模的ASC。使用这些细胞的障碍在于由于这些细胞在 大多数组织中的有限数量而导致的分离大量正常存在的粘附基质细胞群的技术难题，以及获得ASC的方法中包含的不适和风险。
[0007]—种解决ASC有限数目难题的方案是在3D培养系统中在使得细胞扩增的条件下体外培养细胞。以其全部内容并入本文的W02007/108003揭示了在3D生物反应器中通过培养扩增ASC的方法，及所述细胞在治疗中的应用。通过在3D基质中体外培养而扩增ASC也在W02010/026575中揭示，所述文献以其全部内容并入本文。在这些参考文献中，ASC在3D基质中生长之后，细胞用如下程序收获，用缓冲液多次洗涤细胞和基质及随后通过将细胞暴露于胰蛋白酶EDTA溶液轻轻搅拌而将细胞从基质中释放出来。
[0008]虽然在这些参考文献中描述的收获方法使得可以从3D基质中回收扩增的ASCJM是基质的特性导致所述方法的低效。3D基质的优势是其提供了三维微环境，在其中培养的细胞能更好地模拟其体内对应物。虽然基质中3D微环境促进培养的细胞的生长和增殖，但是其也提供了内部空间，难以在收获方法中从中移出细胞。这个难题由于存在由培养的细胞分泌的胞外大分子使细胞附着于基质表面而复杂化。
[0009]因此，需要改良从生物反应器中使用的3D基质中有效回收细胞的细胞收获方法。
[0010]发明概述
[0011]根据一方面，本发明提供了收获在培养物中生长的细胞的方法，包括使细胞在粘附材料上生长，其中细胞附着于所述粘附材料，通过将细胞暴露于解离剂而将其与粘附材料解离，以足以使细胞从粘附材料中释放的频率和振幅振动所述粘附材料一段时间，并回收细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以足以将释放的细胞从粘附材料中冲掉(flush)的频率和振幅振动所述粘附材料一段时间。在进一步的实施方案中,所述粘附材料提供细胞附着的二维表面，而在其它实施方案中，粘附材料提供细胞附着的三维基质。
[0012]在一些实施方案中，所述三维基质被封装在生物反应器内的填充床中。在一些实施方案中，所述三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维或者其组合。在一些实施方案中，所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。在其它实施方案中，所述珠是光滑的或有孔的。在其它实施方案中，所述微纤维或纳米纤维是非纺织的。
[0013]在一些实施方案中，粘附材料包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基(polyalkylene)、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯(polyurethane)、聚对苯二甲酸乙酯(polyethyene terephtalate)、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶(matrigel)、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、娃石、泡碱(natron)玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖、或者植物海绵中的一种或多种。在特定实施方案中，纤维素是醋酸纤维素。在其它实施方案中，胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或者层粘连蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，粘附材料是带静电的。在一些实施方案中，粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
[0014]在本发明方法的一些实施方案中，解离剂是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、I型胶原蛋白酶、2型胶原蛋白酶、3型胶原蛋白酶、4型胶原蛋白酶、分散酶或者其组合。在特定实施方案中，所述胰蛋白酶是重组胰蛋白酶。
[0015]在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是粘附细胞。在其它实施方案中，所述粘附细胞是粘附基质细胞。在一些实施方案中，粘附基质细胞的来源是胎盘、脂肪组织或者骨髓。在特定实施方案中，粘附基质细胞的来源是胎盘。在一些实施方案中，粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
[0016]在一些实施方案中，粘附材料通过基本线性往复运动振动。在其它实施方案中，所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和3_6Hz的频率。在其它实施方案中，往复运动的持续时间是大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟或者20分钟。在其它实施方案中，往复运动的频率为大约5Hz，持续时间为大约30秒或更少。在一些实施方案中，振幅为大约25mm。在其它实施方案中，基本线性往复运动的振幅为含有粘附材料的筐(basket)的高度的15-100%距离。
[0017]在一些实施方案中，收获的细胞的特征在于如下一或多项:a)至少50%的细胞存活率山)至少50%的收获效率；c)低于或等于0.5的活力指数；或者d)异质细胞群。其它实施方案包括通过本文揭示的任何方法收获的细胞。
[0018]另一方面，本发明提供了将细胞接种在生物反应器中三维基质中的方法，包括提供在生物反应器的容器内于液体中的三维基质，将包含细胞的组合物导入该容器中，以足以使细胞混合至遍及基质的频率和振幅振动基质一段时间，以及中断振动以使得细胞附着于基质。在一些实施方案中，所述液体是生长培养基。在其它实施方案中，所述方法进一步包括通过应用以足以使生长培养基混合至遍及基质的频率和振幅间断振动(intermittentvibration)基质一段时间使细胞在生物反应器中生长。[0019]在一些实施方案中，三维基质被封装在生物反应器内的填充床中。在一些进一步的实施方案中，三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维，或者其组合。在特定实施方案中，所述微纤维或纳米纤维是纺织的或非纺织的。在其它实施方案中，所述珠是光滑的或有孔的。
[0020]在一些实施方案中，三维基质包含粘附材料。在一些实施方案中，粘附材料包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖或者植物海绵中的一种或多种。在特定实施方案中，所述纤维素是醋酸纤维素。在其它实施方案中，所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或者层粘连蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，粘附材料是带静电电荷的。在一些实施方案中，粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
[0021]在一些实施方案中，接种的细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是粘附细胞。在其它实施方案中，所述粘附细胞是粘附基质细胞。在一些实施方案中，所述粘附基质细胞的来源是胎盘，脂肪组织或骨髓。在特定实施方案中，所述粘附基质细胞的来源是胎盘。在一些实施方案中，所述粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
[0022]在一些实施方案中，所述三维基质通过基本线性往复运动方式振动。在其它实施方案中，所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和l_3Hz的频率。在其它实施方案中，往复运动的持续时间为大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟或者20分钟。在其它实施方案中，所述往复运动的频率为大约1Hz，持续时间为大约30秒或更少。在一些实施方案中，所述振幅为大约25mm。在其它实施方案中，所述基本线性往复运动的振幅为含有粘附材料的筐的高度的15-100%距离。
[0023]本发明的另一实施方案是一种装置，其包含在容器内的粘附材料及赋予所述粘附材料往复运动的振动器，所述振动器包含一或多个控制器以调节往复运动的振幅和频率，其中所述振动器配置为以导致附着于粘附材料的细胞与所述粘附材料分离的方式振动。在一些实施方案中，所述粘附 材料是2D基质或3D基质，在特定实施方案中是3D基质。
[0024]在一些实施方案中，所述装置是生物反应器。在特定实施方案中，所述生物反应器是活塞流生物反应器(plug flow bioreactor)、持续搅拌罐生物反应器、固定床生物反应器、气升式生物反应器或者细胞接种灌注器(cell seeding perfusion) ?在一些实施方案中，所述生物反应器是活塞流生物反应器，其包含填充床三维基质，往复运动设备包含基本包封所述填充床的筐。
[0025]在所述装置的一些实施方案中，所述三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维，或者其组合。在特定实施方案中，所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。在其它实施方案中，所述珠是光滑的或有孔的。在所述装置的一些实施方案中，所述三维基质包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖、或者植物海绵中的一种或多种。
[0026]在特定实施方案中，所述纤维素是醋酸纤维素。在其它实施方案中，所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或者层粘连蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，所述粘附材料是带静电电荷的。在一些实施方案中，所述粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
[0027]在一些实施方案中，所述装置进一步包含细胞。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是粘附细胞。在其它实施方案中，所述粘附细胞是粘附基质细胞。在一些实施方案中，所述粘附基质细胞的来源是胎盘，脂肪组织或者骨髓。在特定实施方案中，所述粘附基质细胞的来源是胎盘。在一些实施方案中，所述粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
[0028]在一些实施方案中，所述装置的振动器赋予粘附材料基本线性的往复运动。在其它实施方案中，所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和l_6Hz的频率。在其它实施方案中，所述往复运动的持续时间为大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟或者20分钟。在其它实施方案中，所述往复运动的频率为大约5Hz，持续时间为大约30秒或更少。在其它实施方案中，所述往复运动的频率为大约1Hz。在一些实施方案中，所述振幅为大约25mm。在其它实施方案中，所述基本线性往复运动的振幅是含有粘附材料的筐的高度的15-100%的距离。
[0029]附图简述
[0030]本发明仅以示例性的方式参考附图进行描述。在具体提到附图的详细内容时，需要强调的是，所显示具体内容是示例性的方式且仅用于说明性讨论本发明优选实施方案的目的，并且是为了提供被认为是本发明原理和构思方面最有用和最易理解的说明而提出。在这一点上，不试图显示比基本理解本发明所需的更详细的本发明结构性细节，对附图所作的说明使得本领域技术人员明白本发明的数种形式如何在实践中具体化。
[0031]在图中:
[0032]图1A和IB例证了具有含有3D基质的筐的反应器的实施方案。这个开放系统实施方案只是用于收获步骤。
[0033]图2例证了具有筐的反应器的另一实施方案。这个封闭系统实施方案用于培养和收获步骤。
[0034]图3例证了用于封闭系统中的具有筐的反应器的另一实施方案。
[0035]图4A例证了示出无完整外壁的筐的筐设计实施方案。图4B是图4C的剖视图，示出例证具有完整外壁的筐的筐设计的另一实施方案。
[0036]图5是例证与筐在反应器内的往复运动配合的筐杆(rod)和波纹管(bellow)的反应器实施方案的侧视图。
[0037]图6例证了具有筐的反应器的一部分的剖视图，显示密封机构的一个实施方案。
[0038]图7是反应器和筐的另一实施方案的剖视图，例证了与运动筐的往复装置配合的活塞杆密封设计。
[0039]图8是例证使筐往复运动的往复装置的实施方案。
[0040]图9A、9B、9C和9D是往复运动设备实施方案的各种俯视图。
[0041]图10示出在如表1所示不同的振动振幅和频率条件下通过振动收获的细胞的细胞浓度数据。
[0042]图11示出在开放系统中通过振动(25mm振幅，6Hz，I分钟)从3D载体中收获的细胞的细胞浓度数据。[0043]图12示出使用MTT测定基于光密度确定的从载体中的收获效率。将所述载体以25mm振幅在6Hz频率振动20分钟以分离细胞，产生的收获效率为98%。
[0044]图13示出通过在3或6Hz频率振动(25mm振幅，I分钟)从3D载体中收获的细胞的细胞浓度数据。
[0045]图14示出使用MTT测定基于光密度确定的从载体中的收获效率。将所述载体以25mm振幅在3或6Hz频率振动I分钟以分离细胞。在3Hz的收获效率为46%，而在6Hz的收获效率为79%。
[0046]图15示出使用3或6Hz频率通过振动从3D载体中收获的细胞的活力指数。
[0047]图16示出使用MTT测定基于光密度的从载体中的收获效率。通过搅拌(14%效率)或振动(87%效率)从载体收获细胞。
[0048]图17示出通过搅拌或振动收获的细胞在冷冻保存后的存活性。
[0049]图18示出通过搅拌或振动收获的细胞的解冻后活力指数。
[0050]图19证实振动频率与收获效率之间的正相关性，以电容数值测量。使用5Hz频率获得最闻收获效率。
[0051]图20示出使用取自容纳载体的筐内不同位置的载体样品通过振动收获的细胞的收获效率。
[0052]图21示出对于3D载体使用两个不同的通过振动收获的细胞的获得的收获效率。
[0053]图22示出作为振动持续时间函数的使用5Hz频率振动收获的细胞的细胞浓度(以电容数值测量)。
[0054]图23示出作为振动持续时间的函数的使用5Hz频率振动收获的细胞的细胞浓度。
[0055]图24示出通过使用取自容纳载体的筐内不同位置的载体样品通过振动收获的细胞的收获效率。
[0056]图25示出通过持续直至120秒的振动收获的细胞的活力指数。
[0057]实施方案的详细描述
[0058]在一个实施方案中，本说明书描述了使用振动例如得自受控的、基本线性的往复运动的振动收获体外生长的细胞的方法。特别地，使细胞在粘附表面上生长，所述粘附表面在一些情况中是三维基质。本发明人已经意识到与本领域已知的现有的收获细胞的方法相t匕，通过应用振幅和频率受控的合适往复运动，附着于粘附材料生长的细胞以高效率分离，可以回收更大数量的细胞。在另一个实施方案中，本说明书描述了使用受控的振动以促进细胞接种在粘附材料上，之后在体外系统如生物反应器中培养。本说明书还描述了在体外培养细胞时使用受控的振动以促进生长培养基混合至遍及粘附材料。因此，本说明书中揭示的一个实施方案是提供一种封闭系统的装置，例如配置了赋予含有粘附材料的容器往复运动的装置的生物反应器，由此本发明描述的方法可以在单一装置中进行。在另一个实施方案中，描述了开放系统，其用于收获在粘附材料上体外生长的细胞。在另一个实施方案中，本说明书揭示了进行本发明方法的装置。
[0059]本发明的原理和实施可以参考附图和伴随的描述而更好地理解。在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明非限于应用于在如下描述或实施例举例说明的那些应用。本发明能具有其它实施方案或者能以各种方式实施或进行。也应理解本文所用措词和术语只是为了描述目的，不应认为有任何限制。[0060]不受理论的限制，本发明人揭示了通过振动如受控及基本线性的往复运动施加的力可用于回收在粘附材料如3D基质上生长的细胞，所述3D基质常规用于生物反应器中以在体外培养细胞。本发明人揭示了从这种载体中机械分离细胞受两个主要的力的影响:
[0061]1.高频率振动(3-6Hz)，其在载体上产生高动量(high moment)，使得细胞从载体的有孔基质中释放。
[0062]2.低频率振动(l-3Hz)，其在载体内部和外部产生足够循环，从而使得用低剪切力非常有效地混合。
[0063]本发明人还揭示了得自低频率振动的均匀混合，使得细胞接种在载体上及使细胞在载体上有效生长。
[0064]使用叶轮(impeller)或相似装置以提供搅拌及由此从粘附材料中分离细胞对于本领域是常规技术。然而，由使用叶轮产生的环流所赋予的剪切力可破坏培养的细胞。本发明人发现通过使用受控的往复运动，可以使赋予细胞的剪切力最小化，同时增加从粘附材料中回收细胞的效率。在一些实施方案中，使用较大振幅的运动组合较低频率提供了最有效的细胞从粘附材料中释放，同时保持释放的细胞的完整性和存活性。然而，用于特定细胞类型、粘附材料和生物反应器的最佳振动振幅和频率是不同的，技术人员通过本说明书教导提供的常规反复试验可易于确定使用振动收获细胞的合适条件。
[0065]除了使用3D粘附材料之外，本说明书中描述的方法可以使用二维粘附材料。使用振动运动收获细胞需要的条件根据粘附材料的性质而不同，可以基于本说明书的教导确定。例如，与从2D粘附材料中收获细胞相反，其中仅被破坏的附着点在细胞与细胞在之中生长的容器之间，在从3D粘附材料收获细胞中，也需要将细胞与以依赖于培养系统中的生长参数的方式形成的胞外基质分离。例如，延长的生长时间导致更多的胞外基质形成，需要与较短生长时间相比不同的收获条件。因此，用于赋予粘附材料往复运动的装置必须是可控的，由此可以调节所述往复运动的振幅、频率和持续时间，以为任何指定的生长条件提供有效的细胞收获，同时还限制了由于往复运动产生的力所致损害细胞的潜力。关于潜在的细胞损害，本说明书中描 述的方法提供了超过本领域常规方法的优势，因为应用于细胞的力持续时间较短，因此降低了在体外培养期间、特别是在收获期间暴露的受力细胞的量。
[0066]本发明所述的“封闭系统”实施方案，其使得可以在一个装置或生物反应器系统中接种、生长及收获细胞，通过允许所有步骤在一个装置中进行而提供了在收获效率和收获的细胞污染潜力最小化方面的明显优势。
[0067]在一个实施方案中，提供了一种收获在3D培养系统中培养扩增的细胞的方法，更特别是扩增的粘附哺乳动物细胞，例如来自胎盘、脂肪组织或骨髓的细胞。在一些实施方案中，将细胞接种在3D基质上，使用振动以见细胞分布在基质内。在一个实施方案中，振动是在将细胞接种在基质内之后使用，以使培养基遍及基质。
[0068]如本文所用，术语“扩增”是指细胞生长，即细胞群增加(例如至少2倍)，伴随这种增加有或无分化。
[0069]如本文所用，“细胞”是指能在体外培养的任何哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是人细胞。
[0070]如本文所用，短语“粘附细胞”是指锚定依赖性的细胞的同质或异质群，即需要附着于表面以在体外生长。[0071]如本文所用，短语“脂肪组织”是指包含脂肪细胞的结缔组织。
[0072]如本文所用，术语“胎盘组织”是指哺乳动物的内衬于子宫壁内及在妊娠期间包膜胎儿的雌性器官的任何部分，胎儿与其通过脐带附着。在出生后，胎盘被除去(也称作产后胎盘)。
[0073]如本文所用，短语“三维培养条件”是指其中将细胞在与细胞生长相容的条件下培养，包括使细胞在三维生长的基质。已经充分意识到细胞在活生物体(或组织)中的原位环境是三维结构。细胞周围由其它细胞环绕。它们位于胞外基质纳米级别纤维的复杂网络中，可以建立各种局部微环境。其胞外配体不仅介导与基底膜的附着，还穿过各种血管和淋巴管。氧、激素和营养素供给细胞，并带走代谢废物。
[0074]在一些实施方案中，针对3D培养配置粘附材料，从而提供生长基质，其明显增加供细胞粘附的可利用的附着表面，以模拟组织(如胎盘)的基础结构。
[0075]在其它实施方案中，3D基质中的纤维形成孔容积(pore volume),占总容积的40-95%，孔径大小为10微米至400微米。在另一个实施方案中，所述基质的孔容积占总容积的 60-95%。
[0076]如本文所用，“接种”是指将细胞导入粘附材料如3D基质中的过程，由此细胞可附着于所述材料。在一些实施方案中，进行将细胞接种在生物反应器如固定相活塞流生物反应器内的步骤，而在生物反应器中的流动在接种后至少10小时停止。在其它实施方案中，细胞的接种通过应用低频率如大约1-3HZ振动含有粘附材料的容器而促进，由此该容器内的培养基遍布在粘附材料内。
[0077]如本文所用，“收获”是指从二维或三维载体中移出细胞。
[0078]在收获细胞的一些实 施方案中，首先用盐水溶液或相应溶液洗涤(例如2-3次)粘附材料。在洗涤步骤之后，可以对所述粘附材料进行解离步骤。在一些实施例中，在解离步骤期间使用合适的解离酶。
[0079]在另一个实施方案中，洗涤的粘附材料在生物反应器中洗涤。如已经提及的，这是指封闭系统。在另一个实施方案中，其上已经生长细胞的粘附材料被移至收获系统的筐中，将所述筐置于含有合适解离酶的容器中，或者向其中加入合适的解离酶。这个是“开放系统”。
[0080]在另一个实施方案中，所述粘附材料在对含有载体的生物反应器的筐进行往复运动之前和/或期间进行洗涤。在再一个实施方案中，所述筐在完整洗涤步骤期间往复运动，在洗涤循环期间和/或在洗涤循环开始或结束时间断运动。在再一个实施方案中，所述筐在完整解离步骤期间往复运动，在解离循环(例如I或2或3或4分钟循环)期间和/或在解离循环开始或结束时间断运动。
[0081]在一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得如下至少一项结果:a)至少80%细胞存活率(通过下文实施例所述方法)；b)至少80%收获效率(通过下文实施例所述方法)；c)低于或等于0.5的活力指数(通过下文实施例所述方法)；和/或d)保持细胞群的异质成分(由此在培养步骤的细胞群的异质群与在收获阶段的细胞群的异质群基本相似)。在另一个实施方案中，所述填充床以足以使得细胞从粘附材料中释放的振幅、频率和持续时间以基本线性运动方式往复运动。
[0082]在另一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少70%细胞存活率(通过下文实施例所述方法)。在另一个实施方案中，填充床被往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少60%细胞存活率(通过下文实施例所述方法)。在另一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少50%细胞存活率(通过下文实施例所述方法)。
[0083]在另一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少70%收获效率(通过下文实施例所述方法)。在另一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少60%收获效率(通过下文实施例所述方法)。在另一个实施方案中，填充床往复运动，同时保持该填充床基本静止状态，以获得至少50%收获效率(通过下文实施例所述方法)。
[0084]在一些实施方案中，生物反应器的筐的往复运动条件是振幅为大约10mm-750mm (或者在这个范围内的任何整数数值)。在另一个实施方案中，生物反应器的筐的往复运动条件是频率为大约3-6Hz (如4、5Hz)或更高。在另一个实施方案中，生物反应器的容积可以是5升,直径为大约140mm,高度为90mm。在另一个实施方案中，生物反应器的容积可以是14升，直径为大约200mm，高度为130mm。在另一个实施方案中，生物反应器的容积可以是75升。在另外的实施方案中，生物反应器的容积可以是150升。在另一个实施方案中，生物反应器的筐的往复运动条件是振幅为所述筐高度的15-100%。在另一个实施方案中，筐被往复运动大约0.25、0.5、1、5、10、20分钟或更长时间。
[0085]胎盘衍生的粘附基质细胞可以得自胎盘的胎儿部分(即羊膜或绒毛膜)和母体部分(即底蜕膜和壁蜕膜)。因此，来自胎盘的“母体部分”粘附基质细胞包含至少大约70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的来自胎盘母体部分的细胞。相似地，“胎儿部分”粘附基质细胞包含至少大约70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的来自胎盘胎儿部分的粘附细胞。
[0086]如本文所用，“解离剂”是破坏细胞与细胞附着的表面之间的附着点的任何化合物。在一些实施方案中，解 离剂是酶。在特定实施方案中，所述酶是胰蛋白酶，包括重组胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、I型胶原蛋白酶、2型胶原蛋白酶、3型胶原蛋白酶、4型胶原蛋白酶或者分散酶。
[0087]制备和鉴定母体衍生的和胎儿衍生的粘附基质细胞的方法在并入本文的W02011/064669中描述。在一些实施方案中基于基因型和/或染色体组型(如FISH或G-显带)分析鉴别母体和胎儿胎盘粘附基质细胞。例如，可以基于染色体组型分析将来自雄性胚胎胎盘的粘附基质细胞分为胎儿和母体细胞(即XX细胞是母体细胞，而XY细胞是胎儿细胞)。在一些实施方案中，衍生自胎盘的胎儿部分的粘附基质细胞(如由绒毛膜绒毛组成或包含其)表达 CD200。也就是说至少大约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%orl00%的细胞表达CD200，通过流式细胞计量术测量，使用同种型对照以定义阴性表达。在一些实施方案中，不超过3.5%、3%、2%或者不超过1%的来自母体部分的粘附基质细胞表达CD200，通过流式细胞计量术测量，使用同种型对照以定义阴性表达。
[0088]无论制备的是母体、胎儿还是或者混合的母体和胎儿衍生的胎盘粘附细胞，将组织样品在生理缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hank’s缓冲液)中洗涤。通过将组织用消化酶(见下文)处理和/或切碎及用尼龙滤膜或者通过轻轻吸液(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)洗漆介质冲洗该组织部分而制备单细胞悬浮液。
[0089]脂肪组织衍生的粘附基质细胞可以通过本领域技术人员已知的多种方法分离。例如，这种方法在美国专利N0.6，153,432中描述。脂肪组织可得自网膜/内脏、乳房、性腺或者其它脂肪组织部位。优选的脂肪组织来源是网膜脂肪。在人体中，脂肪典型通过脂肪抽吸分离。
[0090]来自脂肪组织的分离的粘附基质细胞可以通过对组织进行处理而获得，通过用消化酶如胶原蛋白酶、胰蛋白酶和/或分散酶和/或有效浓度的透明质酸酶或DNAse以及乙二胺四乙酸(EDTA)在25-50°C温度处理10分钟至3小时。然后可将细胞通过20微米至800微米的尼龙或纱布网眼滤膜。然后在培养基中对细胞直接进行差速离心或者经过Ficoll或Percoll或者其它微粒梯度离心。将细胞以100-3000X g速度在温度4_50°C离心I分钟至I小时(见例如美国专利N0.7，078，230)。
[0091]除了胎盘或脂肪组织衍生的粘附基质细胞之外，可以使用来自其它细胞来源的粘附基质细胞。例如，在某些实施方案中，粘附基质细胞得自骨髓。从中可以获得粘附基质细胞的其它组织来源包括但不限于脐带血，毛囊(如美国专利申请20060172304所述)，睾丸(如 Guan K.，et al.，Nature.2006Apr27; 440 (7088): 1199-203 所述)，人嗅粘膜(如 Marshall, CT., et al., Histol Histopathol.2006Jun; 21 (6): 633-43 所述，胚胎卵黄囊(如 Geijsen N, Nature.2004Jan8; 427 (6970): 148-54 所述)，及羊水(Pieternella etal.(2004) Stem Cells22:1338-1345)。可以通过将细胞在粘附表面上培养而分离来自这些组织的粘附基质细胞，由此将粘附基质细胞与原始群体中的其它细胞分离，然后根据本发明所述方法收获该细胞。
[0092]无论来源如何(例如胎盘，脂肪组织或骨髓)，通常在无菌条件下重获细胞。一旦获得分离的细胞，使其粘附于粘附材料(例如作为表面配置的)，从而分离粘附基质细胞。这可以在3D培养条件下培养之前或同时进行。
[0093]如本文所用，“粘附材料”是指合成的、天然存在的或者合成与天然存在的组合的非细胞毒性(即生物相容的 )的材料，其具有可在表面上保持细胞的化学结构(例如带电荷的表面暴露的基团)。
[0094]可用于本发明中的举例的粘附材料包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚-L-乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖或者植物海绵。在某些实施方案中，所述纤维素是醋酸纤维素。在其它实施方案中所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或层粘连蛋白中的一种或多种。在进一步的实施方案中，粘附材料是带静电电荷的。在其它实施方案中，粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
[0095]在一个特定的实施方案中，粘附材料是Fibra-Cel:S_disk (New BrunswickScientific)。Fibra-Cel disk由聚酯非纺织的纤维和聚丙烯组成。Fibra-Cel disk也被静电处理以促进细胞粘附于所述disk，适合在纤维系统中诱捕，在整个过程中其保持在此。「ihnt-C/elddisk 的表面积为 1200cm2/g, disk 直径为 6mm。
[0096]可用于本发明培养中的基本培养基的非限制性实例包括极限必需培养基Eagle，ADC-1，LPM(无牛血清白蛋白)，FlO(HAM)，Fl 2 (HAM)，DCCMl，DCCM2, RPMI1640，BGJ 培养基(有和无Fitton-Jackson改良)，基础培养基Eagle (BME-添加Earle’s盐基质)，Dulbecco's 改良的 Eagle 培养基(DMEM-无血清)，Yamane, IMEM-20, Glasgow 改良的Eagle 培养基(GMEM)，Leibovitz L-15 培养基，McCoy’ s5A 培养基，培养基 M199 (M199E-具有Earle’s盐基质)，培养基M199 (M199H-具有Hank’s盐基质)，极限必需培养基Eagle (MEM-E-具有Earle’s盐基质)，极限必需培养基Eagle (MEM-H-具有Hank’s盐基质)和极限必需培养基Eagle (MEM-NAA具有非必需氨基酸)等等，在数目众多的其他培养基中包括培养基 199，CMRL1415, CMRL1969, CMRL1066, NCTC135, MB75261, MAB8713, DM145,Williams’G， Neuman&Tytell, Higuchi, MCDB301, MCDB202, MCDB501, MCDB401, MCDB411，MDBC153。用于本发明中的优选的培养基是DMEM。这些及其它可用培养基可得自GIBC0，Grand Island, N.Y.，USA 及 Biological Industries, Bet HaEmek, Israel 等。大量这些培养基概述于 Methods in Enzymology,第 LVIII 卷，〃Cell Culture”,第 6272 页,WilliamB.Jakoby 和 Ira H.Pastan 编辑，Academic Press, Inc.出版。
[0097]培养基可以补加如血清，如胎牛或其它物种血清，任选或另外补加生长因子、细胞因子和/或激素(例如生长激素、促红细胞生成素、促血小板生成素、白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand)、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子以及骨形态发生蛋白，浓度为皮克/ml至毫克/ml水平。
[0098]进一步认识到可以在培养基中加入其它成分。这种成分可以是抗生素、抗真菌剂、白蛋白、氨基酸及本领域已知的培养细胞的其它成分。
[0099]粘附基质细胞可以在体外通过常规的二维(2D)培养条件或者在三维(3D)培养条件下增殖。短语“二维培养”或者“2D”是指其中细胞主要在一个平面上生长，如在组织培养皿中。
[0100]一旦获得粘附基质细 胞，可以将其传代到三维环境。但是意识到细胞可以在分离后立即移至3D配置的基质中。因此，本发明的3D粘附材料针对3D培养进行配置，从而提供充分增加供粘附基质细胞粘附的可利用的附着表面的生长基质，以模拟组织(如胎盘)的基础结构。用于使本发明得以实施的生长基质的加工、使用和/或优势在美国专利N0.5，168，085和5，266，476中进一步详细描述，这两个专利均并入本文。在一些实施方案中，三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维，或者其组合。在某些实施方案中，所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。在其它实施方案中，所述珠是光滑的或有孔的。
[0101]在一些实施方案中，所述粘附材料在容器中。如本文所用，“容器”是指其中可容纳材料的任何类型的容器。在一些实施方案中，所述容器除了粘附材料之外还容纳液体，如生长培养基。在一些其它的实施方案中，所述容器具有使液体进出容器的入口和出口。在其它实施方案中，所述粘附材料容纳在容器内的筐内。在一些实施方案中，所述筐与配置为赋予所述筐及其内容物振动运动的振动器可操纵地连接。
[0102]例如，对于高度为0.5mm的生长基质，增加倍数为至少5-30倍，是通过生长基质基线上的突起计算的。这种大约5-30倍的增加是每单位层的增加，如果使用堆积的或由间隔物分隔的多个这样的层，每个这样结构的增加倍数为5-30倍。当基质以片层形式使用时，其可以是非纺织的纤维片层，或者开孔泡沫聚合物形式片层。所述片层的厚度可以为大约50 μ m至1000 μ m，至2000 μ m，至3000 μ m或更厚，提供供细胞进入、营养素进入及从该片层中除去废物足够的有孔性。根据一个实施方案，所述孔的有效直径为10μπι-400μπι。这种片层可以从不同厚度的纤维中制备。在一些实施方案中，所述纤维的厚度或纤维直径范围是大约0.5μ---100μπ?。例如，所述纤维的直径可以在10μπ?-15μπ?范围。例如所述纤维的直径可以在30 μ m-40 μ m范围，例如所述纤维的直径可以在70 μ m-80 μ m范围。
[0103]本发明的结构可以通过有孔支持片层或屏支撑或与它们粘合，提供二维稳定性和物理强度。这种基质片层也可以切割、冲击(punch)或碎成条(shred),以提供相同级别厚度(大约50 μ m-3000 μ m)的投影面积为大约0.2mm2至大约30mm2、0.2mm2至大约100mm2、0.2mm2至大约200mm2级别的颗粒。
[0104]粘附表面可具有选自方形、环形、圆盘和十字形的形态。在一些实施方案中，在3D生物反应器中进行培养。
[0105]这样的物反应器实例包括但不限于活塞流生物反应器、连续搅拌罐生物反应器、固定床生物反应器。例如，三维(3D)活塞流生物反应器(如美国专利N0.6，911，201所述)能支持粘附基质细胞的生长和延长的维持。在这个生物反应器中，粘附基质细胞接种在由非纺织的聚酯基质制成的porrosive载体上,填充在玻璃柱中，从而使得大量细胞以相对较小的体积增殖。
[0106]其它3D生物反应器也可用于本发明中。另一非限制性实例是连续搅拌罐生物反应器，其中使培养基连续进料到生物反应器中，将产物连续抽出，以维持反应器内的时间恒定稳态。带有纤维床筐的搅拌罐生物反应器可购自例如New Brunswick ScientificC0.Edison，NJ。其它实例包括但不限于固定床生物反应器，气动提升生物反应器(其中空气典型通入中央导管的底部，向上流动同时形成气泡，在柱顶分离废气)、含有Polyactive泡沫的细胞接种灌注式生物反应器(如Wendt, D.等，Biotechnol Bioeng84:205_214，(2003)所述)、管状聚L乳酸(PLLA)有孔支架径向流灌注式生物反应器(如Kitagawa等，Biotechnology and Bioengineering93 (5):947-954 (2006)所述)。根据本发明可以使用的其它生物反应器在美国专利 N0.6，277，151,6, 197，575,6, 139，578,6, 132，463,5, 902，741和5,629，186中描述。在另一个实施方案中,可平行或系列使用多个生物反应器。
[0107]所述生物反应器中使用的基质可例如是片层(sheet)形式。这个片层可以是非纺织的纤维片层，或者开孔泡沫化聚合物(open-pore foamed polymers)片层。在一些实施方案中，片层的厚度为大约50 μ m-3000 μ m或更厚，提供了供细胞进入、营养素进入及从片层中除去废物的足够的有孔性。
[0108]在一些实施方案中，细胞接种密度为1，000-10，000个细胞/cm2。
[0109]粘附细胞在3D培养系统中的培养可以在培养基持续流动的条件下实现。可以进行传代以增加细胞数目。意识到可以更换培养基以延长和改良培养条件。根据本发明的一个实施方案，在灌注培养基条件下实现细胞培养。典型地，灌注速度通过粘附细胞的培养基中的葡萄糖浓度确定。因此，根据本发明教导，当葡萄糖浓度在大约500mg/L、550mg/L或者大约600mg/L时可以更换培养基。在另一实施方案中，当葡萄糖浓度在200-1000mg/L之间时可以更换培养基。
[0110]在一些实施方案中，将细胞培养至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或20天或者更长时间。意识到在生物反应器中培养可以延长这个时间。
[0111]在另一个实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少1，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少5，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少10，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少20，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少30，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使基质细胞培养物的基质细胞生长至至少40，000个细胞/cm3粘附材料的密度。在其它实施方案中，使细胞生长至100,000个细胞/cm3的密度。
[0112]在另一个实施方案中，将细胞培养促进2-8倍细胞群倍增的时间。
[0113]在另一个实施方案中，根据通过监测评估的电容评估的细胞密度收获细胞。
[0114]在另一个实施方案中，根据葡萄糖消耗率(GCR)评估的细胞密度收获细胞。
[0115]通过本发明方法接种、生长和/或收获的细胞可以是粘附基质细胞(ASC)。因此，例如，所述细胞可具有纺锤形形态。或者或另外地，所述细胞可表达粘附基质细胞典型的一个标记物或一组标记物(例如表面标记物)。粘附基质细胞表面标记物(阳性或阴性)的实例包括但不限于 CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD34-、CD45-、CD80-、CD19-、CD5-、CD20-、CDlIB-、CD14-、CD19-、CD79-、HLA-DR-和FMC7-。其它粘附基质细胞标记物包括但不限于酪氨酸氢化酶，nestin和H-NF。
[0116]在某些实施方案中，根据本发明所述方法将骨髓(BM)粘附基质细胞在3D培养系统中生长。BM细胞可通过任何已知方法获得。例如，BM可得自经历心内直视手术或BM活检的血液学健康供体的抽吸的胸骨骨髓。将骨髓抽吸物在例如Hank’s平衡盐溶液(HBSS ；GIBCO BRL/Invitrogen, Gaithersburg MD)中稀释 3 倍，进行 Ficoll-Hypaque (RobbinsScientific Corp.Sunnyvale, CA),密度梯度离心。之后，收集骨髓单核细胞(〈1.077gm/cm3),在 HBSS 中洗漆 3 次，重悬浮于生长培养基[DlVEM(Biological Industries, BeitHa' emek, Israel),补加 10%FCS (GIBC0 BRL)、104M 疏基乙醇(Merck, White HouseStation, NJ) > Pen-Strep-Nystatin 混合物(lOOU/ml: lOOug/ml: 1.25un/ml; BeitHa’Emek)、2mM L-谷氨酰胺(Beit Ha’Emek)]中。将来自各个供体的细胞单独在组织培养瓶(Corning，Acton，MA)中在37°C (5%C02)温育，每周更换一次培养基。每3_4天将细胞用
0.25%胰蛋白酶-EDTA (Beit Ha' Emek)分裂。在2_40次传代后，当达到60-80%铺满时，收集细胞在3D生物反应器中培养。
[0117]在其它实施方案中，根据本发明所述方法将得自胎盘的细胞在3D培养系统中生长并收获。胎盘细胞可通过本领域已知的任何方法获得。例如，细胞可以得自足月分娩胎盘的内部部分。将胎盘在无菌条件下适当切片，用Hank’s缓冲液洗涤3次，在37°C与0.1%胶原蛋白酶(I mg/ml组织,Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)温育3小时。使用轻轻抽吸,悬浮的细胞用补加 10%FCS、Pen-Strep-Nystatin 混合物(100U/ml: 100ug/ml: 1.25un/ml)和2mM L-谷氨酰胺的DMEM洗涤，接种在75cm2培养瓶中，在具有5%C02的增湿条件下在37 °C在组织培养温箱中温育。之后，使细胞粘附于塑料表面72小时，之后每3-4天更换一次培养基。当达到60-80%铺满时(通常为10-12天)，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA将细胞从生长培养瓶中脱落并接种于新的培养瓶中。然后收集培养的细胞以在3D生物反应器中培养。[0118]在其它实施方案中，根据本发明方法将使用本领域已知技术得自脂肪组织的粘附基质细胞在3D培养系统中生长并收获。例如，粘附基质细胞可分离自得自脂肪抽吸术的人脂肪组织。将该脂肪组织用等体积的PBS充分洗涤，并在37°C用胶原蛋白酶(20mg/ml)消化30分钟。然后将细胞用含有10%FCS、Pen-Str印-Nystatin混合物(100U/ml:1OOug/ml: 1.25un/ml)和L-Glutamin的DMEM洗漆，在1200rpm在室温离心10分钟，重悬浮于裂解溶液(1:10 ；Biological Industries, Beit Ha’emek, Israel,以裂解红细胞)，离心并重悬浮于含有 10%FCS、Pen-Strep-Nystatin 混合物(100U/ml: 100ug/ml: 1.25un/ml)和L-Glutamin的DMEM中。然后将洗涤的细胞接种在无菌组织培养基培养瓶中，密度为3-10X107个细胞/瓶。第二天，将细胞用PBS洗涤以除去剩余的RBC和死亡的细胞。将细胞保持在37°C具有5%C02的增湿条件下的组织培养温箱中。培养基每3-4天更换一次。在60-80%铺满时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA将细胞从生长培养瓶中脱落，并接种于新的培养瓶中。在2-40次传代后，当细胞达到60-80%铺满时，收集细胞以在3D生物反应器中培养。
[0119]任何生物反应器系统均适于上述粘附BM、胎盘或脂肪细胞的3D培养。例如，在一个实施方案中，可以使用如美国专利N0.6，911，201所述的活塞流生物反应器。这个生物反应器可加载如由无纺聚酯基质制成的1-1OOml填充的3D Porrosive载体(直径4mm)。这些载体能使大量细胞在相对较小的体积增殖。所述生物反应器可以保持在37°C温箱中，调节流速及通过阀门和蠕动泵监测。所述生物反应器可含有取样和注射点，以相继接种细胞。培养基可以从贮液器中以任何合适PH提供，例如pH6.7-7.4。所述贮液器可根据生物反应器中细胞密度而供给含有不同比例的空气/C02/N2/02的过滤的气体混合物。可以调节O2的比例以实现希望的生物反应器中排出的溶解O2的水平，通过监测仪确定。气体混合物可以通过硅树脂管(silicone tube)或扩散器提供给贮液器。培养基的循环可例如通过蠕动泵实现。
[0120]在一个实施方案中，将如上述生长的非铺满的原始人粘附基质细胞2D培养物(例如上述BM，胎盘或脂肪细胞)用胰蛋白酶消化，洗涤，重悬浮于补加10%FBS、Pen-Strep-Nystatin 混合物(100U/ml: 100ug/ml: 1.25un/ml)和 2mM L-谷氨酸胺的 DMEM中，及通过注射点接种(I O3-1O5个细胞/ml)在无菌Plug Flow生物反应器中的3D载体上。在接种之前，将生物反应器充填合适缓冲液，如PBS-Ca-Mg，高压灭菌(120°C，30分钟)，并用含有10%加热失活的胎牛血清和Pen-Strep-Nystatin混合物(100U/ml:1OOug/ml:1.25un/ml)的Dulbecco’s生长培养基洗涤。生物反应器内培养基的流动可以调节为任何合适速度，例如0.l-5ml/分钟。将细胞接种在基质中的过程可以例如通过中止培养基循环2-48小时，以使细胞定居在载体上。将生物反应器保持在控制的温度(37°C )和pH(pH=6.7-7.8)条件下，根据需要使用提供有无菌空气和CO2的温箱。根据需要更换生长培养基，例如一周2-3次。循环培养基用新鲜DMEM培养基更换，每4小时-7天更换一次。一旦细胞已经生长至合适浓度，根据本发明所述方法收获所述细胞。
[0121 ] 如本文所用，“振动器”是能导致振动的任何装置。“振动”是指关于平衡点的机械振荡。所述振荡可以是周期的或随机的。在一个实施方案中，振动是由于往复线性振荡所致，其在振幅和频率方面受控。在一些实施方案中，振荡的振幅和频率是恒定的，而在其它实施方案中，振幅或频率其一或者二者可以随着实现特定结果的要求而变化。在其它实施方案中，振动的持续时间也使用本领域常规的方式和装置控制。在一些实施方案中，振荡器是电机械装置，例如在其传动轴上具有不平衡质量的电动机。在其它实施方案中，振荡器是电子设备。能赋予振动的设备为本领域已知，本领域技术人员熟知以适用于本发明所述方法中的方式调试现有振荡器。
[0122]振动收获系统由Pluristem开发。所述振动收获系统的这个特定实施方案针对5升生物反应器设计(New Brunswick Scientific),由振动系统(如图9A-D所示)和新设计的容纳IOOg FibraCel?的筐(如图6所示)组成。在这个实施方案中及参考图6，所述筐包括与顶部屏(screen)和底部屏垂直的壁，每个屏均有孔。所述3D基质包含在由所述壁及顶部和底部屏围起来形成的空间内。任一或这两个屏可以这样配置，由此其可以从所述筐中移出，以允许通向含有所述3D基质的空间。所述筐还包括筐封条，以提供筐边界与生物反应器容器内表面之间的密封。如图4A和4B所示，所述筐可含有一或多个通道，位于中心或远侧，生物反应器的元件如排液管(drain tube)或叶轮可位于其中。
[0123]附着于筐的是多个筐杆，从所述筐伸出至所述生物反应器容器的外部，通过其与振动器功能性连接。在这个实施方案中，所述容器用板密封，板上具有筐杆经过的孔洞。在所述板的外部，每个筐杆穿经配置为容纳振动器赋予的往复运动的波纹管(bellows)，提供防止污染物进入容器内的密封。
[0124]如本文所用，术语“大约”是指±10%。
[0125]术语“包含”、“包括”及“具有”是指包括但不限于其。
[0126]术语“由…组成”是指包括且限于其。
[0127]如本文所用，单数形式“一个”除非特别指出则包括多个。例如，所述“一个化合物”或者“至少一个化合物”可包括多个化合物，包括其混合物。
[0128]无论在本文何处提 及的数字范围，均是指包括在指定范围内的任何列举的数字(分数或整数)。短语“在第一个数字和第二个数字之间的范围”与“从第一个数字至第二个数字的范围”可在本文可互换使用，是指包括第一个和第二个指定数字及其间的所有分数和整数。
实施例
[0129]现在参考如下实施例，其与上述描述一起以非限制方式示出本发明。
[0130]通常本文使用的命名及本发明使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中充分解释。参见例如"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al., (1989);"Current Protocols in MolecularBiology^Volumes 1-1II Ausubel, R.M., ed.(1994);Ausubel et al.，"Current Protocolsin Molecular Biology^, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal,〃A Practical Guide to Molecular Cloning", John ffiley&Sons, New York(1988);Watsonet al.，"Recombinant DNA^, Scientific American Books, New York;Birren etal.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory30Manual Series", Vols.1-4，Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York (1998) ; U.S.Pat.N0.4，666，828 ; 4，683，202 ; 4，801，531; 5，192,659 和 5, 272, 057 中所述的方法学 /'Cell Biology:A LaboratoryHandbook", Volumes 1-1II Ce 11i s,J.E., ed.(1994) ;"Current Protocols inImmunology^Volumes 1-1IIColigan J.E., ed.(1994);Stites et al.(eds)，〃Basic andClinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange, Norwalk, CT(1994) ;MishelI and Shiigi (eds)，"Selected Methods in Cellular Immunology^, ff.H.Freeman andC0., New York(1980);可获得的免疫测定在专利及科学文献中深入描述，参见例如美国专利号 3，791，932; 3，839，153; 3，850，752; 3，850，578; 3，853，987; 3，867，517; 3，879，262; 3, 901，654; 3, 935，074; 3, 984，533; 3, 996，345 ; 4, 034，074; 4，098，876; 4, 879，219; 5，O11,771 和 5，281，521; "Oligonucleotide Synthesis"Gait, Μ.J.，ed.(1984) ; "NucleicAcid Hybridization〃Hames, B.D.，and Higgins S.J.,eds.(1985);^TranscriptionandlOTranslation〃Hames, B.D.，and Higgins S.J., Eds.(1984) ;"Animal CellCulture^Freshney,R.1.,ed.(1986);^Immobilized Cells and Enzymes^IRLPress, (1986);"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal, B.，(1984)and〃Methods in Enzymology^Vol.1-317, Academic Press;^PCR Protocols: A GuideTo Methods And Applications", Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak etal.,"Strategies forl5Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual^CSHL Press (1996)。
[0131]在3D生物反应器中的细胞培养物生长程序:
[0132]用RALF生物反应器系统在3D培养中生长细胞。RALF生物反应器是圆底、双护套玻璃容器，总体积3.7升，由BioEngineering制造。
[0133]在生物反应器中接种之前，将来自2D阶段的180±30xl06细胞解冻，用培养基(含有10%FBS和25mM HEPES的DMEM) 1:3稀释。取样并使用台盼蓝染料计数细胞以确定细胞数和存活性。细胞悬液在层流罩下转移到0.5L接种瓶中。细胞悬液从接种瓶经重力由无菌管转移到生物反应器中。
[0134]生物反应器含有1.8±0.1L培养基(含有10%FBS和25mM HEPES的DMEM)和30-40克载体(FibraCel? disks, New Brunswick Scientific)。这些载体由聚酯和聚丙烯制成。生物反应器中的培养基保持在下列条件下:37°C，70%溶解氧(“D0”)及pH7.3。通过生物反应器的控制系统确定供应过滤气体(空气、C02、N2和02)以保持DO值在70%及pH值在7.3。培养基通过中空叶轮管在生物反应器中循环，排放端口位于携带载体的筐之上。与Cell-1ift叶轮一样，这些排放端口的旋转在叶轮管底部产生低压差，其在整个系统循环培养基。
[0135]对于前4个小时，培养基以每分钟50转(RPM)搅拌培养基，在第2天增加直至200RPM。对于前2-3天，细胞以分批模式生长。当培养基葡萄糖浓度降低到550mg/升以下时起始灌注。每日调节灌注以保持葡萄糖浓度恒定在大约550±50!1^\升。每1-2天取生长培养基样品以确定葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸和氨浓度(BioProf ile400analyzer, Nova Biomedical)。细胞在生物反应器中培养 6-7 天。
[0136]用Marine-Type Impeller (搅拌)从 3D 载体收获:
[0137]细胞收获方法在生长期结束时(6-7天)开始。生物反应器容器经管道连接废物容器而经重力清空。通过除去顶板打开容器，载体转移到容器底部。将Cell-1ift叶轮用无菌marine-type impeller替换。marine-type impeller产生轴向流动用于需要温和混合的应用而不导致由于单向流动所致细胞损害。
[0138]生物反应器容器然后封闭并用I升预温育(37°C )PBS再填充。搅拌速度设为200RPM2分钟。然后经压力管道或重力吸到废物瓶中。洗涤程序重复3次。
[0139]为从载体释放细胞，将I升预温育(37°C )重组胰蛋白酶溶液(TrypLE;GIBC0)加入到生物反应器容器中，载体温育15分钟。在温育期间，载体每5分钟以200RPM搅拌I分钟。细胞悬液然后收集在含有200ml FBS的2升无菌容器中。用预温育(37°C )TrypLE重复这个步骤10分钟(载体每4分钟以200RPM搅拌I分钟)。为洗涤从载体脱落的细胞，将I升培养基加入到生物反应器容器中，载体以200RPM搅拌2分钟。
[0140]组合来自3个步骤的细胞悬液，然后分到500ml无菌离心管中。细胞经离心浓缩，并计数。
[0141]用收获系统原型(振动)从3D载体收获:
[0142]细胞收获方法在生长期结束时(6-7天)开始。生物反应器容器经管道连接废物容器而经重力清空。通过除去顶板打开容器，打开含有载体的筐，用无菌钳将3D载体从筐转移到无菌玻璃烧杯中。载体用I升预温育(37°C )PBS洗涤2-3次。洗涤的载体转移到收获系统(原型)的筐中，将含有洗涤的载体的筐置于含有1.8升预温育(37°C )TrypLE的
2.2升容器中。在TrypLE中的温育期间(l_32min)以低频率(0.7Hz)振动筐以保证胰蛋白酶溶液在整个筐中的均匀混合。为了从载体释放细胞(收获阶段)，每3-8分钟用12mm或25mm振幅及3Hz或6Hz频率如指示振动I分钟。在收获阶段，在不同时间点将5ml细胞悬液样品收集在含有Iml FBS的50ml离心管中。离心细胞悬液，细胞沉淀重悬于Iml培养基中并计数，或者总细胞悬液分到500ml无菌离心管中，离心细胞,重悬并计数。
[0143]细胞样品冷冻保存:
[0144]细胞以10x106个细胞/ml的浓度在含有10%DMS0 (Wak-Chemie, GMBH)和5%人血清白蛋白(Biotest Pharma, GMBH)的3D冷冻溶液(PlasmaLyte, Baxter)中冷冻保存以用于解冻后存活性及活力(vitality)评估。
[0145]细胞数:
[0146]收获后细胞数用台盼蓝排出法(Trypanblue exclusion method)用 Cedex (RocheApplied Science-1nnovatis)或者Countess (Life Techno1gies-1nvitrogen)装置测量。
[0147]存活性:
[0148]存活性用台盼蓝排出法用Cedex装置或者血细胞计数器测量。
[0149]收获效率:
[0150]在收获之前和之后用3_[4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5_ 二苯基四氮唑溴化物(MTT)测定0.D.评估附着于FibraCel载体的细胞数。收获效率根据下式计算:
[0151]
【权利要求】
1.收获在培养物中生长的细胞的方法，包括: a)使细胞在粘附材料上生长，其中所述细胞附着于所述粘附材料； b)通过将所述细胞暴露于解离剂而将其与粘附材料解离； c)以足以使所述细胞从所述粘附材料释放的频率和振幅振动所述粘附材料一段时间；以及 d)回收所述细胞。
2.权利要求1的方法，其进一步包括以足以使释放的细胞从所述材料中冲掉的频率和振幅振动所述粘附材料一段时间。
3.权利要求1的方法，其中所述粘附材料提供二维表面供细胞附着。
4.权利要求1的方法，其中所述粘附材料提供三维基质供细胞附着。
5.权利要求4的方法，其中所述三维基质被封装在生物反应器内的填充床中。
6.权利要求4的方法，其中所述三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维，或者其组合。
7.权利要求6的方法，其中所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。
8.权利要求6的方法，其中所述珠是光滑的或有孔的。
9.权利要求7的方法，其中所述微纤维或纳米纤维是非纺织的。
10.权利要求4的方法，其中所述粘附材料包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖、或者植物海绵中的一种或多种。
11.权利要求10的方法，其中所述纤维素是醋酸纤维素。
12.权利要求10的方法，其中所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或者层粘连蛋白中的一种或多种。
13.权利要求9的方法，其中所述粘附材料是带静电电荷的。
14.权利要求9的方法，其中所述粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
15.权利要求1的方法，其中所述解离剂是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、I型胶原蛋白酶、2型胶原蛋白酶、3型胶原蛋白酶、4型胶原蛋白酶、分散酶、或其组八口 ο
16.权利要求15的方法，其中所述胰蛋白酶是重组胰蛋白酶。
17.权利要求1的方法，其中所述细胞是人细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述人细胞是粘附细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述粘附细胞是粘附基质细胞。
20.权利要求19的方法，其中粘附基质细胞的来源是胎盘、脂肪组织或者骨髓。
21.权利要求20的方法，其中所述粘附基质细胞的来源是胎盘。
22.权利要求21的方法，其中所述粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
23.权利要求1的方法,其中所述粘附材料通过基本线性往复运动来振动。
24.权利要求23的方法，其中所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和3~6Hz的频率。
25.权利要求24的方法，其中所述往复运动的持续时间为大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟、或者20分钟。
26.权利要求25的方法，其中往复运动的频率为大约5Hz，并且持续时间为大约30秒或更少。
27.权利要求25的方法，其中所述振幅为大约25mm。
28.权利要求1的方法，其中收获的细胞特征在于如下一或多个特征:至少50%细胞存活率；b)至少50%收获效率；c)低于或等于0.5的活力指数；或者d)异质细胞群。
29.组合物，其包含通过权利要求1-28的任一的方法所收获的细胞。
30.在生物反应器中的三维基质中接种细胞的方法，包括: a)提供在生物反应器的容器内在液体中的三维基质； b)将包含细胞的组合物导入容器中； c)将所述基质以足以使细胞混合至遍及基质的频率和振幅振动一段时间；以及 d)中断振动以使得细胞附着于基质。
31.权利要求30的方法，其中所述液体是生长培养基。
32.权利要求31的方法，进一步包括通过以足以使生长培养基混合至遍及基质的频率和振幅来给基质施加一段时间的间断振动，以使细胞在生物反应器中生长。
33.权利要求30或 32的方法，其中所述三维基质被封装在生物反应器内的填充床中。
34.权利要求33的方法，其中所述三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维、或者其组合。
35.权利要求34的方法，其中所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。
36.权利要求34的方法，其中所述珠是光滑的或有孔的。
37.权利要求30或32的方法，其中所述三维基质包含粘附材料。
38.权利要求37的方法，其中所述粘附材料包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖、或者植物海绵中的一种或多种。
39.权利要求38的方法，其中所述纤维素是醋酸纤维素。
40.权利要求38的方法，其中所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白、或层粘连蛋白中的一种或多种。
41.权利要求37的方法，其中所述粘附材料是带静电电荷的。
42.权利要求37的方法，其中所述粘附材料用胶原蛋白或明胶包被。
43.权利要求30或32的方法，其中所述细胞是人细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述人细胞是粘附细胞。
45.权利要求44的方法，其中所述粘附细胞是粘附基质细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述粘附基质细胞的来源是胎盘、脂肪组织、或骨髓。
47.权利要求46的方法，其中所述粘附基质细胞的来源是胎盘。
48.权利要求47的方法，其中所述粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
49.权利要求30或32的方法，其中所述三维基质通过基本线性往复运动来振动。
50.权利要求49的方法，其中所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和l~3Hz的频率。
51.权利要求50的方法，其中往复运动的持续时间是大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟或者20分钟。
52.权利要求51的方法，其中往复运动的频率是大约1Hz，以及持续时间是大约30秒或更少。
53.权利要求52的方法，其中所述振幅是大约25mm。
54.装置，其包含在容器内的粘附材料，及赋予所述粘附材料往复运动的振动器，所述振动器包含一或多个控制器用以调节所述往复运动的振幅和频率，其中所述振动器被配置为以导致附着于粘附材料的细胞与该粘附材料分离的方式振动。
55.权利要求54的装置，其中所述粘附材料是二维基质或三维基质。
56.权利要求55的装置，其中所述粘附材料是三维基质。
57.权利要求55的装置，其中所述装置是生物反应器。
58.权利要求57的装置，其中所述生物反应器是活塞流生物反应器、连续搅拌罐生物反应器、固定床生物反应器、气升式生物反应器，或者细胞接种灌注器。
59.权利要求58的装置，其中生物反应器是包含填充床三维基质的活塞流生物反应器，并且所述往复运动设备包含基本包封所述填充床的筐。
60.权利要求56的装置，其中所述三维基质包含单件支架、多个珠、多个载体、微纤维、纳米纤维、或者其组合。
61.权利要求60的装置，其中所述微纤维或纳米纤维是纺织或非纺织的。
62.权利要求60的装置，其中所述珠是光滑的或有孔的。
63.权利要求56的装置，其中所述三维基质包含聚酯、聚丙烯、聚亚烷基、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯树脂、聚苯乙烯、聚砜、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙酯、纤维素、玻璃纤维、陶瓷颗粒、基质胶、胞外基质成分、胶原蛋白、聚L乳酸、葡聚糖、惰性金属纤维、硅石、泡碱玻璃、硼硅酸盐玻璃、壳聚糖、或者植物海绵中的一种或多种。
64.权利要求63的装置，其中所述纤维素是醋酸纤维素。
65.权利要求63的装置，其中所述胞外基质成分是纤连蛋白、玻连蛋白、软骨粘连蛋白或层粘连蛋白中的一种或多种。
66.权利要求56的装置，其中所述三维基质是带静电电荷的。
67.权利要求56的装置，其中所述三维基质用胶原蛋白或明胶包被。
68.权利要求54的装置，进一步包含细胞。
69.权利要求68的方法，其中所述细胞是人细胞。
70.权利要求68的方法，其中所述人细胞是粘附细胞。
71.权利要求70的方法，其中所述粘附细胞是粘附基质细胞。
72.权利要求71的方法，其中所述粘附基质细胞的来源是胎盘、脂肪组织、或者骨髓。
73.权利要求72的方法，其中所述粘附基质细胞的来源是胎盘。
74.权利要求73的方法，其中所述粘附基质细胞得自胎盘的胎儿或母体部分或者这二者。
75.权利要求54的装置，其中所述振动器赋予所述粘附材料基本线性往复运动。
76.权利要求75的装置，其中所述往复运动具有大约IOmm-大约750mm的振幅，和l~6Hz的频率。
77.权利要求76的装置，其中所述往复运动的持续时间为大约I秒、15秒、30秒、I分钟、2分钟、5分钟、10分钟或者20分钟。
78.权利要求77的装置，其中所述往复运动的频率是大约5Hz，以及持续时间为大约30秒或更少。
79.权利要求77的装置，其中所述往复运动的频率为大约1Hz。
80.权利要求76的装置，其中所述振幅为大约25_。
81.权利要求23的方法，其中所述基本线性往复运动的振幅是含有粘附材料的筐的高度的15-100%的距离。
82.权利要求49的方法，其中所述基本线性往复运动的振幅是含有粘附材料的筐的高度的15-100% 的距离。
【文档编号】C12N5/077GK103476924SQ201280018602
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年4月15日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】H·库索托, N·德罗里-卡米, B·佐哈尔 申请人:普拉里斯坦有限公司