专利名称：：一种逆转录-多重连接探针扩增技术检测rna-snp的方法
技术领域：
：本发明涉及一种逆转录-多重连接探针扩增技术检测RNASNP的方法，特别是涉及到一种利用逆转录-多重荧光探针扩增技术检测孕妇母体血浆中胎儿RNA-SNP的方法。本方法通过提取母体血浆中胎儿游离核酸对其中的RNA-SNP进行检测，可用于检测一类孕期中特异表达于胎盘的基因。
背景技术：
：多重连接探针扩增技术(MultiplexLigation-d印endentProbeAmplification,MLPA)是一种将探针杂交技术、核酸连接技术、PCR扩增技术和荧光标记技术相结合并可相对定量的方法，具有特异性好、灵敏度高、高通量和可自动化分析的特,€。2002$，SchoutenJP^A(SchoutenJP,McElgunnCJ,WaaijerR,ZwijnenburgD,etal.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexligation-dependentprobeamplification.NucleicAcidsRes2002；30(12):e57)对此方法首次进行了描述。逆转录-多重荧光探针扩增技术(ReverseTranscriptase-MLPA，RT-MLPA)是在MLPA技术上发展起来的，其原理是将制备的长型探针和短型探针同逆转录合成的目的基因cDNA序列杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端能够通过连接酶连接成一条片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接。所有被连接而成的片段其序列都有共同的5’和3’末端，因此可以仅仅用一对引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列。由于长型探针中间有填充序列，因此每组RT-MLPA探针可以扩增出特定片段大小的一段序列，通过毛细管电泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。2000年，Poon等人(PoonLL,LeungTN,LauTK,LoYM.PresenceoffetalRNAinmaternalplasma.ClinChem2000；46(11):1832-1834)发现了母血菜中存在胎儿游离_亥@|。2009$，Heung^A(MacyM.S.Heung,ShengnanJin,NancyB.Y.Tsui,ChunmingDing,etal.Placenta-DerivedFetalSpecificmRNAIsMoreReadilyDetectableinMaternalPlasmathaninWholeBlood.PLoSOne.2009；4(6):e5858)发现存在于孕妇血浆中的胎儿游离核酸比全血中的更稳定，且随着孕周期数的增加表达量增多，随着胎儿的娩出后M小时而消失。目前认为孕妇母体血浆中的胎儿游离核酸之所以能稳定存在可能是由于合体滋养层微颗粒的保护而避免了血浆中RNA酶的消化作用，同时研究也发现胎盘是胎儿游离核酸的主要来源，并且来源于胎盘的RNA容易被检测到。孕妇母体血浆中的一些胎儿游离RNA同性别无关，且母亲自身无表达，如位于21号染色体上胎盘特异表达的PLAC4基因，位于17号染色体上的绒毛膜生长催乳激素CSHl和绒毛膜生长催乳样激素CSHLl等。这些发现为检测胎儿游离核酸中的基因mRNA序列上的单核苷酸多态性(RNA-SNP)提供了科学依据。目前尚无利用RT-MLPA方法检测胎儿游离核酸中的RNA-SNP的报道，本发明人在RT-MLPA技术的基础上，结合毛细管电泳技术通过提取母体血浆中胎儿游离核酸进行RNA-SNP相对定量检测，凡是孕期中特异表达于胎盘的基因均可以利用本发明方法进行检测。
发明内容本发明的目的是提供一种逆转录多重连接探针扩增技术检测RNA-SNP的方法，通过提取母体血浆中胎儿游离核酸对RNA-SNP进行相对定量检测。本方法包括四个步骤1)选择RNA-SNP位点，并设计合成相应的引物探针，配制反应体系；2)提取孕妇母体血浆中胎儿游离核酸并逆转录为cDNA；3)将cDNA进行杂交、连接及PCR扩增反应；4)PCR得到的扩增产物在遗传分析仪上进行毛细管电泳，反应结束后进行数据分析。本发明的个优选实施方案是利用NCBI的SNP数据库筛选出mRNA序列中靠近5’端且杂交率相对较高的RNA-SNP位点。本发明的一个优选实施方案是设计的引物包括一组逆转录引物和一对共用的MLPA-PCR引物。因为所有被连接后的片段具有共同的5’端和3’端，因此可以共用对MLPA-PCR引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列，其MLPA-PCR弓丨物的上下游引物序列分别为5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，(SEQIDNO1)和5’-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’(SEQIDNO2),且下游引物的5’端用FAM荧光素标记，组逆转录引物可以按照引物的一般设计原则进行设计。本发明的一个优选实施方案是设计的探针由包含RNA-SNP位点的几组或几十组探针组成，且每组探针包括两条短探针和一条共用的长探针，可以按照探针的一般设计原则进行设计。所有的短探针均具有相同的5’端，所有的长探针均具有相同的3’端且长探针的5’端均进行磷酸化处理。本发明的一个优选实施方案是利用Trizol预处理、市售的RNA提取试剂(如Qiagen生产的RNeasyminikit)进行提取、再用DNase处理的方法从孕妇母体血浆中提取胎儿游离核酸，由于取材使用孕妇母体血浆，避免传统的胎儿取材方法，避免了可能存在的由于侵袭性取材导致流产的风险。本发明的一个优选实施方案是反应体系包括逆转录反应体系、杂交反应体系、连接反应体系和PCR扩增反应体系。本发明的一个优选实施方案是逆转录反应体系包括RNA样本、逆转录引物混合液、MMLV-逆转录酶和逆转录反应液。其中RNA样本的工作浓度范围为15-500ng/ul，优选范围为50-250ng/ul；逆转录引物工作浓度范围为0.1μM-10.0μM，优选范围为0.1μΜ-2μΜ;逆转录酶和反应液可采用市售产品，如invitrogen公司生产的SuperScriptIIIRT和IOXRTbuffer0本发明的一个优选实施方案将样本和逆转录引物混合液冰上混勻后65°C加热5min，立刻置冰上至少lmin。然后按相应产品说明书的要求加入逆转录酶和反应液的混合液，50°C孵育50min，85°C加热5min，终止反应后37°C孵育20min。逆转录反应总体积为5ul。本发明的一个优选实施方案是杂交反应体系包括杂交液和探针混合液。其中探针混合液中探针工作浓度范围为0.OlfM-lOOfM，优选范围为0.IfM-IOfM,杂交液的配制如下1.5MKCl,300mMTris-HCl(pH8.5)，ImMEDTA。杂交反应体系体积为!3ul，加入5ul逆转录反应产物进行杂交反应。本发明的一个优选实施方案是杂交反应的条件为95°C加热lmin，随即放入58°C水浴锅中杂交16小时。本发明的一个优选实施方案是连接反应体系包括TaqDNAligasebuffer和TaqDNA连接酶，可采用市售产品，如NEB公司产品。连接反应体系体积为32ul，加入8ul杂交反应产物进行连接反应。本发明的一个优选实施方案是连接反应的条件为孵育15min，95°C加热5min。本发明的一个优选实施方案是PCR扩增反应体系包括PCRbuffer,25mMdATP，25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP的混合液，MLPA-PCR上下游引物和热启动Taq酶。其中MLPA-PCR上下游引物工作浓度范围为0.1μΜ-10.0μΜ,优选范围为0.1μΜ_2μΜ,热启动Taq酶和buffer可采用市售产品，如QIAGEN公司产品。PCR扩增反应体系为40ul，加入连接反应产物IOul进行PCR扩增反应。本发明的一个优选实施方案是PCR扩增反应的条件为95°C热启动15-30min，94°C变性30-60s，6(TC退火30_60s，72°C延伸30_90s，按此条件进行30-40个循环，最后60°C延伸20-50min，4°C保存。优选反应条件为95°C热启动15min，94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，进行32个循环，最后60°C延伸45min，4°C保存。本发明的一个优选实施方案是反应所扩增出的目的片段大小在90_500bp之间，且在同一个反应中可以扩增出不同目的基因序列，同时检测多个RNA-SNP位点。本发明的一个优选实施方案是扩增产物与市售的Marker溶液(如ABI公司生产的Hi-DiTMformamide和GeneScanR0X-500Sizestandard)按比例混合后，95°C变性5min，立刻置冰上至少1分钟。取适量变性混合物上样，采用市售的遗传分析仪进行片段分析。本发明的一个优选实施方案是通过对扩增产物进行各位点不同的等位基因片段大小和数目的检测，分析累计产物发出的荧光量来检测靶多核苷酸的存在和相对量，用同一杂合位点处两个片段对应的峰面积的比值结合临床资料综合分析检测结果。—类特异表达于胎盘的基因均可以利用本发明方法进行检测，这类基因均具有随着孕周期数的增加表达量增多且随着胎儿娩出后M小时而消失的特点，如PLAC4基因、绒毛膜生长催乳激素CSHl基因、绒毛膜生长催乳样激素CSHLl基因。利用本发明方法进行RNA-SNP检测，为SNP的检测提供了一种新方法，拓宽了SNP检测的检测范围。图1显示探针的组成成分。图中1表示共用的上游引物，2表示短探针的填充序列，3表示短探针A的目的基因组序列，4表示B中不同于A的目的基因组序列，5表示长探针的目的基因组序列，6表示长探针的填充序列，7表示共用的下游引物和表示SNP等位基因。图2显示染色体核型分析结果为正常的样本RT-MLPA检测，GenemapperV3.0分析结果。图中蓝色标记的两组片段即为检测到的两个杂合RNA-SNP位点对应的片段，每个杂合SNP位点对应的两个片段的峰面积比值接近于11。图3显示检测到的杂合SNP位点的测序验证结果。图中T/C箭头所指的方向即为检测到的杂合SNP位点。图4显示依次为空白、21三体核型分析正常和核型分析异常的三个样本RT-MLPA毛细管电泳结果。图中空白样本没有扩增片段；核型分析正常的样本检测到2个杂合RNA-SNP位点且每个杂合位点对应的两个片段的峰面积比值等于或接近11;核型分析异常的样本检测到3个杂合RNA-SNP位点且每个杂合位点处长片段与短片段所对应的峰面积比值等于或接近21。图5显示依次为空白，CSHLl-rs2M6207检测为纯合子，CSHLl-rs2246207检测为杂合子，的三个样本RT-MLPA毛细管电泳结果。图中空白样本没有扩增片段；CSHLl-rs2246207检测为纯合子的样本为单一片段，CSHLl-rs2246207检测为杂合子的样本杂合位点对应的两个片段的峰面积比值等于或接近11。具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1RT-MLPA检测位于21号染色体上特异表达于胎盘的PLAC4基因的RNA-SNP位点1.IRNA-SNP位点的选择及设计参考NCBI-SNP数据库中PLAC4基因的信息，选择rs8130833、rsll909439、rs59895715、rsl6998089和rs9977003五个位点，按照附图1中所示设计要求设计包含所选SNP位点的五组探针序列如下rs8130833位点(5，_3，)短探针GTGCCAGCMGATCCMTCTAGACMCACCATTTGGGTTMATACMGTTAGAT(SEQIDNO3)GTGCCAGCMGATCCMTCTAGATATTGCMCACCATTTGGGTTAMTACMGTTAGAC(SEQIDNO4)长探针GACGAATATATCTGGCCTAAACATGGTTCTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO5)rsll909439位点(5，3，)短探针GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGATGGGAATAGGAGCATTG(SEQIDNO6)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAGCTGTAGATGGGAATAGGAGCATTA(SEQIDNO7)长探针ATCTTGCTCTTCTTCCTGACTGTAGTACTTCATCAATATGTACATCTTAGTAATGATCAATTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO8)rs59895715位点(5，_3，)短探针GTGCCAGCMGATCCMTCTAGACAGTGAGTAGAMAGAGAGATGTMAGMT(SEQIDNO9)GTGCCAGCMGATCCMTCTAGATGMCCAGTGAGTAGAAMGAGAGATGTAMGMC(SEQIDNO:10)长探针ATTATGAATAGAAAATGTATTTTTTGTTTGTTTTGCAAGGAAGGATATAAAGAAAGAGTAATTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO11)rsl6998089位点(5，_3，)短探针GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGACCTGTAAGCAGGGAAGCAC(SEQIDNO:12)6GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAATTGCCTGTAAGCAGGGAAGCAT(SEQIDNO:13)长探针AATGTTTTCACATTCTTTGTAAGTCATATGTTCTACTAGAATCTAACTTCAGAACATGATCTTACAAGTAATGAAGAAGTTGATGTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO:14)rs9977003位点(5，_3，)短探针GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGATTGATATTTACACCTTGTGGCCCT(SEQIDNO:15)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGATTTTCTTGATATTTACACCTTGTGGCCCC(SEQIDNO:16)长探针GTGATAGACTGGAAATCTCAAACAACAACTATAGAAAGATTCTTACATTCATGATTCAAGAATGATACTAGAACAAGAACTAACTATACTTATCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO:17)1.2标本采集、处理及胎儿游离核酸的抽提收集40例经染色体核型分析正常和10例经染色体核型分析为21三体阳性的9-18孕周孕妇的外周血5-10ml，采用EDTA抗凝。将收集到的外周血4°C预冷10-30min后，4000rpm4°C离心lOmin，将上层血浆小心转移至1_2个灭菌的2.Oml的离心管中。收集到的血浆应立即提取游离RNA或加入RNA稳定剂存放至-80°C以备日后提取。胎儿游离RNA的提取步骤如下1)在1.6ml的母体血浆中加入2ml的Trizol(Invitrogen生产)和0.4ml氯仿混勻后静置3分钟，14000rpm4°C离心15min,小心将上层液体移至新的灭菌离心管中；2)在新的离心管中加入等体积的70%乙醇，混勻后将液体移至RNeasyminicolumn(RNeasyminikit,Qiagen生产)，随后的操作根据产品说明书完成。最后RNA用30μ1DEPC-H2O洗脱，储存于-80°C。3)提取到的RNA使用前用DNase(RNase-FreeDNasekt，Qiagen生产)处理以消除残留的DNA。1.3RT-MLPA将2μ1RNA样本和1.5μ1逆转录引物混合液冰上混勻后65°C加热5min，立刻置冰上至少lmin。然后加入1.5ulSuperScriptIIIRT和10XRTbuffer的混合液，50°C孵育50min，85°C加热5min，终止反应后37°C孵育20min.将1.5μ1杂交液和1.5μ1探针混合液加入到逆转录合成的cDNA的管中，混勻后95°C加热lmin，随即放入58°C水浴锅中杂交16小时。将16小时后的杂交产物中加入TaqDNAligasebuffer(含IUTaqDNA连接酶，NEB公司)至反应体系为40μ1，然后孵育15min，95°C加热5min终止反应。取上述10μ1连接产物加到50μ1总反应体积中进行PCR扩增。每个反应中还包括PCRbuffeHQIAGEN公司)，25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP，20nMMLPA-PCR上下游引物(上下游引物序列分别为5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5‘-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3‘)和HotStarTaqDNAPolymerase(QIAGEN公司)。反应条件95°C热启动15min，94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，此条件共进行32个循环，最后60°C延伸45min，4°C保存。1.4ABIPRISM3100片段分析取扩增产物Ιμ，加入13·5μ1Hi_Diformamide和0.5ulGeneScanR0X-500Sizestandard(ABI公司)混合后，95°C变性5min，立刻置冰上至少1分钟。取10μ1变性混合物上样ABIPRISM3100遗传分析仪(PEAppliedBiosystems生产)进行片段分析。反应结束后用GenemapperV3.0软件进行数据分析。1.5结果分析胎儿染色体核型分析为正常的40例样本用上述方法进行检测，每个样本均检测两次，每个样本中至少有1个杂合SNP位点，且每个杂合SNP位点中两个片段对应的峰面积比值均等于或接近11(见附图幻。对40例样本中检测到的杂合SNP位点进行测序验证，结果均正确(见附图幻。胎儿染色体核型分析异常的10例样本进行检测，结果与染色体核型分析结果完全相符。每个杂合SNP位点处长片段与短片段所对应的峰面积比值等于或接近21(见附图4)。实施例2RT-MLPA检测位于17号染色体上特异表达于胎盘的CSHLl基因(绒毛膜生长催乳样激素基因)的RNA-SNP位点1.IRNA-SNP位点的选择及设计参考NCBI-SNP数据库中CSHLl基因的信息，选择rs2M6207位点，按照附图1中所示设计要求设计包含所选SNP位点的一组探针序列如下rs2246207位点(5，_3，)短探针GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGACTTTAGGAGGTGATAGTCATCA(SEQIDNO:18)GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGAAGGTCCTTTAGGAGGTGATAGTCATCG(SEQIDNO:19)长探针ACTGTGTATGACACCTCGGACAGATAATCTGTGTTCCAACCCTTAGGGAACCC(SEQIDNO20)1.2标本采集、处理及胎儿游离核酸的抽提收集40例经染色体核型分析正常的9-18孕周孕妇的外周血5_10ml，采用EDTA抗凝。将收集到的外周血4°C预冷10-30min后，4000rpm4°C离心lOmin，将上层血浆小心转移至1-2个灭菌的2.Oml的离心管中。收集到的血浆应立即提取游离RNA或加入RNA稳定剂存放至-80°C以备日后提取。胎儿游离RNA的提取步骤如下1)在1.6ml的母体血浆中加入2ml的Trizol(Invitrogen生产)和0.4ml氯仿混勻后静置3分钟，14000rpm4°C离心15min,小心将上层液体移至新的灭菌离心管中；幻在新的离心管中加入等体积的70%乙醇，混勻后将液体移至RNeasyminicolumn(RNeasyminikit,Qiagen生产)，随后的操作根据产品说明书完成。最后RNA用30μ1DEPC-H2O洗脱，储存于-80°C。3)提取到的RNA使用前用DNase(RNase-FreeDNasekt，Qiagen生产)处理以消除残留的DNA。1.3RT-MLPA将2μ1RNA样本和1.5μ1逆转录引物混合液冰上混勻后65°C加热5min，立刻置冰上至少lmin。然后加入1.5ulSupei^criptIIIRT和10XRTbuffer的混合液，50°C孵育50min，85°C加热5min，终止反应后37°C孵育20min.将1.5μ1杂交液和1.5μ1探针混合液加入到逆转录合成的cDNA的管中，混勻后95°C加热lmin，随即放入58°C水浴锅中杂交16小时。将16小时后的杂交产物中加入TaqDNAligasebuffer(含IUTaqDNA连接酶，NEB公司)至反应体系为40μ1，然后孵育15min，95°C加热5min终止反应。取上述10μ1连接产物加到50μ1总反应体积中进行PCR扩增。每个反应中还包括PCRbuffeHQIAGEN公司)，25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP，20nM8MLPA-PCR上下游引物(上下游引物序列分别为5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5‘-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3‘)和HotStarTaqDNAPolymerase(QIAGEN公司)。反应条件95°C热启动15min，94°C变性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，此条件共进行32个循环，最后60°C延伸45min，4°C保存。1.4ABIPRISM3100片段分析取扩增产物Ιμ，加入13·5μ1Hi_Diformamide和0.5ulGeneScanR0X-500Sizestandard(ABI公司)混合后，95°C变性5min，立刻置冰上至少1分钟。取10μ1变性混合物上样ABIPRISM3100遗传分析仪(PEAppliedBiosystems生产)进行片段分析。反应结束后用GenemapperV3.0软件进行数据分析。1.5结果分析胎儿染色体核型分析为正常的40例样本用上述方法进行检测，每个样本均检测两次，共有23例样本检测到该杂合SNP位点，且每个杂合SNP位点中两个片段对应的峰面积比值均等于或接近11(见附图幻。对23例样本中检测到的杂合SNP位点进行测序验证，结果均正确。权利要求1.一种逆转录一多重连接探针扩增技术检测RNA-SNP的方法，其特征在于该方法包括四个步骤1)选择RNA-SNP位点，并设计合成相应的引物探针，配制反应体系；2)提取孕妇母体血浆中胎儿游离核酸并逆转录为cDNA；3)将cDNA进行杂交、连接及PCR扩增反应；4)PCR得到的扩增产物在遗传分析仪上进行毛细管电泳，反应结束后进行数据分析。2.根据权利要求1的方法，其特征还在于设计的引物包括一组逆转录引物和一对共用的MLPA-PCR引物。3.根据权利要求1的方法，其特征还在于MLPA-PCR引物的上下游引物序列分别为5，-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3，和5，-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3，，且下游引物的5，端用FAM荧光素标记。4.根据权利要求1的方法，其特征还在于设计的探针由包含RNA-SNP位点的几组或几十组探针组成，且每组探针包括两条短探针和一条共用的长探针，所有的短探针均具有相同的5’端，所有的长探针均具有相同的3’端且长探针的5’端均进行磷酸化处理。5.根据权利要求1的方法，其特征还在于反应体系包括逆转录反应体系、杂交反应体系、连接反应体系和PCR扩增反应体系。6.根据权利要求1的方法，其特征还在于逆转录反应体系中RNA样本的工作浓度范围为50-250ng/ul，逆转录引物工作浓度范围为0.1μM-2μM。7.根据权利要求1的方法，其特征还在于杂交反应体系包括杂交液和探针混合液，其中探针混合液的探针工作浓度范围为0.IfM-IOfM,杂交液为1.5ΜKCl，300mMTris-HCl(ρΗ8·5)，ImMEDTA08.根据权利要求1的方法，其特征还在于PCR扩增反应体系包括PCRbuffer,25mMdATP,25mMdGTP,25mMdCTP,50mMdUTP的混合液，MLPA-PCR上下游引物和热启动Taq酶。9.根据权利要求1的方法，其特征还在于PCR扩增反应体系中MLPA-PCR上下游引物工作浓度范围为0.1μΜ-2μMo全文摘要本发明涉及一种逆转录-多重连接探针扩增技术检测RNA-SNP的方法，特别是涉及到一种利用逆转录-多重荧光探针扩增技术检测孕妇母体血浆中胎儿RNA-SNP的方法。本发明方法包括四个步骤，通过提取母体血浆中胎儿游离核酸对RNA-SNP进行相对定量检测，可以用于检测一类特异表达于胎盘的基因，也为SNP的检测提供了一种新方法，拓宽了SNP检测的检测范围。文档编号C12Q1/68GK102140497SQ20101010458公开日2011年8月3日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者李明,邓艳华,陈华云申请人:中山大学达安基因股份有限公司